İnsan Nötrofil türetilmiş Dev Fagositler bir Roman ICSI&#39;nin Gelişimi ve Kimlik<em&gt; İn Vitro</em

Özet

Biz burada elde edilmesi ve nötrofil kaynaklı dev fagositler bir yeni özelliği alt popülasyonunu belirlemek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu hücreler taze insan kan nötrofillerinin kültüre geliştirmek ve fagositoz, Otofaji, gayet büyük bir boyut ve uzun ömrü ile karakterize edilir. Bu yöntem ayrıca, bu benzersiz nötrofil türevi alt popülasyonu araştırılması gereklidir.

Özet

Nötrofiller (PMN) en iyi patojenleri ve mikroorganizmalar işgal karşı fagositik fonksiyonları için bilinir. Lökosit arasında ve temel olarak apoptoza kararlı bunların aktif olmayan halde kısa yarı ömre sahiptir. inflamasyonu gidermek için inflamatuar sitelere işe, onlar güçlü antimikrobiyal öldürülmesiyle sitotoksik moleküllerin bir dizi üretir. bu güçlü sitotoksik moleküller kontrolsüz bir şekilde serbest bırakıldığında Oysa onlar çevre dokulara zarar verebilir. Ancak son yıllarda, nötrofil çok yönlülük giderek plastisite ve bağışıklık fonksiyonlarını göstererek, kanıtlanmıştır. Son zamanlarda, granülosit koloni uyarıcı faktör (GM-CSF) gibi sitokinler / büyüme faktörlerinin ilavesi olmaksızın standart kültür koşulları kendiliğinden gelişen yeni nötrofil türevi alt popülasyonunu / interlökin (IL) -4 belirledik. nötrofil kalıntıları Onların fagositik yetenekleri büyük ölçüde onların artmasına katkıdagayet boyutu; bu yüzden adlandırılan edildi dev fagositler (Gφ). nötrofil aksine, Gφ uzun kültüründe yaşanır. Onlar farklılaşma (CD) nötrofil belirteçlerinin CD66b / CD63 / CD15 / CD11b / myeloperoksidaz (MPO) / nötrofil elastaz (NE) küme ifade ve / CD16 / CD163 ve dendritik CD1c / CD141 belirteçleri monositik soy belirteçler CD14 yoksun olan . Onlar da lateks ve zymosan-up almak ve opsonize-zimosan ve PMA ile uyarılmaya oksidatif patlama ile yanıt verir. Gφ da çöpçü CD68 / CD36 reseptörleri ifade ve nötrofiller aksine, okside düşük dansiteli lipoprotein (oxLDL'nin) içselleştirmek. Ayrıca, taze nötrofil ya da kültürlenmiş monositler farklı olarak, daha yüksek bir reaktif oksijen türleri (ROS) üretimi ile oxLDL'nin alımına yanıt. Buna ek olarak, bu fagositler Otofaji aktivasyonunu gösteren mikrotübüle bağlı protein-1 hafif zincir 3B (LC3B) kaplanmış hücre arası boşluklar içerir. Belirli inhibitörleri kullanarak, fagositoz ve Otofaji hem Ön şartlar olduğu açıktırbağımlı ROS oksidaz gelişimleri ve olası NADPH için tes. Burada kültürde uzun ömürlü, nötrofil türevi fagositik hücreler, bunların belirlenmesi ve şu an için bilinen özellikleri, bu yeni alt populasyonun hazırlanması için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol, elde edilmesi ve daha da önem ve fonksiyonlarını incelemek amacıyla Gφ karakterize etmek için gereklidir.

Giriş

Polimorfonükleer nötrofiller (PMN) sitotoksik moleküllerin geniş bir yelpazede üreterek patojenlerin istila karşı ilk savunma hattı olarak hizmet veren, kandaki lökositlerin büyük nüfus oluşturmaktadır. Geleneksel görünümü uzun patojenlerin ve zararlı partiküllerin temizlenmesinde enfeksiyonları ve yardım mücadelede akut inflamatuar sitelere gelmesi ilk olan dolaşımdaki kan, kısa ömürlü profesyonel fagositler, o olmuştur. ¹ onların aktif olmayan durumda, nötrofiller apoptozise yapısal kararlıyız. inflamatuar sitelere kandan geçirirken, nötrofiller inflamasyonu gidermek için aktivasyona maruz. Bunlar fagosite ve nötrofil elastaz (NE) ve güçlü bir mikrobisid aktivitesine sahip katepsinler sitotoksik moleküller olarak reaktif oksijen türleri (ROS), litik enzimler, bir dizi üreterek, saldırıcı mikroorganizmalara öldürür. tuzak patojenlere amacıyla, nötrofiller de hücre dışı tuzakları (NET'leri serbest) Antibakteriyel peptidler ve çeşitli litik enzimler içeren nükleer kromatin ipliklerinin oluşur hangi. Bununla birlikte, nötrofillerden bu sitotoksik moleküller kontrolsuz şekilde açığa çıkışı aynı zamanda inflamatuar yanıtları sürdüren ve çevredeki dokulara zarar neden olabilir. ² Bu nedenle, bir makrofaj tarafından apoptotik nötrofillerin etkili bir boşluk (Mφ) ve dendritik hücreler (DC), iltihap çözmek için çok önemlidir. ^{3, 4, 5, 6}

Ancak son yıllarda, nötrofiller yüksek olan fonksiyonları çok fagositoz ve patojen öldürme ötesine yönlü hücreler olduğu giderek daha belirgin hale gelmiştir. Emişli veya aktivasyon geçiren tarafından ^{6, 7,} nötrofil plastisite kademeli olarak dikkat kazanıyor. Örneğin, bakteriler ve mikobakteriler meydan nötrofiller gösterildiimmüno-düzenleyici tepkilerinin varlığını düşündürmektedir, interlökin (IL) -10 salgılaması ve enflamatuvar cevabı kontrol eder. ⁸ Mitotik sonrası nötrofiller Mφ benzeri hücrelerin ya da sindirim ve böylece sitokinlerin ve büyüme faktörleri, ^{9, 10} ile işlendiğinde antijen fragmanları sunulması, doğal ve kazanılmış entegre bir rol hizmet DC-benzeri hücrelere-ayırt trans gösterildi tepkiler. ^3, büyüme faktörleri ⁶ aktivasyonu iltihabik bölgelerde döküntüye ilişkin temizliğe ve inflamasyon çözünürlük, ^{3, 9} Mφ / DC onay sistemi ^11, yetersiz ya da ezilmiş, ^{özellikle, 12} kolaylaştırmak ve böylece apoptotik nötrofil veya hücre artıkları, yutulmasına teşvik potansiyel 'öz-düzenleme' öne yeniden yardımcı olmak içinenflamatuvar yanıtı çözer. Bu, apoptoz yana sitotoksik bileşikler hücre dışı salınmasını inhibe edebilirler ve böylece çevre dokulara hasarı önleyebilirler düzenlenmiş kendini ölüm şeklidir. ⁶

Uzun süreli hayatta kalma nötrofil aktivasyonu başka bir özelliğidir ve granülosit koloni uyarıcı faktör (G-CSF), granülosit-makrofaj koloni stimüle edici faktör (GM-CSF), interferon gibi enflamatuar sitokinlerin (çeşitli ev sahibi türevli faktör ile muamele ile gösterilmiştir IFN) -γ, tümör nekroz faktörü (TNF) -α ve / veya patojen kaynaklı ürünlerin, bu şekilde, nötrofil hayatta kalma yanıtını modüle izin verir. ⁶ Aslında, nötrofil hayatta kalma onun plastisite için bir ön koşuldur ve fagositozu gerçekleştirmek için yeteneği ile ilişkili bulunmuştur. ^{6, 13} duruma göre aynı zamanda bağımlılığındaki fenotipik ve işlevsel değişiklikler ile ilişkilendirmek gösterilmiştirnötrofil ömrü uzantısında yer alan yeni bir protein sentezi uyararak upregüle gen ekspresyonu ve azalmış apoptoz DED verisi. ¹⁰

kısa ömürlü ve temel olarak kültür apoptosise maruz veya ömrü uzatılmış yukarıda belirtilen sitokinlerin / büyüme faktörleri-aktive edilmiş nötrofiller, nötrofiller farklı olarak, kısa bir süre önce, uzun süreli, standart kültür kendiliğinden gelişen nötrofil yeni, küçük alt belirledik harici olarak sitokinler ya da büyüme faktörleri eklemeden taze izole edilmiş insan kanı nötrofillerden koşulları. ¹⁴ literatürde daha önce tarif edilmemiştir Bu nötrofil türetilmiş hücreler, olarak adlandırılmıştır dev fagositler (Gφ). Gφ kültüründe ömrünü artırdık, tam 5-7 gün içinde geliştirilen ve benzersiz morfolojik özellikleri, fenotipik ifadesi ve işlevleri ile karakterizedir. Onlar çok autophago nedeniyle genişlemişboşluklu ölü nötrofil kalıntılarından oluşan cytosis ve ihtiva fagolizozomları. Gφ özel nötrofil granüller işaretleyici ifade - farklılaşma (CD) 66b küme, Azürofilik granüller belirteçler - CD63 ve myeloperoksidaz (MPO) ve CD11b, NE, CD15 gibi ek nötrofiller işaretçileri NADPH oksidaz alt birimleri gp91- pHOx ve p22- pHOx ve otofaji markör -LC3BII. ^{14, 15} işlevsel olarak, aktif lateks boncukları ve zymosan parçacıkları yukarı alır ve zimosan ve forbol 12-miristat 13-asetat (PMA) uyarılara yanıt olarak ROS oluşturur. İlginçtir, taze nötrofiller aksine, Gφ da yoğun çöpçü reseptörleri CD68 ve CD36 ifade çekme, düşük yoğunluklu lipoprotein (oxLDL'nin) okside ve oxLDL ile uyarılmaya karşılık olarak ROT üretirler. Buna ek olarak, Gφ monositik soy belirteçleri CD14, CD16 ve CD163 veya dendritik belirteçler CD1c ve CD141 yoksundur. Ayrıca, PHAgocytosis ve otofaji ve büyük olasılıkla fonksiyonel NADPH oksidaz onların gelişimi için şarttır. Bu fagositoz inhibitörü cytochalsin B beri, otofaji önleyicileri 3-metiladenin (3-MS) ve bafilomisin (BafA1) NADPH oksidaz inhibitörü - difenilen iyodonyum (DPI) - kendi gelişmesini engellemiştir. Ayrıca, sürekli hipoksi nötrofil adaptasyon belirgin monositler / nötrofiller ko-kültürler yanı sıra onların gelişimini engellemiştir aralıklı hipoksi maruz kalma, iken. ^14,15 kültüründe Onların önerilen gelişme mevcut kağıt Şekil 1 hayranlarıyla protokolü gösterilmiştir adım adım gelen Gφ hazırlanmasını anlatır taze insan kan nötrofil, onların gelişimini, kimlik ve bazı temel özelliklerini dolaşan izole edilmiştir. Bu protokol daha fazla araştırmak ve geniş spektrumlu ortaya çıkarmak için kullanılabilir ve rolleri bu yeni tanımlanmış ve ilginç nötrofil kaynaklı sırayla Gφ characteriz içinönemlerini ve potansiyel fonksiyonları e.

Şekil 1: 7 Gün Nötrofil Kültürlerde Dev Hücreler Kalkınma şematik gösterimi. Iltihabik bölgelerde Otofaji mekanizmalarını harekete nükleer artıkları, granüller (yeşil ve kırmızı nokta) ihtiva eden fragmanlar, ve diğer hücre içi bileşenleri (1), nötrofil apoptotik hücre ölümüne maruz, ve (2) serbest bırakma membran çevrilidir önerilmektedir. Fonksiyonel NADPH oxidase.They muhafaza çeşitli nötrofilik CD66b + / CD63 ile karakterize edilir ise (3) Dev fagositler (Gφ), apoptotik kütlelerin oluşumu ve nötrofil artıkları içselleştirme sitokin ya da büyüme faktörleri içermeyen uzun süreli nötrofil kültürlerinde geliştirilmesi + / MPO + / CD15 + / CD11 b + / NE belirteçler, granüller ve hücre artıkları ve çöpçü reseptörleri CD36 ve CD68 çevreleyen büyük fagozomların. Gb1 'dir; Ayrıca çeşitli parçacıkları ve oksitlenmiş LDL interne etme yeteneğine çoğunlukla tek çekirdekli hücreler, ve ROS üretir. Gφ dolum vakuollerde zarları otofaji ve dev fagosit oluşumu arasında sıkı bir ilişki düşündüren, (koyu mavi işaretli) LC3B, autophagosomal zarın bir işaretleyici içerir. Gφ GM-CSF / IL-4 içeren bir ortamda gelişmez. Ayrıca, bu tür NADPH oksidaz inhibitörü inhibitörleri - difenilen iyodonyum (DPI), otofaji inhibitörleri 3-metiladenin (3-MS) ve bafilomycin (BafA1) ve fagositoz önleyicisi sitokalasin B (. Sito b) oluşumunu ortadan kaldırdığını göstermektedir. (4) in vivo Potansiyel Gφ fonksiyonları anti ya da pro-inflamatuar özellikleri ve aterosklerotik süreçlerine katılımı (bu rakam bizim bulgular ^{14, 15} dayanmaktadır ve B beraberindeki Editorial modifiye edilmiş içerebilirErton ^20). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Protokol

protokol Helsinki beyanına göre, yerel İnsan Hakları Komitesi tarafından onaylanmış, ve tüm katılımcılar bilgilendirilmiş onam formu imzalandı.

1. Nötrofil İzolasyon ve Kültür Gφ Gelişimi

Not: Tüm adımlar, bir Bio-Güvenlik laminar akış başlığı içinde steril doku notu Lipopolisakkarid (LPS) içermeyen çözeltiler kullanılarak yapılmalıdır. Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 ortamına antibiyotik, sitokinler veya büyüme faktörleri ilave etmeyin.

1. steril bir kafa derisi ven seti kullanılarak sağlıklı genç erişkinlerde en az 40 ml venöz kan alın. Etilendiamin tetra asetik asit K ₃ tuz içeren vakumlu tüplerinde (K ₃ EDTA) içine kan çizin ve hafifçe karıştırın. Oda sıcaklığında kan tutun.
2. 1.119 ve 1.077 g / ml polisükroz kullanılarak iki aşamalı kesikli yoğunluk gradyanı ile nötrofillerin izole edin. Kullanmadan önce oda sıcaklığına çözümler getirmek.
   Not: Santrifüj sırasında, kırmızı kanhücreleri (eritrositler) hızla polisükroz ve sediman ile toplanır. Nötrofiller polisükroz -1077 / 1.119 arayüzü (bakınız Şekil 2) de, sadece RBCs üstünde bulunur ise mononükleer hücreler (monositler / lenfositler), üst plazma arasında bulunan / -1077 arayüzü polisükroz. Bu yöntem, aynı bireyden alınan mononükleer hücreleri ve nötrofiller eşzamanlı ayrılmasını sağlar.

Şekil 2: İnsan Tüm Kanı nötrofil izolasyonu. Bir 1.077 g polisükroz / ml dikkatli bir şekilde kesintili gradyan meydana getirmek üzere polisükroz-1.119 ug / ml üzerine katmanlı. seyreltilmiş tam kan ardından polisükroz-1.077 üstünde katmanlı. Tüplere hemen freni olmaksızın oda sıcaklığında, 30 dakika boyunca 700 x g'de santrifüje tabi tutulur. Üç ayrı bantlar belirtilmiştir. (A), mononükleer hücreler, (B), polimorfonükleer hücreler (PMN),borunun alt kısmında ve (C), kırmızı kan hücresi (RBC). Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

1. 50 ml'lik steril bir polipropilen konik santrifüj tüpünün tabanına 12 mi polisükroz-1119 ekleyin.
2. Dikkatle polisükroz -1119 üzerine polisükroz-1077 12 ml katman.
3. % 2 ısı ile inaktive edilmiş fetal dana serumu (HI-FCS) ihtiva eden iyon serbest fosfat tamponlu tuzlu su ile 24 ml kan nihai hacme (PBS) 12 mi tam kan - 10 seyreltin. Dikkatle borunun üst gradyanı üzerine seyreltilmiş tam kan 24 ml tabaka.
4. freni olmadan - (24 ° C 20), oda sıcaklığında 30 dakika boyunca 700 x g'de santrifüjleyin.
   Not: daha düşük sıcaklıklarda Santrifüj hücre topaklanma ve zayıf kazanımı ile sonuçlanabilir.
5. Dikkatle santrifüj tüpleri kaldırmak ezelît degrade rahatsız. İki opak tabakalar dikkat edilmelidir (A: mononükleer hücreler ve B PMN, Şekil 2'de gösterilmektedir).
6. Bir tüp "mononükleer" işaretli için aspire bu katmandan katman A. Transferi (ya da ıskarta) Yukarıdaki 0.5 cm hücreleri sıvı yukarı atmak ve.
7. Aspire "PMN" etiketli bir tüpe bu tabakanın hücreleri aktarın katman B yukarıdaki 0.5 cm kalan sıvı yukarı atmak ve.
8. Havuz her biri iki gradyan tüplerden PMN ve PBS ile 30 ml nihai hacme kadar% 2 HI-FCS içeren yıkayın. 200 x g'de 12 dakika boyunca santrifüj süpernatant kaldırmak ve atın.
9. yavaşça 1 ml steril pipet ucu ile ve dışarı çizerek pelet resuspending kırmızı kan hücreleri (RBC) kirletici kurtulmak için, hipotonik% 0.2 buz steril NaCl 3 ml ekleyin. 30 saniye boyunca buz üzerinde tutun.
10. 30 sn sonra tüp steril% 1.6 buz NaCl 3 ml ekleyerek izotonikliğe geri yükleyin.
11. izotonik salin 6 ml için 6 M eklemeÖnceden ısıtılmış (37 ° C) l RPMI-1640 ortamında 12 dakika boyunca 250 x g'de% 2 HI-FCS ve santrifüj ile takviye edilmiştir. süpernatant atın. PMN pelet RBC kontaminasyon temiz olmalıdır.
    NOT: RBC ile kirlenmiş ise, PMN pelet kırmızımsı görünür.
12. Bazı kirletici RBC kalırsa, tekrar 9 ve 10 kez daha yineleyin.
13. % 10 HI-FCS ile takviye edilmiş 4 ml RPMI-1640 hücre pelletini ve tripan mavi dışlama konsantrasyon ve yaşama kabiliyetinin saptanması için hücreleri sayın.
14. 1.25 konsantrasyonu ayarlama - 1.5 x 10 ⁶ PMN / ml (deney gereksinimlerine bağlı olarak) ve 1.0 ml / oyuk, 24 plaka plaka.
    NOT: Mayıs Grunewald-Giemsa boyama ve ışık mikroskopisi ile değerlendirilen granülosit nüfusun nötrofil saflığı her zaman,% 95 aştı.
15. Tohumlamadan sonra, hücrelerin yer 37 ° C'de nemlendirilmiş% 5 _CO2 inkübatör.
16. yavaşça yarısını aspire 3 günde orta değiştirinOrta ve% 10 HI-FCS ile desteklenmiş taze RPMI-1640 ortamında aynı miktarda eklenmesi. HI-FCS kullanın LPS ücretsiz çözümler ve bileşikleri ve düşük LPS düzeyleri (0.05 ng / ml veya daha az).
    NOT: kültüründe geliştirmek Gφ, sıkıca gelişmekte olan hücreleri yıkayın olabilir kültür çanak ve dinç yıkama eklemek yok çünkü nazik orta değişiklik zorunludur. kan bağışında bağlı PMN kültürleme sonra 4 gün - Gφ görünümü 3'te belirgindir. Gφ boyutu çok büyük olduğunda, kültürdeki 7 günden - Burada tarif edilen analiz ve deneylerinin en fazla 6 arasında gerçekleştirilir. RPMI-1640 ortamında 10 ng / ml LPS kültür Gφ gelişimini etkilemedi, 1 - eklenmesi unutulmamalıdır. ¹⁴

2. Konfokal Lazer Tarama Mikroskopi

1. Taze izole nötrofillerden sitos- pinler ¹⁶ hazırlayın ve 7 gün geliştirilen Gφ kültürlerinden(Bölüm 1 hazırlanan).
   NOT: nazikçe, çeşitli analizler için çanak Gφ konsantrasyonunu artırmak orta yarısını çıkarmak için. Gφ ışık mikroskobu altında orta incelenerek kaldırıldı ortamda tespit olmadığından emin olun. Sonra, yoğun hafifçe yapıştırılır Gφ kaldırmak için kalan orta pipetlemeyin. 200 x g'de 10 dakika boyunca ortam santrifüj ve 100 pelletini - 120 ul ortam.
   1. her slayt için hücreleri içeren orta 120 ul - 100 kullanın. Her tedavi yinelenen veya üç slaytlar hazırlayın. 84 x g'de 7 dakika Spin.
2. ip hücreleri kurutun ve bir kimyasal başlık altında, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında% 4 paraformaldehit ile hücrelerin tespit. PBS ile yıkayın 3x (~ yıkama başına bir kaç saniye için 100 ul). hücre içi boyama için, 10 dakika boyunca oda sıcaklığında% 0.5 Triton X-100, PBS içinde hücreleri geçirgenliği ve PBS ile 5x yıkayın.
   NOT: Tüm aşamalarda, uygun tampon / çözüm VOLU kullanınBana slayt hücrelerin çevresini kapsayacak. Hücreler çevresini belirlemek için hidrofobik bir bariyer kalem kullanın.
   Dikkat: Paraformaldehyde toksiktir. Göz ve cilt ile temasından kaçının. Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanın.
3. RPMI-1640 ortamı içinde% 10 normal keçi serumu ile blok hücre ve 4 ° C'de veya 40 dakika süre ile, oda sıcaklığında gece boyunca inkübe edilir. PBS ile yıkayın.
4. 100 seyreltme (~ 100 ul) tek bir antikorun (Ab) ya da bir 1 de fare ve tavşan primer antikorlar (ABS) kombinasyonu ile inkübe edin. 4 ° C'de - (20 saat 18) gece boyunca inkübe edin.
   Not: Burada, fare monoklonal Abs dahildir: anti-CD14, anti-CD63, anti-CD66b, anti-CD1c, anti-CD15 ve anti-Sitokrom B-245 hafif zincir (p22- pHOx tanımlama). Tavşan poliklonal Abs dahildir: anti-CD68, anti-CD36, anti-LC3B anti-Miyeloperoksidaz, anti-nötrofil elastaz (NE), ve anti-NoX2 / gp91- pHOx Abs. İzotip kontrol saflaştırılmış fare IgG1 ve IgG2, ve tavşan IgG içermektedir. preparüreticinin talimatlarına göre ler ve, hücrelerin bir alanı kaplamak için uygun bir hacmi (yaklaşık 100 ul) kullanır.
5. hücreler yıkanır ve 1/400 ikincil antikorlar Cy2'nin-CF (488A) ile birleştirilmiş bayır keçi anti-tavşan IgG (yeşil) ve inkübe / veya Cy5 (KF 647) ile birleştirilmiş bayır keçi anti-fare IgG 40 Oda sıcaklığında (kırmızı) min.
   NOT: üreticinin talimatlarına göre Abs seyreltin ve hazırlar.
6. Yıkama işleminden sonra, hemen ardından kapak kayma yer nükleer boyama için 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) ihtiva eden, orta montaj tek damla ile montaj slaydları.
7. floresan mikroskop ve Planı Apo 40X daldırma yağ objektif kullanarak bir konfokal lazer tarama sistemi ile slaytlar analiz edin. slaytlar hazırlandıktan sonra 30 dakika ila 2 saat içinde analizi gerçekleştirmek ya da bir gecede 4 ° C'de tutun.
   1. Hücre alanı ve görüntüleme yazılımı (örneğin Resim J) kullanarak floresan yoğunluğu hesaplayın. co-lokalizasyon, nereye İçinManders Bindirme katsayısı (MOC) ¹⁷ kullanılarak yazılım tarafından ntify.
      Not: MOC Sadece hücre> 0.6 önemli bir eş-lokalizasyonu ile birlikte hücreler olarak kabul edilebilir.

Endotel Hücreleri karşısında PMN 3. Hicret: Dev phagocyte üzerinde IL-8 Etkileri (Gφ) Oluşumu

NOT: 24-de geçirgen hücre kültürü, hücre transmigration deneyi için ekler.

1. Kat 50 ug / ml'lik bir konsantrasyonda 150 ul fibronektin ucun üst odası, ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında tutulması.
2. Üst bölme ekle 5 x 10 ⁴ EA.hy926 endotel hücre / çukur, formüle edilmiş Dulbecco Modifiye Eagle Ortamı (tam büyüme ortamı) 150 ul yeniden süspanse edildi.
   NOT: endotel tek tabaka birleşik Kullanmadan önce olduğundan emin olun.
3. alt bölmeye, tam büyüme ortamı 700 mcL ekleyin.
4. geçirgen yerleştirinHücre kültürü,% 5 _CO2 içinde 37 ° C 'de, küme tepsiler ve Kültür 2 gün süreyle EA.hy926 endotelyal hücreler ekler.
   Not: (Bölüm 1 'de tarif edildiği gibi) paralel olarak, ikinci gün taze PMN hazırlar.
5. 2 gün sonra, ara parça, alt ve üst odalarında orta yerine.
   1. Alt bölmeye, 50 nM / ml'lik bir nihai konsantrasyonda,% 10 IH-FCS ve interlökin (IL) -8 ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamı ilave edin. alt odacıkları kontrol etmek IL-8 katmayın.
   2. Her bir üst bölmeye,% 10 IH-FCS ile takviye edilmiş RPMI-1640 ortamı içinde 100 ul 10 ⁶ taze PMN ekleyin.
6. 90 dakika boyunca% 5 _CO2 içinde 37 ° C 'de küme tepsileri inkübe edin.
7. 90 dakika inkübasyondan sonra, ayrı ayrı üst hücreleri ve alt odacıkları kaldırmak ve her ICSI'nin saymak. toplam hücrelerin yüzdesi olarak, her oda içinde ifade eden hücreleri ilave edildi.
   NOT: dikkatlice üst odacıklı hücreleri çıkarmaker endotel hücreleri kaldırarak önlemek ve steril bir tüpe transfer etmek için hafifçe pipetleme. pipetleme ve bir ikinci steril bir tüpe 500 ul transfer alt bölmeyi yıkanmasıyla Alt bölmeden alınan hücre çıkarın.
8. Transmigrating (alt bölme) ve non göçü (üst bölme) PMN fraksiyonları ve kültür büyüme faktörleri olmaksızın, 7 gün süreyle birkaç kuyu Havuz 10 ⁶ hücre adımda belirtilen 14-16 (bölüm 1).
9. Slaytlar ¹⁶ üzerine hücreleri Spin ve 2. bölümünde açıklandığı gibi konfokal mikroskobu ile her kültür durumda geliştirilen hücrelerin analiz.

Sonuçlar

Kültür nötrofil Autophagocytosis ve Kalkınma

Nötrofil autophagocytosis ve kültür 7 gün Gφ içine gelişimi, Şekil 3 ve 4'te gösterilmiştir. Gün 4 haberi - 7, büyüklüğü, ¹⁵ büyük ölçüde genişlemiş ve autophagosytosis sonra 90 dakika kadar erken açıktı ortak kültür floresan membran lekeleri (PKH-26, kırmızı; PKH-67, yeşil) ile nötrofil. Bu nötrofil alt popülasyonuna Bir kontrol olarak ¹⁴ bazı nötrofil kültürleri de, GM-CSF / IL-4 ile tedavi edildi. Daha önce tarif edildiği gibi kültür içinde 14 gün - sitokin ile muamele edilmiş hücreler, 7 olan boyutu artmıştır. ^{18, 19} Ama, Gφ daha küçük ve daha önce b bildirildiği gibi sitoplazmik projeksiyonlar, hücreler (Şekil 5) DC-benzeri benzeyen vardı Y Oehler ve diğ. ¹⁹ aynı zamanda GM-CSF / IL-4 muamele edilmiş hücreler, ¹⁵ açık bir şekilde hem morfolojik ve potansiyel olarak fonksiyonel farklılıklar gösteren, negatif ya da düşük bir CD66b ifade vardı.

Şekil 3: Kültür Geliştirme Dev Fagositler (Gφ) 'de Autophagocytosis. Taze izole edilmiş saflaştırılmış nötrofiller PKH-67 (yeşil) ya da sıfır zaman PKH-26 (kırmızı) membran floresan boyalar ve ko-kültürlenmiştir ile etiketlenmiş ve yedi gün kadar takip edildi. Hücreler, bir cam slaytlar üzerine döndürülmüştür çekirdekleri DAPI ile boyanmıştır ve numuneler konfokal mikroskopi ile analiz edilmiştir. Autophagocytosis önce ko-kültür, 90 dakika sonra, fark edilir. sarı ve turuncu içine kırmızı ve yeşil birleştirme gelişmekte Gφ açıkça bellidir.dosyaları / ftp_upload / 54826 / 54826fig3large.jpg "target =" _ blank "> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 4: Kültür Dev Fagositler (Gφ) geliştirilmesi. Taze izole saflaştırılmış nötrofil kültürde 7 gün öncesine kadar takip edildi. Hücreler, Mayıs Grunewald-Giemsa ile boyanarak, belirtilen zaman aralıklarında, cam slaytlar üzerine bükülmüş ve parlak alan mikroskopisi ile analiz edildi. Birkaç eozinofiller ile bireysel karşılaştırma için sunulmuştur. eozinofillerin boyutu kültüründe değişmeden kaldığına dikkat edin. Büyütme 100X yağı. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Şekil 5: Kültür Nötrofiller Tedavi Dev Fagositler (G φ) ve GM-CSF / IL Geliştirme Karşılaştırılması. (A), Ekim Grunwald-Giemsa lekeli nötrofiller (Gφ) olmadan kültürlenen ve 7 gün boyunca GM-CSF ile / IL-4. Numuneler, parlak alan mikroskopi ile analiz edilmiştir. Büyütme, X40. ancak, GM-CSF / IL-4, yaygın sitoplazmik çıkıntılar ile takviye edilmiş ortam ile kültürlerde geliştirilen hücreler Gφ daha küçüktür. (B) Yeni izole edilmiş nötrofiller PKH-26 (kırmızı) boya ile etiketlenir ve kültürlenmiş sitokin içermeyen ortam içinde 7 gün veya GM-CSF / IL-4 için ile desteklenen ortamda PKH-67 (yeşil) boya ile etiketlenir ve kültürlendi 7 gün. 1 oranında birlikte kültüre 2 saat: daha sonra geliştirilen hücreler, 1 içinde karıştırılmıştır. Hücreler, sabit ve konfokal MICR ile analiz edilmiştiroscopy. Bu rakam referanstan modifiye edilmiştir. ¹⁵ Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

daha da Gφ gelişme seyrini araştırmak, onların morfolojik değişiklikler de time-lapse mikroskobu ile takip edildi. Video 1 (Günlük 4 gün 3) ve video-2 (günlük 5 günlük 4) saflaştırılmış nötrofil kültürlerinde kendi gelişimini göstermektedir. Bunlar Gφ yapışmayan veya sınırlı hareket kabiliyeti ile hafifçe yapışık ve aktif nötrofil kalıntıları ve enkaz çevreleyen yemek vardır. Video-3'te, monosit türevli Mφ ve Gφ hareketi karışık monosit / nötrofil kültüründe karşılaştırılır. Mφ aktif (sol, etiketsiz hücresi) tarar. Gφ (sağda), parlak PKH-26 etiketli hücredir.

Video 1: - Time-lapse Mikroskopi tarafından 4 Gün 3 Saf PMN Kültürleri Dev Fagositler Geliştirme gösterir. Nötrofiller ters motorlu floresan mikroskop oluşan time-lapse microscopy.The zaman atlamalı mikroskopi sistemi ile güne 4 gün 3 kültürde takip edilen ve sahne kuvöz bir ile yüksek çözünürlüklü / B CCD kamera, bulundu. time-lapse görüntü yakalama edinimi her 10 dakikada alındı. Başlangıçta referans ¹⁴ yılında yayınlanan bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Video 2: - Ti tarafından yapılmış 5 Günlerinde 4 Saf PMN Kültür Dev Fagositler Geliştirme gösterirBeni atlamalı Mikroskopi. Nötrofiller izlenen time-lapse mikroskobu ile 5 gün güne 4'ten kültürde bulundu. time-lapse mikroskopi sistemi sahne inkübatör bir ile, ters motorlu floresan mikroskop oluşan ve yüksek çözünürlüklü / B CCD kamera olduğunu. time-lapse görüntü yakalama edinimi her 10 dakikada alındı. Bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Video 3: Dev phagocyte ve Co-kültür geliştirilen bir Makrofaj. ko-kültür monositler / nötrofiller izlenen time-lapse mikroskobu ile 5 gün güne 4'ten oldu. Monosit türevli makrofaj (sol); Parlak (PKH-26 lekeli hücre) nötrofil kaynaklı dev fagosit (sağda). video için zaman atlamalı mikroskopi sistemi ters motorlu floresan MICR oluşurOscope ve sahne kuvöz bir ile yüksek çözünürlüklü / B CCD kamera,. time-lapse görüntü yakalama edinimi her 10 dakikada alındı. Başlangıçta referans ¹⁴ yılında yayınlanan bu videoyu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Dev Fagositler içinde Belirteçlerinin İfadesi

Gφ nötrofilik kökenli Aşağıdaki nötrofil belirteçleri CD66b / CD63 / MPO / NK / CD15 (Şekil 6) pozitif ekspresyonu ile doğrulanmıştır. Gφ da NADPH oksidaz, oxLDL'nin çöpçü reseptörleri - CD68 ve CD36, ve otofaji işaretin varlığını gösteren (LC3BII ¹⁵ Batı lekeleme ile tanımlanır) LC3B kaplı hücre arası boşluklar ve aygıtları, içeriyordu. Ancak onlar monositik soy (CD14, CD16 ve CD163) ve Dendrit için negatifGφ kirleten monositler kaynaklanan olmadığını düşündüren ic hücreleri (CD1c ve CD141) belirteçleri.

Şekil 6: Kültür 7 Gün sonra Dev Fagositler (Gφ) 'de Nötrofiller, monositler ve dentritik hücreler için çeşitli belirteçlerinin ifadesi. nötrofil özel granül işaretleyici CD66b, azurophil granüller belirteçler CD63 ve MPO, nötrofil elastaz ve CD15 pozitif ifadesi. dendritik CD1c ve CD141 belirteçleri ve monositik soy belirteçleri CD14, CD16 ve CD163 için negatif ifadesi. Buna ek olarak, Gφ otofaji markör LC3B ifade leşçiaiıcılari CD68 ve CD36 ve NADPH oksidaz alt birimleri gp91-pHOx / P22-pHOx alt birimi. Çekirdekler DAPI ile boyanmıştır ve numuneler konfokal mikroskopi ile analiz edilmiştir. Bu rakam referanslarından modifiye edilmiştir. ¹⁴ p> ¹⁵ bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Gφ Fonksiyonları - NADPH Oksidaz Etkinleştirme, ROS üretimi ve Fagositoz:

lateks boncuk fagositoz ve opsonize zimosan Gφ belliydi. Gφ bazal ROS ile (Şekil 7) oluşturulur, ve oksidatif patlama (Şekil 7B-D) zimosan ve PMA uyarımı yanıt verdi. Bununla birlikte, monositler ya da nötrofiller farklı olarak, Gφ oxLDL'nin uyarılmaya karşılık olarak, aynı zamanda oluşturulur ve ROS Yağlı Kırmızı O (Şekil 7B, K) ile boyandı. not, NADPH oksidaz inhibitörü ile taze nötrofillerin tedavi - DPI, sadece ROS üretimini değil, aynı zamanda p inhibeROS sinyal Gφ formasyonu için elzem olduğunu düşündürmektedir kültüründe revented Gφ formasyonu. ^{14, 15}

Şekil 7: Oksidatif Patlama, Fagositoz ve Dev Fagositler tarafından oxLDL Alımı (Gφ). (A), Bazal ROS üretiminin Gφ lizozomlarında belirgindir. Okside LDL (oxLDL'nin) yanıt (B) ROS üretimi, PMA ve zimosan (zimosan parçacıkları açıkça belirtilmiştir). Olmayan ve PMA (slaytlar boyanmamış olmakla birlikte, uçlar Mayıs Grunwald-Giemsa ile boyanır) ile solunum açılma faaliyeti gösteren Gφ (C) nitroblue tetrazolium (NBT) testi. (D) NBT testi ve Mayıs Grunewald-Giemsa NADPH oksidaz ve ROS inhibe PMA ve PMA / DPI ile Gφ boyandı. L (E) FagositozPKH-26 (kırmızı) boyanmış hücrelerde atex ve IgG opsonize zimosan. Muamele edilmemiş ve oxLDL (f), Yağ Kırmızı O boya Gφ işlemden geçirildi. Bu rakam referanslarından modifiye edilmiştir. ^{14, 15} , bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Endotel Hücreleri karşısında PMN Hicret

Potansiyel nötrofiller Gφ haline olabilir alt popülasyonlarının belirlenmesi için, endotel hücre mono tabakaları aracılığıyla nötrofillerin göçünü (Şekil 8A) belirlenmiştir. 90 dakika sonra, nötrofil 62.3 ± 12.2% alt bölme, IL-8 doğru endotel hücreleri yoluyla transmigrant. Notun olmayan göç nötrofil fraksiyonu geliştirilen hücrelerin ise nötrofillerin transmigrant nüfus sadece gelişmiş CD66b / CD15 / LC3B pozitif Gφ nötrofilik belirteçler için boyut olarak daha küçük ve negatif olmuştur CD66b / CD15 (Şekil 8B, 8C) .

Şekil 8: Dev phagocyte (Gφ) Formasyon üzerinde Endotel Hücreleri ile IL-8, bağımlı PMN Transmigrasyonun Etkileri. (A) IL-8 doğru endotel hücre mono tabakaları (EC) karşısında nötrofil transmigration tahlil gösteren bir şema. Bu deney, akut inflamatuar sitelerinin nötrofillerin alımına ilişkin bir model olarak kabul edilebilir. (Protokol 3'te belirtilen) hücre göçü deneyinde - (B C), (B) transmigrating olmayan göç (C) nötrofiller Fracleri (protokol 1 'deki gibi), büyüme faktörleri olmaksızın yedi gün boyunca kültürlendi. Daha sonra, hücreler cam slaytlar üzerine bükülmüş ve konfokal mikroskopi ile analiz edilmiştir. Sabitlenen hücreler CD66b (kırmızı), LC3B (yeşil) ve CD15 (kırmızı) için boyandı. Çekirdekler DAPI (mavi) ile boyanmıştır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Tartışmalar

Dev fagositler (Gφ) gibi CD66b / CD15 / CD63 / MPO / KD gibi temel ve özel nötrofilik belirteçler ifade nötrofil kökenli hücrelerin yeni tanımlanmış ICSI'nin vardır. nötrofil kaynaklı phagocyte Bu tip daha önce literatürde tarif edilmemiştir. Kısa ömürlü ve apoptoz geçmesi nötrofillerin aksine, Gφ Annexin-V-negatif ve genişletilmiş ömrü görüntüler. Oysa, nötrofiller gibi, Gφ da parçacıkları içselleştirmek ve bu parçacıklara ve PMA yanıt NADPH oksidaz bağımlı ROS üretir. Ancak, onların yeteneklerini ROS Gφ benzersiz özellikleri vardır üretmek için sonuç OxLDL içselleştirmek ve. ¹⁴

Bir dizi faktör kültüründe gelişimini etkilemek için gösterildi. büyüme ortamında harici sitokinler ya da büyüme faktörleri olmaması şarttır (özellikle GM-CSF / IL-4). Ancak, IL-8 doğru nötrofillerin göç dev olanlar arasında bir ayrım faktörü olduğunu kanıtladıGφ içine eloped ve vermedi o. Inhibisyon Gφ oluşumu (Şekil 1) engellemesi nedeniyle aynı zamanda, apoptoz nötrofillerden çıkan döküntülerin içselleştirme, otofaji proteinleri (LC3B) ve fonksiyonel NADPH oksidaz ifadesi, tüm gelişim için şart olduğu gösterilmiştir. Görünüşe göre, nötrofiller kaynaklanan bu dev hücrelerin gelişimi, monosit / makrofaj bu karakterize dev hücre oluşumu farklıdır. Nötrofilik Gφ burada hücre kalıntıları içine çeken, autophagocytosis yoluyla geliştirmek ve açıklanan oysa çeşitli kronik inflamatuar hastalıklar, ^{20, 21} ile ilişkili son şekli çok çekirdekli dev hücreler çoğunlukla mono-çekirdekli kalır onların gelişimi boyunca, ¹⁴ (nadiren, ancak bazen ikinci bir çekirdek) gözlenebilir. Ayrıca, kontrollerin bir sayıda kendi nötrofilik kökeni kurdu: (1) ExpreBelirli neutropilic markerlerinin salgılanması ve dendritik ve monositik soy işaretlerinin yokluğu, monositlerde (2), engel geliştirme / PMN ko-kültürler, (3), canlı hücre görüntüleme ve zaman ile kanıtlandığı gibi, makrofajlar (kültür hareket onların farklı desenler -lapse mikroskopi) plastik tabaklar ve saf CD15 ⁺ / CD14 (5) kendi gelişimine, ¹⁴ (4) kendi ışık bağlılık ^- PMN flow sitometri ile satın aldı.

In-vitro teşhis fonksiyonlarından bazıları bize in vivo potansiyel fonksiyonları olarak ipuçları verebilir. Doğuştan gelen bağışıklık sinyal yollarının düzenleyici etkileşim yoluyla iltihabı azalan katkıda bulunan bir otofaji proteini, - ²² - Örneğin, Gφ yetenekleri nötrofil granül ve enkaz, büyük vakuollerde varlığı ve ifade LC3B büyük miktarlarda tüketmek için bütün bunlar destek süpürücü yetenekleri. GibiBu bulgular aynı zamanda Gφ Mφ / DC sistemi yetersiz veya boğulmuş inflamatuar sitelerde işleyen olabileceğini gösterir ve böylece inflamasyon çözümüne katkıda bulunur. Bu kavram karışık monosit / nötrofil kültürlerinde Gφ gelişimi engellenmektedir gerçeğiyle desteklenebilir. ^14. Ayrıca Gφ, oxLDL'nin çöpçü reseptör (CD36, CD68) eksprese OxLDL içselleştirme ve buna yanıt olarak ROS üretimi, iltihap çözmek için, aterosklerotik süreçlerde rol oynadığını göstermektedir bildirilmektedir. Gφ sadece IL-8'e doğru göç nötrofil ve IL-8, akut inflamatuar sitelere nötrofil çoğalması temsil doğru endotel mono tabakaları üzerinde nötrofillerin göçü gelişen için, bu sonuç, aynı zamanda anti-enflamatuar fonksiyonlar destekleyebilir. Bunun aksine, bazı iltihaplı koşullar Gφ performansı başına katkı böylece, granül bileşenleri ve ROS tahliye sağlayacak olabilirtutarlıdır inflamasyon ve doku hasarı. ²⁰ Ancak, genel olarak, bunların otofajik özellikler Gφ olasılıkla enflamatuar tepkiyi azaltarak yerine sürdürerek yer aldığını göstermektedir.

İlginç bir şekilde kısa bir süre önce insan aterosklerotik plaklardaki Gφ varlığını tespit ettik. (Hazırlık aşamasında). Oysa, soruların çok sayıda sökülmüş beklemektedir. Örneğin, Gφ pro- ya da iltihap? In vitro ya da in vivo olarak oluşumu ve işlevi belirleyen faktörler nedir? Gφ onların gelişimini kolaylaştırır kendi öncü hücre spesifik Hangi nötrofil alt nüfusudur? belli patolojileri ve hangi ile ilişkilidir? Topluca, kendi kökeni ve potansiyel fonksiyonları gibi ilginç sorular ortaya.

protokolü dahilinde Ancak kritik adımlar ve tuzaklar akılda tutulmalıdır. Gφ i gelişiminde kritik bir adıms sitokinler, büyüme faktörleri ya da antibiyotik ortamı içermeyen saf nötrofillerin kültür. Diğer önemli adım Gφ kirleten monositlerden geliştirmek ekarte etmek ve Gφ nötrofilik kökenini tespit etmektir. Işaretleyiciler ^- Böylece, kesintili gradyan kan ayrılmasından sonra, nötrofiller daha granülosit yolluk, CD15 ⁺ / CD14 kullanılarak akış sitometrisi ile saflaştırma ek aşamasına tabi tutuldu. geliştirilmiş Gφ daha fazla saflaştırılmadan bu adımına tabi ki farklılık yoktu ayırma akış sitometrisi ile saflaştırılmıştır nötrofillerden elde edilmiştir. Bu nedenle, deneylerin büyük bir kısmında bağlı ek hücre kaybına saflaştırma aşama sitometri akışı olmadan gerçekleştirilmiştir. Unutmayın ki, bazı nadir durumlarda bazı eozinofiller kültür kaydedildi. Onların büyüklüğü kültür dönemi boyunca değişmemiştir. Ayrıca dikkat gereken bir dizi yöntem mevcuttur, ancakinsan kanından nötrofil ayrılması için, burada açıklanan yöntem biz istihdam tek yöntemdir ve bu nedenle nötrofil ayrılması için mevcut diğer yöntemlerle Gφ gelişimini karşılaştırmak olamaz.

Gφ ilgili soruşturmada önemli bir hatadır çeşitli biyokimyasal deneyleri için uygun saf Gφ nüfusunun yeterli sayıda elde edememek kaynaklanır. Bizim deneyler yapılmıştır koşullarda neredeyse imkansız. İlk olarak, Gφ verimi düşüktür. 200 Gφ kan bağışında bağlı kültürde yedi gün sonra gelişebilir - 1.0 x 10 ⁶ PMN yaklaşık 100 numaralı seribaşı. İkincisi, bu çanak kalan nötrofil enkaz kültürde gelişmiş Gφ ayırmak için şu anda temelde zordur. Bu sınırlamalar pratikte imkansız biyokimyasal veya moleküler biyoloji yöntemleri ile hücreleri analiz yaptı. Bu nedenle, bu protokol ışık kullanılarak Gφ kimlik ve işlev anlatan odaklanmış olupve konfokal mikroskopi. kültürde Gφ içine nötrofillerden morfolojik dönüşüm de canlı hücre görüntüleme ve zaman atlamalı mikroskobu ile takip edildi. ¹⁴ Görünüşe göre, çok daha büyük kan hacimleri elde edilen düşük verim biyokimyasal veya moleküler biyoloji yöntemleri uygulamak ve üstesinden gelmek için ve çanak Nötrofiller 'enkaz gelen canlı Gφ ayıran ihtiyaç duyulabilir.

Özet olarak, kısa bir süre önce, kültür ilk kez nötrofilik kaynaklı uzun ömürlü fagositler gösteren bir alt Gφ gelişimini tarif edilmiştir. Yukarıda bahsedilen iki büyük sınırlamalar aşılabilir gerektiği halde Bu nedenle, bu kültürde Gφ elde etmek için, şu anda mevcut olan tek bir yöntem olup, (Gφ düşük verim kültüründe elde edilen, ve kültür nötrofil artıklardan geliştirilmiş Gφ ayrı yetersizlik tabak). Yine, bu protokol sunulan bunların hazırlanması ve tanımlanması, essentia olduğuayrıca Gφ potansiyel önemini ve işlevlerini araştırmak amacıyla, inflamatuvar yanıt ve nötrofil biyoloji ve plastisite ilgilenen bilim adamları l.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterile scalp vein set (21GX3/4)	Bio Diagnostics Ltd.	# 20080312	A strile needle for venipancture
VACUETTE HOLDEX Single-Use Holder PP	Greiner Bio-One	# 450263	For securing during venipuncture
VACUETTE Tube K3E K3EDTA (16 x 100/9 mL)	Greiner Bio-One	# 455036	Sterile tube for blood collection
Nunclon MultiDish (24 well x 1 ml)	Thermo Scientific	# 142475
Polypropylene conical centrifuge tube (50 ml)	Greiner Bio-One	# E14103PJ
Transwell-24 well (transmigration assay)	Corning	# CA-3415	Polycarbonate membrane, 6.5 mm diameter, 3 μm pores)
RPMI-1640 medium	BioIndustries	# 01-100-1A	Do not add antibiotics
EA.hy926 (ATCC CRL2922)	BioIndustries	# CRL-2922
ATCC-formulated Dulbecco’s  Modified Eagle’s Medium	BioIndustries	# 302002	complete growth medium
Polysucrose - Histopaque1119	Sigma-Aldrich	# 1119-1	Tissue culture grade
Polysucrose - Histopaque1077	Sigma-Aldrich	# 1077-1	Tissue culture grade
Phosphate buffered saline (PBS) - ion free	BioIndustries	# 02-023-1A	Cell biology and molecular biology grade
Heat inactivated Fetal calf serum (HI-FCS)	BioIndustries	# 04-121-1B	Cell biology grade or tissue culture grade, low LPS
NaCl	Sigma	# S3014	Molecular biology grade, suitable for cell culture
Paraformaldehyde, 16%	Electron Microscopy Sciences	# 15710	Cell bology grade or tissue culture grade (only 16% PFA)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	# 9002-93-1	Molecular biology grade
Normal Goat Serum	BioIndustries	# 04-009-1	Cell biology and molecular biology grade
Trypan blue	BioIndustries	# 031021B	Tissue culture grade
May-Grünwald	Sigma-Aldrich	# MG500	Cell biology grade-(procedure No GS-10)
Giemsa stain Kit	Sigma	# 48900	Cell biololgy grade-(procedure No GS-10)
Fibronectin	BioIndustries	# 03090105
Human Interleukin-8 (CXCL8)	PeproTech	# 200-08-5
Anti-CD14 (clone 5A3B11B5)	Santa Cruz Biotechnologies	# sc-58951	Mouse IgG2b; expressed by  monocytes
Anti-CD63 (clone MX-49.129.5)	Santa Cruz Biotechnologies	# sc-5275	Mouse IgG1; expressed by neutrophils
Anti-CD66b (clone 80H3)	AbD Serotec	# MCA216	Mouse IgG1; expressed by neutrophils
Anti-CD1c (BDCA-1) (clone AD5-8E7)	MACS Miltenyi Biotec	# 130-090-695	Mouse IgG2a; expressed by  dendritic cells
Anti-CD15 (clone MY-1)	Abcam	# ab754	Mouse IgM; expressed by neutrophils
Anti-Cytochrome b-245 Light Chain (p22-phox) (clone 44.1)	BioLegend	# 650001	Mouse IgG2a; to recognize neutrophil NADPH oxidase complex
Anti-CD68	Protein Tech	# 16192-1-AP	Rabbit IgG; to recognize oxLDL scavenger receptor
Anti-LC3B	Sigma	# L7543	Rabbit IgG
Anti-Myeloperoxidase	Abcam	# ab45977	Rabbit IgG
Anti-Neutrophil elastase	Calbiochem	# 481001	Rabbit IgG
Anti-NOX2 (gp91-phox)	Abcam	# ab131083	Rabbit IgG
Anti-CD36 (SR-B3)	Novus Biologicals	# NB400-144	Rabbit IgG
Purified Mouse IgG1, κ Isotype Control (clone MG1-45)	BioLegend	# 401401	Antibody used as isotype control
Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control (clone MOPC-173)	BioLegend	# 400263	Antibody used as isotype control
Normal rabbit IgG	Santa Cruz Biotechnologies	# sc-2027	Antibody used as isotype control
CF488A Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Biotium	# 20012	Anti-Rabbit IgG with the green fluorescent dye CF488A
CF647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Biotium	# 20043	Anti-Rabbit IgG with the red fluorescent dye CF647
CF488A Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Biotium	# 20010	Anti-Mouse IgG with the green fluorescent dye CF488A
CF647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Biotium	# 20040	Anti-Mouse IgG with the red fluorescent dye CF647
Fluorescent Mounting Medium with DAPI	Vectashield H-1000; Vector Lab Inc.	# E19-18	Nuclear staining
Confocal laser scanning microscope (LSM 700)	Carl Zeiss	Ser.# 3523000380	Plan Apo 40X immersion oil objective
Zeiss CLSM software (ZEN 2010)	Carl Zeiss MicroImaging GmbH	version 6.0	For colocalization analysis
ImageJ software	Wayne Rasband, NIH, USA	version 1.49k	For determination of cell  areas and fluorescence intensity
Light microscope (Axiovert 25)	Carl Zeiss	Ser.# 201060153	Examination of cells in culture
Centrifuge (Megafuge 1.0 R)	Heraeus Instruments	# D-37520	Cells separation from blood; cytospins preparation
Inverted fluorescent microscope (Zeiss Axio Observer Z.1)	Carl Zeiss	Ser.# 3834001470	Demonstration of giant phagocytes development
Temperature-controlled incubation system (Cube&Box)	Life Imaging Services		Temperature control system for microscopes
High resolution digital CCD camera (AxioCam HRm)	Carl Zeiss	Ser.# 117090279	For capturing high-contrast  image data from an examined cell objects
Hydrophobic barrier pen (Elite PAP Pen)	Diagnostic Biosystems	# K039	For defining cell perimeter for immunoflourescence staining