Разработка и идентификация романа субпопуляции человеческого нейтрофилами производного Giant фагоцитов<em&gt; In Vitro</em

Резюме

Здесь мы опишем способ получения и идентификации новых характеризующийся субпопуляции нейтрофильных происхождения гигантских фагоцитов. Эти клетки развиваются в культуре из свежих нейтрофилов крови человека, и характеризуются фагоцитоза, аутофагии, очень большого размера, и увеличенный срок службы. Этот метод имеет важное значение для дальнейшего изучения этого уникального нейтрофильной происхождения субпопуляции.

Аннотация

Нейтрофилы (ПМН) лучше всего известны своими фагоцитарной функции от вторжения патогенных микроорганизмов и микроорганизмов. Они имеют самый короткий период полураспада среди лейкоцитов, а также в их неактивированной состоянии конститутивно стремится к апоптозу. Когда нанят для воспаленных участков для разрешения воспаления, они производят множество цитотоксических молекул с мощным антимикробным убийства. Тем не менее, когда эти мощные цитотоксические молекулы высвобождаются в неконтролируемым образом они могут привести к повреждению окружающих тканей. В последние годы, однако, нейтрофилы универсальность все чаще подтверждается, демонстрируя пластичность и иммунорегуляторных функций. Недавно мы идентифицировали новую нейтрофильной происхождения субпопуляции, развивающий спонтанно в стандартных условиях культивирования без добавления факторов цитокины / роста, таких как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (GM-CSF) / интерлейкин (IL) -4. Их фагоцитарной способности нейтрофилов остатков в значительной степени способствовать повышению ихразмер безмерно; поэтому они были названы гигантские фагоциты (Сф). В отличие от нейтрофилов, Сф давно жили в культуре. Они выражают кластер дифференцировки (CD) нейтрофильных маркеры CD66b / CD63 / CD15 / CD11b / миелопероксидазы (MPO) / эластазы нейтрофилов (NE), и лишены моноцитов маркеров линии преемственности CD14 / CD16 / CD163 и дендритных маркеры CD1c / CD141 , Они также принимают вверх латекс и зимозан, и реагировать на окислительный взрыв стимуляции с опсонизированным-зимозан и РМА. Сф также выражают поглотитель рецепторов CD68 / CD36, и в отличие от нейтрофилов, усваивают окисленных липопротеинов низкой плотности (oxLDL). Кроме того, в отличие от свежих нейтрофилы, моноциты или культивированного, они реагируют на поглощение oxLDL за счет увеличения активных форм кислорода (ROS) производства. Кроме того, эти фагоцитов содержат ассоциированный с микротрубочками белок-1 легкой цепи 3B (LC3B) вакуоли с покрытием, что указывает на активацию аутофагии. Использование специфических ингибиторов, очевидно, что как фагоцитоз и аутофагия являются prerequisiTES для их развития и, вероятно, НАДФН-оксидазы зависимой ROS. Мы опишем здесь способ получения этой новой субпопуляции долгоживущих, нейтрофильных происхождения фагоцитирующих клеток в культуре, их идентификации и их известных в настоящее время характеристик. Этот протокол имеет важное значение для получения и характеризующий Сф с целью дальнейшего изучения их значение и функции.

Введение

Полиморфноядерные нейтрофилы (ПМН) составляют самую большую популяцию лейкоцитов в крови, выступающей в качестве первой линии обороны против вторжения патогенных микроорганизмов, производя широкий спектр цитотоксических молекул. Традиционная точка зрения уже давно, что профессиональных фагоцитов крови, циркулирующей непродолжительным, которые являются первыми, чтобы прибыть в острых воспалительных очагов бороться с инфекциями и помощь в зазоре патогенов и вредных частиц. ¹ В их неактивированной состоянии, нейтрофилы конститутивно приверженность к апоптозу. При миграции из крови в местах воспаления, нейтрофилы подвергаются активации для разрешения воспаления. Они фагоцитируют и убить вторжения микроорганизмов, производя множество цитотоксических молекул в качестве активных форм кислорода (ROS), литические ферменты, такие как эластазы нейтрофилов (NE) и катепсинов с мощной бактерицидной активностью. Для того, чтобы улавливать патогенами, нейтрофилы также выделяют внеклеточные ловушки (сетки), Которые состоят из ядерного хроматина нитей, содержащих антибактериальные пептиды и различные литические ферменты. Тем не менее, неконтролируемый выброс этих цитотоксических молекул из нейтрофилов может также увековечить воспалительные реакции и вызывают повреждение окружающих тканей. ² Таким образом, эффективный клиренс апоптотических нейтрофилов макрофагами (М ^) и дендритные клетки (DC) имеет решающее значение для устранения воспаления. ^{3, 4, 5, 6}

В последние годы, однако, становится все более очевидным, что нейтрофилы являются весьма разносторонние клетки, функции которых выходят далеко за пределы фагоцитоза и патогена убийства. ^{6, 7} Соблюдая гигиену грунтование или активацию нейтрофилов пластичностью постепенно завоевывает все внимание. Например, бактерии и микобактерии оспаривались нейтрофилы показаносекретируют интерлейкин (IL) -10 и контролировать воспалительную реакцию, что указывает на наличие иммуно-регуляторных реакций. ⁸ постмитотическими нейтрофилы показано транс-дифференцироваться в М ^-подобных клеток, или постоянного тока , таких как клетки при переваривании и представляя антиген фрагментов при обработке цитокинов и факторов роста, ^{9, 10} , таким образом, служит решающую роль в интеграции врожденной и адаптивной ответы. ^{3, 6} Активация факторов роста способствовали при полном охвате апоптотических нейтрофилов или остатков клеток, тем самым, облегчая очистку мусора в местах воспаления и разрешение воспаления, ^{3, 9} в частности , когда система зазора М ^ / DC является недостаточным или перегружены, ^{11, 12} предлагая потенциал "саморегулирование", чтобы помочь восстановитьрешить воспалительную реакцию. Это, так как апоптоз является формой регулируемой собственной смерти, которое может ингибировать внеклеточный высвобождение цитотоксических соединений, и тем самым предотвратить повреждение окружающих тканей. ⁶

Увеличивал выживаемость является еще одним признаком активации нейтрофилов и была продемонстрирована путем обработки различными принимающими получены факторы, такие как гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (G-CSF), гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), воспалительных цитокинов, таких как интерферон ( ИФН) -γ, фактора некроза опухоли (ФНО) и / или патогена, полученных продуктов, таким образом, позволяя нейтрофилы модулировать их реакцию выживания. ⁶ На самом деле, выживание нейтрофилов является необходимым условием для его пластичности и было связано с его способностью выполнять фагоцитоз. ^{6, 13} Соответственно, было также показано , что ассоциируют с фенотипическими и функциональными изменениями , которые висимостьDed на повышающей регуляции экспрессии генов, индуцируя синтез новых белков, участвующих в нейтрофильных расширении продолжительность жизни, и уменьшалась апоптоза. ¹⁰

В отличие от нейтрофилов, которые недолго и конститутивно апоптозу в культуре, или цитокины / факторы роста активированные нейтрофилы, описанные выше, которые продлевал срок службы, в последнее время мы идентифицировали новую, небольшой субпопуляции нейтрофилов, которая развивается спонтанно в продолжительном стандартной культуре условия из свежеизолированных нейтрофилов крови человека без добавления извне цитокины или факторы роста. ¹⁴ Эти нейтрофильных полученные клетки, которые не были описаны ранее в литературе были названы гигантские фагоциты (Сф). Сф продлили продолжительность жизни в культуре, они полностью разработаны в течение 5-7 дней, и характеризуются уникальными морфологическими признаками, экспрессии фенотипического и функций. Они значительно увеличены за счет autophagoЦитоз мертвых остатков нейтрофильных, вакуолизированных, и содержат фаголизосомах. Сф выражают специфический маркер гранул нейтрофилов - кластер дифференцировки (CD) 66b, азурофильных гранулы маркеров - CD63 и миелопероксидазы (МРО) и дополнительные нейтрофилы маркеры , такие как CD11b, NE, CD15, НАДФН - оксидазы субъединиц gp91- phox и p22- phox и аутофагия маркер -LC3BII. ^{14, 15} Функционально, они активно принимают меры латексные шарики и частицы зимозаном, а также генерировать ROS в ответ на зимозаном и форбол 12-миристат 13-ацетата (РМА) стимуляции. Интересно, что в отличие от свежих нейтрофилы, Сф также интенсивно выражают мусорщик рецепторов CD68 и CD36, натяжные окисляется липопротеинов низкой плотности (oxLDL), а также генерировать ROS в ответ на стимуляцию oxLDL. Кроме того, Сф лишены моноцитарных маркеров CD14 линии дифференцировки, CD16 и CD163 или дендритные маркеры CD1c и CD141. Кроме того, PHAgocytosis и аутофагии и, вероятно, функциональная NADPH оксидазы являются необходимыми условиями для их развития. Это с тех пор, фагоцитоза-ингибитор cytochalsin В, ингибиторы автофагии 3-метиладенин (3-МА) и bafilomycin (BafA1) и ингибитор оксидазы NADPH - дифенилен иодония (DPI) - предотвратить их развитие. Кроме того, моноциты / нейтрофилы сокультурах, а также воздействие прерывистой гипоксии препятствует их развитию, в то время как нейтрофилы адаптация к устойчивой гипоксии была очевидна. ^14,15 Их развитие в Рекомендованное культуры показана на рисунке 1 протокол .The в настоящем документе описывается шаг за шагом подготовки от G ^ свежевыделенные циркулирующих нейтрофилов крови человека, их развитие, идентификацию и некоторые основные характеристики. Этот протокол может быть использован для дальнейшего исследования и выявить широкий спектр и роль этих недавно описал и интригующим нейтрофилы происхождения Сф для того, чтобы characterizе их значение и их потенциальные функции.

Рисунок 1: Схематическое изображение развития гигантских клеток в 7 -й день нейтрофильных культур. Предполагается , что на участках воспаления (1) нейтрофилы подвергаются апоптотической гибели клеток, и (2) релиз мембраной окружении фрагментов , содержащих ядерный мусор, гранулы (зеленые и красные точки) и другие субклеточные компоненты , которые запускают механизмы аутофагии. (3) Гигантские фагоциты (Сф) развиваются в долгосрочных нейтрофильных культур , лишенных цитокинов или факторов роста усваивая апоптотических телец и нейтрофилов мусора, сохраняя при этом функциональный NADPH oxidase.They характеризуются различными нейтрофильного CD66b + / CD63 + / MPO + / CD15 + / CD11b + / NE маркеры, большие фагосомы ограждающих гранул и остатков клеток и мусорщик рецепторов CD36 и CD68. гигабайт1; в основном мононуклеарные клетки, способные к интернализации также различные частицы и окисленного LDL и генерировать ROS. Мембраны вакуолей заполнения Сф содержат LC3B (отмечены темно-синим цветом), маркера autophagosomal мембраны, что предполагает строгую ассоциацию между аутофагии и формирования гигантского фагоцитов. Сф не развиваются в среде, содержащей GM-CSF / IL-4. Кроме того, ингибиторы, такие как ингибитор NADPH-оксидазы - дифенилен иодония (DPI), ингибиторы автофагии 3-метиладенин (3-МА) и bafilomycin (BafA1) и ингибитор фагоцитоз цитохалазином (. Цито B) отменить их образование. (4) Потенциальные функции Сф в естественных условиях может включать в себя анти- или провоспалительные свойства и участие в атеросклеротических процессах (эта цифра основана на наших выводах ^{14, 15} и был изменен с сопровождающим редакционную BЭртон ^20). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

протокол

Протокол был одобрен Комитетом по правам человека местным путем в соответствии с Хельсинской декларацией, и все участники подписали форму информированного согласия.

1. Нейтрофильная Выделение и развитие культуры в G ^

Примечание: Все шаги должны быть выполнены с использованием стерильной ткани класса lipopolysaccaride (LPS) -Free решения в капюшоне потока Bio-Safety ламинарного. Не добавлять антибиотики, цитокины или факторы роста в парк мемориального института Roswell (RPMI) -1640 среды.

1. Получают по крайней мере, 40 мл венозной крови от молодых здоровых взрослых с использованием стерильного набора скальп вены. Нарисуйте крови в вакуумные пробирки , содержащие этилендиаминтетрауксусную уксусная кислота К ₃ соли (K ₃ ЭДТА) и аккуратно перемешать. Держите кровь при комнатной температуре.
2. Изолировать нейтрофилы от двухэтапного прерывистого градиента плотности с использованием polysucrose на 1.119 и 1.077 г / мл. Доведите решения до комнатной температуры перед использованием.
   Примечание: Во время центрифугирования, красная кровьклеток (эритроцитов) агрегируются по polysucrose и осадка быстро. Моноядерные клетки (моноциты / лимфоциты) находятся между верхней плазмы / polysucrose -1,077 интерфейс, в то время как нейтрофилы находятся прямо над эритроцитами, в polysucrose -1077 / 1119 интерфейса (рисунок 2). Этот метод позволяет одновременно разделение мононуклеарных клеток и нейтрофилов из того же индивидуума.

Рисунок 2: Нейтрофильная Изоляция от цельной крови человека. Polysucrose при 1,077 г / мл, тщательно слой поверх polysucrose-1,119 г / мл, чтобы образовать прерывистый градиент. Разбавленный цельной крови затем наслаивали поверх polysucrose-1.077. Пробирки немедленно центрифугируют при 700 х г в течение 30 мин, при комнатной температуре без тормоза. отмечены три отдельные полосы. (A) мононуклеарных клеток, (б) полиморфно - клетки (ПМН),и (С) , эритроциты (RBC) в нижней части трубы. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

1. Добавьте 12 мл polysucrose-1119 на дно 50 мл стерильной полипропиленовой коническую центрифужную пробирку.
2. Осторожно слой 12 мл polysucrose-1077 на polysucrose -1119.
3. Развести 10 - 12 мл цельной крови до конечного объема 24 мл крови с ионом свободным фосфатным буферным раствором (PBS), содержащем 2% инактивированной нагреванием фетальной телячьей сыворотки (HI-FCS). Осторожно слой 24 мл разведенной цельной крови на верхний градиент трубки.
4. Центрифуга при 700 мкг в течение 30 мин при комнатной температуре (20 - 24 ° C) без тормоза.
   Примечание: центрифугирование при более низких температурах может привести к клеточной слипания и плохое восстановление.
5. Осторожно удалите пробирки из центрифуги withouт нарушая градиент. Два непрозрачные слои должны соблюдаться (A: мононуклеаров и B: ПМН, изображенные на рисунке 2).
6. Отберите и отказаться от жидкости до 0,5 см выше слоя А. Transfer (или отбрасывания) клеток от этого слоя на трубу с надписью "мононуклеарных".
7. Отберите и выбросить оставшуюся жидкость до 0,5 см выше уровня B. Передача клетки из этого слоя в пробирку с надписью "ПМН".
8. Бассейн ПМН из каждых двух градиентных трубок и промывали PBS, содержащем 2% HI-FCS до конечного объема 30 мл. Центрифуга в течение 12 мин при 200g, удалить супернатант и выбросить.
9. Чтобы избавиться от загрязнения красных кровяных телец (эритроцитов), добавляют 3 мл гипотонического 0,2% ледяной стерильного NaCl в то время как ресуспендирования осадок, осторожно втягивая и с 1 мл стерильной пипетки наконечник. Держите на льду в течение 30 сек.
10. После 30-х годов, восстановление изотоничность путем добавления 3 мл стерильного 1,6% охлажденного на льду NaCl в трубке.
11. К 6 мл изотонического солевого раствора, добавляют 6 мл подогретого (37 ° С) среды RPMI-1640, дополненной 2% HI-FCS и центрифуге при 250 х г в течение 12 мин. Удалите супернатант. ПМН гранулы должны быть очищены от загрязнений РБК.
    Примечание: В случае загрязнения РБК осадок ПМН появляется красноватый.
12. Если некоторые загрязняющие РБК остаются, повторите шаги 9 и 10 еще раз.
13. Ресуспендируют осадок клеток в 4 мл среды RPMI-1640 с добавлением 10% HI-FCS и подсчета клеток, чтобы определить их концентрацию и жизнеспособность путем трипанового синего.
14. Отрегулируйте концентрацию до 1,25 - 1,5 × 10 ⁶ PMN / мл ( в зависимости от экспериментальных потребностей), и пластины 1,0 мл / лунку в 24 - луночного планшета.
    Примечание: Чистота нейтрофилов в популяции гранулоцитарного всегда превышала 95%, по оценке мая Груневальд-Гимза окрашивания и световой микроскопии.
15. После высева, поместите клетки в увлажненном 5% CO ₂ инкубаторе при температуре 37 ° С.
16. Заменить средний каждые 3 дня, осторожно аспирационных половинусреда и добавление один и тот же объем свежей среды RPMI-1640, дополненной 10% HI-FCS. Использование LPS свободных решений и соединений и низкие уровни LPS в HI-FCS (0,05 нг / мл или меньше).
    Примечание: Нежное среда изменение является обязательным, так как Сф, которые развиваются в культуре не прочно прикрепить к культуре блюдо и энергичной стирки может также промыть развивающиеся клетки. Появление G ^ заметно при 3 - 4 дней после того, как ПМН культивирования, в зависимости от донора крови. Большинство анализов и анализов, описанных здесь выполняются между 6 - 7 дней в культуре, когда Сф очень большие по размеру. Следует отметить, что добавление 1 - 10 нг / мл LPS в среде RPMI-1640, не влияет на Сф развитие в культуре. ¹⁴

2. конфокальной лазерной сканирующей микроскопии

1. Подготовка cytospins ¹⁶ из свежеизолированных нейтрофилы, и от 7 дней разработал культур Сф(Полученного в разделе 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для повышения концентрации G ^ в блюдо для различных анализов, аккуратно удалите половину среды. Убедитесь, что Сф не обнаружены в удаленной среде путем изучения среды под световым микроскопом. Затем интенсивно пипеткой оставшуюся среду для удаления слегка приклеенный Сф. Центрифуга среды в течение 10 мин при 200g и ресуспендируют осадок в 100 - 120 мкл среды.
   1. Используйте 100 - 120 мкл среды, содержащей клетки для каждого слайда. Подготовка двух или трех повторностях слайдов из каждой обработки. Спин в течение 7 мин при 84 х г.
2. Сушат сформованных клетки и зафиксировать клетки, 4% параформальдегида при комнатной температуре в течение 10 мин при химическом капюшоном. Вымойте 3x с PBS (~ 100 мкл в течение нескольких секунд на каждую промывку). Для внутриклеточного окрашивания, проницаемыми клеток с 0,5% Тритон Х-100 в PBS при комнатной температуре в течение 10 мин и мыть 5x с PBS.
   Примечание: На всех этапах, используйте соответствующий буфер / VOLU решениямне, чтобы покрыть периметр ячеек на слайде. Используйте гидрофобный барьер пера для определения клеток периметра.
   Внимание: параформальдегид является токсичным. Избегать попадания на кожу и глаза. Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты.
3. Блокбоксов с 10% нормальной козьей сывороткой в ​​среде RPMI-1640, и инкубируют в течение ночи при 4 ° С или при комнатной температуре в течение 40 мин. Мытье с PBS.
4. Инкубируйте с одним антителом (Ab) или комбинации мыши и кролика первичными антителами (абс) при разведении 1: 100 (~ 100 мкл). Выдержите в течение ночи (18 - 20 ч) при температуре 4 ° С.
   Примечание: Здесь, мышиное моноклональное Абс включены: анти-CD14, анти-CD63, анти-CD66b, анти-CD1c, анти - CD15 и анти-цитохром б-245 легкой цепи (p22- идентификация phox). Кроличьи поликлональные Abs включены: анти-CD68, анти-CD36, анти-LC3B, анти-миелопероксидазы, анти-эластазы нейтрофилов (NE), и анти-Nox2 / gp91- phox Abs. изотипические контроли включали очищенный IgG1 и IgG2 мыши и кролика IgG. ДГОе абс в соответствии с инструкциями изготовителя и использовать соответствующий объем (около 100 мкл), чтобы покрыть периметр клеток.
5. Вымойте клетки и инкубировать с 1/400 вторичными антителами су2-CF (488A) -conjugated козы против кроличьего IgG (зеленый) и / или Cy5 (CF 647) -conjugated козьего антитела против мышиного IgG (красный) при комнатной температуре в течение 40 минимум
   Примечание: Развести и подготовить Abs в соответствии с инструкциями изготовителя.
6. После промывки установите слайды с одной каплей монтажа среды, содержащей 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI) для ядерного окрашивания, а затем сразу же место покровное.
7. Анализ слайды с помощью конфокальной лазерной сканирующей системы с помощью флуоресцентного микроскопа и цель погружения нефти Plan Apo 40X. Проведение анализа в течение 30 мин до 2 ч после подготовки слайдов или держать при температуре 4 ° С в течение ночи.
   1. Вычислить площадь клеток и интенсивность флуоресценции , используя программное обеспечение визуализации (например , J изображения). Для совместной локализации, кваntify с помощью программного обеспечения с использованием Мандерс Коэффициент Симпсона (MOC) ^17.
      В настоящее время только клетки с MOC> 0,6 можно рассматривать в качестве клеток со значительным совместной локализации.

3. Переселение ПМН Через эндотелиальных клеток: Влияние IL-8 на гигантских фагоцита (Сф) Формирование

Примечание: Используйте 24-хорошо проницаемой культуры клеток вставляет для анализа клеточных переселения.

1. Покройте верхняя палата вставки с 150 мкл фибронектина при концентрации 50 мкг / мл, и держать при комнатной температуре в течение 30 мин.
2. Добавить в верхней камере 5 х 10 ⁴ EA.hy926 эндотелиальные клетки / лунку, ресуспендировали в 150 мкл сформулированного модифицированной среде Дульбекко Игла (полная среда для роста).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь в том, что эндотелиальные монослой является сливающийся перед использованием.
3. К нижней камере, добавьте 700 мкл полной среды для роста.
4. Поместите проницаемаклеточной культуры вставляет в кассетных лотках и культуры EA.hy926 эндотелиальных клетках в течение 2 дней при 37 ° С в 5% CO _2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Параллельно с этим, на второй день готовить свежий ПМН (как описано в разделе 1).
5. После 2 -х дней, замените носитель в нижней и верхней палатах вставок.
   1. К нижней камерой, добавьте среду RPMI-1640, дополненной 10% IH-FCS и интерлейкин (IL) -8 до конечной концентрации 50 нМ / мл. Не добавляйте IL-8, чтобы контролировать нижнюю камеры.
   2. Для каждой из верхней камеры, добавьте 10 ⁶ свежих ПМН в 100 мкл среды RPMI-1640 , дополненной 10% IH-FCS.
6. Инкубируйте кассетные лотки при температуре 37 ° С в 5% CO ₂ в течение 90 мин.
7. После 90-минутной инкубации, удалите клетки из верхней и нижней камер по отдельности и считать каждый субпопуляции. Экспресс-клетки в каждой камере в процентах от общего числа клеток, добавленных.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно удалите клетки из верхней chambэр пипеткой осторожно, чтобы избежать удаления эндотелиальных клеток и переноса в стерильную пробирку. Удалить клетки из нижней камеры с помощью пипетки и промывание нижней камеры с 500 мкл и передачи на вторую стерильную пробирку.
8. Бассейн 10 ⁶ клеток из нескольких скважин переселяется (нижняя палата) и немигрирующего (верхняя палата) ПМН фракций и культуры каждого в течение 7 дней без факторов роста , как указано в пунктах 14 - 16 (раздел 1).
9. Спин клеток на слайды ¹⁶ и анализировать развитые клетки в каждой из условий культивирования с помощью конфокальной микроскопии , как описано в разделе 2.

Результаты

Нейтрофильная Autophagocytosis и развитие в области культуры

Нейтрофильная autophagocytosis и их развитие в G ^ в течение 7 дней в культуре показано на рисунках 3 и 4. По дни 4 - 7, их размер был значительно увеличены, ¹⁵ и autophagosytosis было очевидно еще в течение 90 мин после совместного культивирования нейтрофилы с флуоресцентными пятнами мембраны (РКН-26, красный; PKH-67, зеленый). ¹⁴ В качестве контроля к этому нейтрофильной субпопул, некоторые нейтрофильные культуры были также обработаны с GM-CSF / IL-4. Цитокин обработанных клеток увеличилось в размерах в течение 7 - 14 дней в культуре, как описано ранее. ^{18, 19} Но, были меньше , чем G ^ и имели цитоплазматические выступы , напоминающие DC-подобные клетки (рисунок 5), как сообщалось ранее б у Oehler и др. ¹⁹ Кроме того , GM-CSF / IL-4 обработанные клетки были отрицательными или имели низкую экспрессию CD66b, ¹⁵ наглядно демонстрирует морфологические и потенциально функциональные различия , а также.

Рисунок 3: Autophagocytosis в развивающихся гигантском фагоцитов (Сф) в культуре. Свежевыделенные очищенные нейтрофилы были помечены РКН-67 (зеленый) или РКН-26 (красный) мембранных флуоресцентных красителей в нулевой момент времени, а затем совместно культивировали и с последующим до семи дней. Клетки осаждали центрифугированием на стеклянные слайды, ядра окрашивали DAPI и образцы анализировали с помощью конфокальной микроскопии. Autophagocytosis уже заметно через 90 мин совместного культивирования. Слияние красного и зеленого в желтый и оранжевый отчетливо видно в развивающихся G ^.Файлы / ftp_upload / 54826 / 54826fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4: Развитие гигантских фагоцитов (Сф) в культуре. Свежевыделенные очищенные нейтрофилы с последующим до 7 дней в культуре. Клетки осаждали центрифугированием на стеклянные слайды в указанные промежутки времени, окрашивали с мая Grunewald-Гимзе, и анализировали с яркой микроскопии. Человек с несколькими эозинофилов представлен для сравнения. Обратите внимание, что размер эозинофилов остается неизменной в культуре. Увеличение 100X масла. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 5: Сравнение между развитием Giant фагоцитов (G φ) и GM-CSF / IL Обработанные Нейтрофилы в культуре. (А) может Грюнвальд-Гимза окрашенных нейтрофилы культивировали без (G ^) и с GM-CSF / IL-4 в течение 7 дней. Образцы анализировали с ярко-поле микроскопа. Увеличение, X40. Клетки, разработанные в культурах с среде с добавлением GM-CSF / IL-4 широко распространенном цитоплазматических проекций, но меньше, чем G ^. (B) Свежевыделенные нейтрофилы метили-26 PKH (красный) , краситель и культивировали в цитокин-свободной среде в течение 7 дней или при обозначении-67 PKH (зеленый) краситель и культивировали в среде , дополненной GM-CSF / IL-4 7 дней. Затем, развитые клетки смешивали в соотношении 1: 1 и культивировали совместно в течение 2 часов. Клетки фиксировали и анализировали с помощью конфокальной MICRoscopy. Эта цифра была изменена из ссылки. ¹⁵ Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Для дальнейшего изучения курса развития Сф, их морфологические изменения были также следуют покадровой микроскопии. Видео-1 (день 3 до 4-й день) и видео-2 (4-й день на 5-й день) демонстрируют свое развитие в очищенных нейтрофильных культур. Эти Сф не являются приверженцем или слегка сращена с ограниченными возможностями передвижения и активно поглощают окружающие нейтрофильных остатки и мусор. В видео-3, движение моноцитов и G ^ Мф сравнивается в смешанном моноциты / нейтрофильной культуры. Активно ползает М ^ (слева, непомеченная клеток). Сф (справа), ярко-PKH 26 меченых клеток.

Видео-1: Демонстрирует создание гигантских фагоцитов в Очищенная ПМН культур в дни 3 - 4 по времени покадровой микроскопии. Нейтрофилы следовали вверх в культуре с самого первого дня от 3 до 4-го дня по времени покадровой microscopy.The системы микроскопии покадровой состоит из перевернутого моторизованной флуоресцентного микроскопа, и B / W CCD камера высокого разрешения, с на стадии инкубатора. Изображение Приобретение захват покадровой было принято через каждые 10 мин. Первоначально опубликовано в ссылке ¹⁴ Пожалуйста , нажмите сюда , чтобы просмотреть это видео.

Видео-2: Демонстрирует создание гигантских фагоцитов в очищенном ПМН культуры на дни 4 - 5 титаномя покадровой Микроскопия. Нейтрофилы прослежены в культуре с 4-го дня до 5-й день по покадровой микроскопии. Система микроскопии замедленной состоит из перевернутого моторизованной флуоресцентного микроскопа, и B / W CCD камера высокого разрешения, с на стадии инкубатора. Изображение Приобретение захват покадровой было принято через каждые 10 мин. Пожалуйста , нажмите сюда , чтобы просмотреть это видео.

Видео-3: Гигантский фагоцитарной и макрофагами разработан в сотрудничестве культуры. Моноциты / нейтрофилы совместно культуры последовали вверх от 4-го дня до 5-й день по покадровой микроскопии. Моноцитов макрофагов (слева); яркий (РКН-26 окрашенной клетки) нейтрофилы происхождения гигантский фагоцитов (справа). Система покадровой микроскопии для видео состоит из перевернутого моторизованной флуоресцентного MICRoscope, и высокое разрешение B / W CCD камера, с на стадии инкубатора. Изображение Приобретение захват покадровой было принято через каждые 10 мин. Первоначально опубликовано в ссылке ¹⁴ Пожалуйста , нажмите сюда , чтобы просмотреть это видео.

Экспрессия маркеров в гигантских фагоцитов

Нейтрофильный происхождение G ^ была подтверждена положительной экспрессии следующих маркеров нейтрофильных CD66b / CD63 / МРО / NE / CD15 (Рисунок 6). Сф также выразил НАДФН - оксидазы поглотитель рецепторы oxLDL - CD68 и CD36, и содержали вакуоли LC3B-покрытием и агрегатов (обозначаемого Вестерн - блоттинга как LC3BII ^15), демонстрирующий наличие аутофагии маркера. Тем не менее, они были отрицательными для моноцитов линии (CD14, CD16 и CD163) и dendritКлетки IC (CD1c и CD141) маркеры, предполагая, что Сф не возникало загрязнять моноцитов.

Рисунок 6: Выражение различных маркеров для нейтрофилы, моноциты и дендритные клетки в гигантском фагоцитов (Сф) через 7 дней в культуре. Положительная экспрессия нейтрофилами специфических гранул маркера CD66b, азурофильных гранулы маркеры CD63 и MPO, эластазы нейтрофилов и CD15. Отрицательное выражение для дендритных CD1c и CD141 маркеров и маркеров моноцитов линии дифференцировки CD14, CD16 и CD163. Кроме того, Сф выразил аутофагии маркер LC3B, Мусорщик рецепторов CD68 и CD36 и NADPH оксидазы субъединиц gp91-phox / P22-phox субъединиц. Ядра окрашивали DAPI, и образцы анализировали с помощью конфокальной микроскопии. Эта цифра была изменена из ссылок. ¹⁴ р>, ¹⁵ Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Функции - G ^ NADPH оксидазы активации, ROS Производство и фагоцитоза:

Фагоцитоз латексных шариков и опсонизированным зимозаном была очевидна в G ^. Сф также генерируется базальную ROS (фиг.7а), и ответ на зимозана и РМА стимуляции окислительного всплеска (рис 7В-D). Однако, в отличие от моноциты или нейтрофилы, Сф генерироваться ROS также в ответ на стимуляцию oxLDL и окрашивали масляным красным O (рис 7В, F). Следует отметить, что лечение свежих нейтрофилов с ингибитором НАДФН-оксидазы - DPI, не только ингибирует ROS производства, но и рформирование revented Сф в культуре, предполагая, что передача сигналов ROS имеет важное значение для формирования Сф. ^{14, 15}

Рисунок 7: окислительный взрыв, фагоцитоз и oxLDL Усвоение гигантскими фагоцитов (Сф). Производство (A) Базальный ROS проявляется в лизосомах G ^. (B) производство ROS в ответ на окисленного LDL (oxLDL), РМА и зимозан (частицы зимозаном четко указано). (C) тетразола (NBT) тест в G ^ , показывающий активность дыхательного взрыва без и с PMA (слайды неокрашенными, но вставки окрашивают мая Grunwald-Гимзе). (D) NBT испытания и май Грюневальд-Гимза окрашенных Сф с PMA и РМА / DPI , который тормозится НАДФН - оксидазы и ROS. (Е) Фагоцитоз LАТЕХ и IgG-опсонизированным зимозаном в PKH-26 (красный) окрашенных клеток. Окрашивание (F) Масло Красный O в необработанном и oxLDL обрабатывали Сф. Эта цифра была изменена из ссылок. ^{14, 15} Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Переселение ПМН Через эндотелиальных клеток

Для того , чтобы выявить потенциальные нейтрофилы субпопуляции , которые могут перерасти в G ^, миграцию нейтрофилов через монослоев эндотелиальных клеток определяли (рис 8а). Через 90 мин 62,3 ± 12,2% от нейтрофилах переселили через эндотелиальные клетки по отношению к IL-8 в нижнем отсеке, Следует отметить, что Сф положительно для CD66b / CD15 / LC3B развитой только от переселилась населения нейтрофилов , тогда как клетки , которые из немигрирующим нейтрофилы фракции были меньше по размеру , так и отрицательные для нейтрофильных маркеров CD66b / CD15 (Рисунок 8B, 8C) ,

Рисунок 8: Влияние IL-8-зависимой ПМН переселении Через эндотелиальных клеток на гигантских фагоцита (Сф) образование. (А) Схема , иллюстрирующая нейтрофильной переселении анализа через монослои клеток эндотелия (ЭКС) по отношению к IL-8. Этот анализ можно рассматривать в качестве модели для нейтрофилов набора до острых воспалительных участков. (B - C) В миграции клеток анализа (указанного в протоколе 3), переселяется (B) и не мигрирующий (C) нейтрофилы гидроразрывации культивировали в течение семи дней без факторов роста (как в протоколе 1). Затем клетки центрифугировали на предметных стеклах и анализировали с помощью конфокальной микроскопии. Фиксированные клетки окрашивали CD66b (красный), LC3B (зеленый) и CD15 (красный). Ядра окрашивали DAPI (синий). Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Обсуждение

Гигантские фагоциты (Сф) представляют собой новое определение субпопуляции нейтрофильных клеток, полученных, выражающих основные и специфические нейтрофильные маркеры, такие как CD66b / CD15 / CD63 / MPO / NE. Этот тип нейтрофильного происхождения фагоцитов не было описано в литературе ранее. В отличие от нейтрофилов, которые недолговечны и апоптозу, Сф являются аннексина-V-отрицательных и отобразить увеличенный срок службы. Тем не менее, как и нейтрофилы, Сф также усваивают частицы и производят NADPH-оксидаза-зависимого ROS в ответ на эти частицы и РМА. Тем не менее, их способности усваивать OxLDL и, следовательно, производить ROS уникальные особенности G ^. ¹⁴

Показано, целый ряд факторов, чтобы повлиять на их развитие в культуре. Отсутствие внешних цитокинов или факторов роста в среде для роста имеет важное значение (в частности, GM-CSF, / ИЛ-4). Тем не менее, нейтрофилы миграция в IL-8 оказался дискриминационный фактор между теми, что устрскрывшийся в G ^ и те, которые не сделали. Кроме того , интернализация мусора , возникающего из апоптотических нейтрофилов, экспрессия аутофагии белков (LC3B) и функциональной НАДФН - оксидазы, были показано, что крайне важно для их развития, так как их ингибирование предотвращено образование Сф (рисунок 1). По-видимому, развитие этих гигантских клеток, возникающих из нейтрофилов отличается от того, характеризующего образованию гигантских клеток в моноциты / макрофаги линии. Последняя форма мульти-зарождаются гигантские клетки , связанные с различными хроническими воспалительными заболеваниями, ^{20, 21} , тогда как нейтрофильный Сф , описанные здесь развиваются через autophagocytosis, на поглощение клеточные остатки и остаются в основном моно-зарождаться на протяжении всего их развития, ¹⁴ (редко , однако, иногда второй ядро может наблюдаться). Кроме того, ряд управлений установили их происхождение нейтрофильный: (1) expression специфических маркеров neutropilic и отсутствие дендритных и моноцитарного линии дифференцировки маркеров, (2) их тормозится развитие в моноцитах / ПМН сокультурах, (3) их различные образцы движения в культуре из макрофагов (о чем свидетельствует ячейки изображения и времени живой -lapse микроскопия), ¹⁴ (4) свет их присоединение к пластиковой посуде и (5) их развитие из чистого CD15 ⁺ / CD14 ^- ПМН , приобретенных с помощью проточной цитометрии.

Некоторые из функций , определенных в лабораторных условиях может дать нам подсказки относительно их потенциальных функций в естественных условиях. Например, способности G ^ потреблять большое количество нейтрофильных гранул и мусора, наличие крупных вакуолей, а выражение LC3B - аутофагия белка , который способствует уменьшению воспаления через регуляторных взаимодействий с врожденными путей иммунной сигнализации, ²² - все из которых поддержка поглощающие способности. Как таковойЭти данные также показывают, что Сф может функционировать при воспалительных участках, где система М ^ / DC является недостаточным или перегружены, и, таким образом, внести свой вклад в разрешение воспаления. Это понятие может быть подтверждается тем фактом, что в смешанных культурах моноцитов / нейтрофильных развитие Сф затруднено. ¹⁴ Кроме того , учитывая , что Сф выразить oxLDL мусорщик рецепторов (CD36, CD68), усваивают oxLDL, и производят ROS в ответ на это, может свидетельствовать о том , что они участвуют в атеросклеротических процессах для разрешения воспаления. Так как Сф разработаны только из нейтрофилов, которые мигрировали в сторону IL-8 и трансмиграции нейтрофилов через эндотелиальные монослои к IL-8 представляет собой набор нейтрофилов на острых воспалительных очагов, эта находка также может поддерживать противовоспалительными функции. И наоборот, производительность G ^ в некоторых воспалительных состояний может позволить им выполнять зернистых составляющие и ROS, таким образом, способствуя впоследовательны воспаление и повреждение тканей. ²⁰ Тем не менее, в целом, их аутофагической способности показывают , что Сф, вероятно , участвуют в снижении воспалительной реакции , а не увековечить его.

Интересно, мы недавно выявили наличие в G ^ атеросклеротических бляшек человека. (в процессе подготовки). Тем не менее, большое количество вопросов еще предстоит разгадать. Например, являются ли Сф про- или противовоспалительным? Каковы факторы, определяющие их формирование и функции в пробирке или в естественных условиях? Какие конкретные субпопуляции нейтрофилов является их клеток-предшественников, что способствует их развитию в G ^? Являются ли они связаны с определенными патологиями и какие? Коллективно, создает интересные вопросы относительно их происхождения и потенциальных функций.

Однако критические шаги и подводных камней в рамках протокола следует иметь в виду. Важным шагом в развитии Сф Iс культивированием чистые нейтрофилы в среде, лишенной цитокинов, факторов роста или антибиотиков. Другим важным шагом является исключаем, что Сф развиваются из загрязняющими моноцитов и выяснить происхождение нейтрофильный G ^. Таким образом, после разделения крови по ступенчатом градиенте, нейтрофилы дополнительно подвергали дополнительной стадии очистки с помощью проточной цитометрии с использованием гранулоцитарного стробирования и CD15 ⁺ / CD14 ^- маркеры. Разработанный Сф полученный из нейтрофилы, которые были дополнительно очищены с помощью проточной цитометрии с разделением не отличались от тех, которые не были подвергнуты этой стадии очистки. Таким образом, большинство экспериментов проводились без проточной цитометрии стадии очистки из-за дополнительной потери клеток. Следует отметить, что в некоторых редких случаях были отмечены некоторые эозинофилов в культуре. Их размер остается неизменным на протяжении всего периода культивирования. Следует также отметить, что, хотя существует целый ряд методовдля разделения нейтрофилов из крови человека, описанный здесь метод является единственным методом, мы использовали, и поэтому мы не можем сравнивать развитие Сф другими доступными методами для разделения нейтрофилов.

Основным ловушкой при исследовании Сф является результатом неспособности получить достаточное количество чистой популяции Сф подходит для различных биохимических анализов. Это в принципе невозможно в условиях проводились наши эксперименты. Во-первых, выход G ^ является низкой. От 1,0 × 10 ⁶ ПМН засевали приблизительно 100 - 200 Сф развиваться после семи дней в культуре, в зависимости от донора крови. Во-вторых, это в основном трудно в данный момент, чтобы отделить развитую Сф в культуре от остающегося нейтрофильной мусора в чашке. Эти ограничения сделали практически невозможным анализировать клетки с помощью биохимических и молекулярных методов биологии. Таким образом, этот протокол ориентирован на описание идентификации и функции Сф с помощью светаи конфокальной микроскопии. Их морфологическое преобразование из нейтрофилов в G ^ в культуре также следуют клетки живого изображения и времени покадровой микроскопии. ¹⁴ По- видимому, гораздо большие объемы крови могут быть необходимы для осуществления биохимических или молекулярных методов биологии и преодолеть низкий выход , полученный и отделения жизнеспособного Сф от мусора нейтрофилов в блюдо.

Таким образом, мы недавно описал впервые развитие в культуре G ^, субпопуляции долгоживущих фагоцитов нейтрофильного происхождения. Таким образом, это единственный метод, доступный в настоящее время для получения Сф в культуре, хотя два основных ограничения, упомянутые выше, должны быть преодолены (низкий выход G ^, полученного в культуре и неспособность отделить развитую Сф от нейтрофильной мусора в культуре блюдо). Тем не менее, их подготовка и идентификация, представленные в этом протоколе, является эссенциял для ученых, заинтересованных в воспалительных реакциях и нейтрофилов биологии и пластичности, в целях дальнейшего изучения потенциального значения и функции G ^.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sterile scalp vein set (21GX3/4)	Bio Diagnostics Ltd.	# 20080312	A strile needle for venipancture
VACUETTE HOLDEX Single-Use Holder PP	Greiner Bio-One	# 450263	For securing during venipuncture
VACUETTE Tube K3E K3EDTA (16 x 100/9 mL)	Greiner Bio-One	# 455036	Sterile tube for blood collection
Nunclon MultiDish (24 well x 1 ml)	Thermo Scientific	# 142475
Polypropylene conical centrifuge tube (50 ml)	Greiner Bio-One	# E14103PJ
Transwell-24 well (transmigration assay)	Corning	# CA-3415	Polycarbonate membrane, 6.5 mm diameter, 3 μm pores)
RPMI-1640 medium	BioIndustries	# 01-100-1A	Do not add antibiotics
EA.hy926 (ATCC CRL2922)	BioIndustries	# CRL-2922
ATCC-formulated Dulbecco’s  Modified Eagle’s Medium	BioIndustries	# 302002	complete growth medium
Polysucrose - Histopaque1119	Sigma-Aldrich	# 1119-1	Tissue culture grade
Polysucrose - Histopaque1077	Sigma-Aldrich	# 1077-1	Tissue culture grade
Phosphate buffered saline (PBS) - ion free	BioIndustries	# 02-023-1A	Cell biology and molecular biology grade
Heat inactivated Fetal calf serum (HI-FCS)	BioIndustries	# 04-121-1B	Cell biology grade or tissue culture grade, low LPS
NaCl	Sigma	# S3014	Molecular biology grade, suitable for cell culture
Paraformaldehyde, 16%	Electron Microscopy Sciences	# 15710	Cell bology grade or tissue culture grade (only 16% PFA)
Triton X-100	Sigma-Aldrich	# 9002-93-1	Molecular biology grade
Normal Goat Serum	BioIndustries	# 04-009-1	Cell biology and molecular biology grade
Trypan blue	BioIndustries	# 031021B	Tissue culture grade
May-Grünwald	Sigma-Aldrich	# MG500	Cell biology grade-(procedure No GS-10)
Giemsa stain Kit	Sigma	# 48900	Cell biololgy grade-(procedure No GS-10)
Fibronectin	BioIndustries	# 03090105
Human Interleukin-8 (CXCL8)	PeproTech	# 200-08-5
Anti-CD14 (clone 5A3B11B5)	Santa Cruz Biotechnologies	# sc-58951	Mouse IgG2b; expressed by  monocytes
Anti-CD63 (clone MX-49.129.5)	Santa Cruz Biotechnologies	# sc-5275	Mouse IgG1; expressed by neutrophils
Anti-CD66b (clone 80H3)	AbD Serotec	# MCA216	Mouse IgG1; expressed by neutrophils
Anti-CD1c (BDCA-1) (clone AD5-8E7)	MACS Miltenyi Biotec	# 130-090-695	Mouse IgG2a; expressed by  dendritic cells
Anti-CD15 (clone MY-1)	Abcam	# ab754	Mouse IgM; expressed by neutrophils
Anti-Cytochrome b-245 Light Chain (p22-phox) (clone 44.1)	BioLegend	# 650001	Mouse IgG2a; to recognize neutrophil NADPH oxidase complex
Anti-CD68	Protein Tech	# 16192-1-AP	Rabbit IgG; to recognize oxLDL scavenger receptor
Anti-LC3B	Sigma	# L7543	Rabbit IgG
Anti-Myeloperoxidase	Abcam	# ab45977	Rabbit IgG
Anti-Neutrophil elastase	Calbiochem	# 481001	Rabbit IgG
Anti-NOX2 (gp91-phox)	Abcam	# ab131083	Rabbit IgG
Anti-CD36 (SR-B3)	Novus Biologicals	# NB400-144	Rabbit IgG
Purified Mouse IgG1, κ Isotype Control (clone MG1-45)	BioLegend	# 401401	Antibody used as isotype control
Purified Mouse IgG2a, κ Isotype Control (clone MOPC-173)	BioLegend	# 400263	Antibody used as isotype control
Normal rabbit IgG	Santa Cruz Biotechnologies	# sc-2027	Antibody used as isotype control
CF488A Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Biotium	# 20012	Anti-Rabbit IgG with the green fluorescent dye CF488A
CF647 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)	Biotium	# 20043	Anti-Rabbit IgG with the red fluorescent dye CF647
CF488A Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Biotium	# 20010	Anti-Mouse IgG with the green fluorescent dye CF488A
CF647 Goat Anti-Mouse IgG (H+L)	Biotium	# 20040	Anti-Mouse IgG with the red fluorescent dye CF647
Fluorescent Mounting Medium with DAPI	Vectashield H-1000; Vector Lab Inc.	# E19-18	Nuclear staining
Confocal laser scanning microscope (LSM 700)	Carl Zeiss	Ser.# 3523000380	Plan Apo 40X immersion oil objective
Zeiss CLSM software (ZEN 2010)	Carl Zeiss MicroImaging GmbH	version 6.0	For colocalization analysis
ImageJ software	Wayne Rasband, NIH, USA	version 1.49k	For determination of cell  areas and fluorescence intensity
Light microscope (Axiovert 25)	Carl Zeiss	Ser.# 201060153	Examination of cells in culture
Centrifuge (Megafuge 1.0 R)	Heraeus Instruments	# D-37520	Cells separation from blood; cytospins preparation
Inverted fluorescent microscope (Zeiss Axio Observer Z.1)	Carl Zeiss	Ser.# 3834001470	Demonstration of giant phagocytes development
Temperature-controlled incubation system (Cube&Box)	Life Imaging Services		Temperature control system for microscopes
High resolution digital CCD camera (AxioCam HRm)	Carl Zeiss	Ser.# 117090279	For capturing high-contrast  image data from an examined cell objects
Hydrophobic barrier pen (Elite PAP Pen)	Diagnostic Biosystems	# K039	For defining cell perimeter for immunoflourescence staining