ניתוח קינמטית של חטיבה ואת הרחבת תא: כימות הבסיס הנייד של אזורי התפתחותית צמיחת הדגימה<em&gt; Zea Mays</em&gt; מותיר

Summary

Quantifying cell division and expansion is of crucial importance to the understanding of whole-plant growth. Here, we present a protocol to calculate cellular parameters determining maize leaf growth rates and highlight the use of these data for investigating molecular growth regulatory mechanisms by directing developmental stage-specific sampling strategies.

Abstract

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of these analyses is of crucial importance, because growth is driven by cell division and cell elongation. Kinematic analysis represents a methodology to quantify these two processes. Moreover, this technique is easy to use in non-specialized laboratories. Here, we present a protocol for performing a kinematic analysis in monocotyledonous maize (Zea mays) leaves. Two aspects are presented: (1) the quantification of cell division and expansion parameters, and (2) the determination of the location of the developmental zones. This could serve as a basis for sampling design and/or could be useful for data interpretation of biochemical and molecular measurements with high spatial resolution in the leaf growth zone. The growth zone of maize leaves is harvested during steady-state growth. Individual leaves are used for meristem length determination using a DAPI stain and cell-length profiles using DIC microscopy. The protocol is suited for emerged monocotyledonous leaves harvested during steady-state growth, with growth zones spanning at least several centimeters. To improve the understanding of plant growth regulation, data on growth and molecular studies must be combined. Therefore, an important advantage of kinematic analysis is the possibility to correlate changes at the molecular level to well-defined stages of cellular development. Furthermore, it allows for a more focused sampling of specified developmental stages, which is useful in case of limited budget or time.

Introduction

ניתוח צמיחה תלוי סט של כלים המשמשים בדרך כלל על ידי מדעני צמח לתאר הבדלי צמיחה ו / או תשובות פנוטיפי נקבע גנוטיפ לגורמים סביבתיים. הם כוללים מדידות גודל ומשקל של הצמח כולו או איבר וחישובי שיעורי צמיחה לחקור את המנגנונים של צמיחה. צמיחת איברים נקבעת על ידי חלוקת תא והרחיב ברמה התאית. לכן, כולל הכימות של שני תהליכים אלו בצמיחת המנתח הוא מפתח להבנת הבדלים בצמיחה כולו באיברי ^1. כתוצאה מכך, חשוב להיות בעל במתודולוגיה לקבוע פרמטרי צמיחה הסלולר כי הוא יחסית קל לשימוש על ידי מעבדות ללא התמחות.

ניתוח קינמטית כבר קמה, כגישה מתן מסגרת רבת עוצמה לפיתוח מודלים של גידול איברים ^2. הטכניקה כבר אופטימיזציה עבור מערכות לינאריות,כמו שורשי ארבידופסיס thaliana ועלי monocotyledonous, אלא גם למערכות שאינן ליניארי, כגון עלי dicotyledonous ^3. כיום, מתודולוגיה זו נמצאת בשימוש יותר ויותר כדי ללמוד איך גנטי, הורמונלית, התפתחותיים, וגורמים סביבתיים משפיעים חלוקת תא והרחיב באיברים שונים (טבלה 1). יתר על כן, הוא גם מספק מסגרת לקשר תהליכים תאיים לתקנות ביוכימיים, מולקולריות, ופיזיולוגיים הבסיסיות שלהם (טבלה 2), למרות מגבלות שניתן להטיל לפי גודל איבר וארגון מרחבי טכניקות הדורשות כמויות גדולות יותר של חומר צמחי (למשל, המטבוליט מדידות, פרוטאומיקה, וכו ').

עלי Monocotyledonous, כגון התירס (Zea Mays) עלה, מייצגים מערכות ליניאריות שבו תאים להעביר מהבסיס של העלה כלפי הקצה, ברצף עוברים דרך אזור meristem ואת ההתארכות להגיע הבוגרתאֵזוֹר. זה עושה את זה מערכת מודל אידיאלית עבור מחקרים כמותיים של התבניות המרחביות של צמיחה ^4. יתר על כן, עלי תירס יש אזורי צמיחה גדולים (meristem אזור התארכות פורשים כמה סנטימטרים ⁵⁾ ולספק אפשרויות ללימודים ברמות ארגוניות אחרות. זה מאפשר חקירת מנגנוני הוויסות (המשוערים) שליטת חלוקת תא ורחב, לכמת ידי ניתוח kinematic באמצעות מגוון של שיטות מולקולריות, מדידות פיסיולוגיות, וגישות ביולוגיה של תא (טבלה 2).

כאן, אנו מספקים פרוטוקול לביצוע ניתוח kinematic בעלי monocot. ראשית, נסביר כיצד לבצע ניתוח נכון של שני חלוקת התא ואת התארכות התא כפונקציה של המיקום לאורך ציר עלה וכיצד לחשב פרמטרים קינמטיקה. שנית, אנחנו גם להראות איך זה יכול לשמש כבסיס לעיצוב דגימה. כאן, אנו דנים בשני מקרים: דגימה ברזולוציה גבוהה ד ממוקד דגימה, המאפשר פרשנות נתונים משופרות ולחיסכון בזמן / כסף, בהתאמה.

סקירת טבלת 1. קינמטיקה מנתח שיטות כימות של חלוקת תא והרחבה באיברים שונים.

אֵיבָר	התייחסות
עלי monocotyledonous	16, 20, 21, 22
טיפים שורש	2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29
עלי dicotyledonous	21, 30, 31
לירות meristem הפסגה	32

סקירת טבלת 1. קינמטיקה מנתח שיטות כימות של חלוקת תא והרחבה באיברים שונים.

ther.within-page = "1">

קישור טבלה 2. בין תהליכים תאיים לכמת ידי ניתוח kinematic לרגולציה שלהם ברמה המולקולרית. הפניות למחקרים שונים מקשרים כימות של תהליכים תאיים לתוצאות מבחני ביוכימיים ומולקולריים במינים ואיברים שונים. Endotransglucosylase Xyloglucan (XET), malondialdehyde (מד"א), קינאזות תלויות-ציקלין (CDK). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של הטבלה.

Protocol

הערה: הפרוטוקול הבא לניתוח קינמטיקה תקף רק עלים במהלך הצמיחה יציבה. זה מצביע על שיעור התארכות עלה יציב ודפוסי מרחב של אורך תא והתרחבות עלה במהלך תקופה של מספר ימים ^6.

צמח צמיחת 1. ומדידות של דרג התארכות ליף (הימלר)

1. בחר עלו בצמיחה יציבה ואת שלב ההתפתחותי של עניין.
   הערה: יש הבדל בין צמיחה היציבה וצמיחה חוזרת, מה שמרמז תבניות המרחביות דומות על עלים רצופים על אותו ציר. במהלך השלבים המוקדמים של צמיחת שתיל, עלים רצופים בדרך כלל גדלים יותר ויותר מהר בגלל הגודל הגובר של אזור צמיחת ^7. למרות כמה תפקידים עלה גבוה יכול להיות דפוס צמיחה דומה ^8, זהו שלב חולף העשויים להיות מושפעים על ידי טיפולים תחת חקירה. לכן חשוב להשוות קווי tr eatments ורק על העמדה עלה אותו, למרות שזה ניתן לפתח בזמן אחר. אפילו בקצב התארכות מתמיד, פרופיל שיעור הצמיחה אינו בהכרח זהה בשלבי התפתחותיים שונים. לכן, חשוב לנתח העלים באותו שלב התפתחותי ^8, בדרך כלל מוגדר במספר ימים לאחר הופעתה.
2. כדי לבצע ניתוח kinematic מלא צמיחה עלה ב monocots, לגדול לפחות 15 צמחים עבור כל טיפול ו גנוטיפ בתנאים מבוקרים בחדר צמיחה.
3. באותו הזמן העלה של עניין מופיע (הופעתה מן במערבולת של עלים שמסביב), להתחיל למדוד את האורך של העלה יומי עם סרגל עד העלה מורחב מלא (האיור 1i). אורך ליף מרמז על אורך מרמה הקרקע עד קצה העלה. היזהר שלא לשבור או לפגוע עלה, כיוון שזה עלול לשנות את צמיחתה.

בתשובה לשאלה 1 "src =" / files / ftp_upload / 54,887 / 54887fig1.jpg "/>
איור 1:. סקירה סכמטי של ניתוח kinematic עלי תירס העלה של ריבית נמדד עם שליט במשך שלושה ימים רצופים כדי לחשב את שיעור ההתארכות ליף (הימלר). לאחר מכן, העלה שנקטף וקטע שלושה סנטימטר משמש לקביעת גודל meristem. הדבר נעשה על ידי מדידת אורך מהבסיס עד הדמות mitotic הדיסטלי ביותר לאחר מכתים DAPI. (א) דוגמאות של דמויות mitotic שגשוג ו (ב) דמויות mitotic מכוננות. אחד עשרה הסנטימטרים הראשונים מהבסיס עלה בצד השני של הווריד באמצע משמשים לחתוך עשרה קטעים חד-סנטימטר למדידות אורך תא. מדידות אלה מספקים את הבסיס ליצירת פרופיל אורך התא, המשמש כדי לקבוע את אורך התא הבוגר _(מחצלת l) ואורך תאים עוזב את meristem _(div l). ה הימלר _מחצלת l משמשים לחישוב שיעור ייצור תאים (P), בעוד _div L ו- L _mer משמשים כדי לחשב את מספר התאים meristem (N _mer). בתורו, P ו- N _mer משמשים לחישוב שיעור חלוקת התא הממוצע (D), שהוא ההופכי של משך מחזור התא _(ג T). חצים של אותו הצבע עולים פרמטרים המשמשים לחישוב הפרמטר הבא על החצים האלה. ברי סולם = 40 מיקרומטר. מספרים רומים משמשים להתייחס להליכים ספציפיים ניסיוני כמתואר בפרוטוקול. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

קציר 2.

1. בשלב ההתפתחותי של עניין (למשל, ביום השלישי לאחר הופעתה), לבחור לפחות חמש p נציגlants מהאצווה שעליו לנהל את ניתוח kinematic. המשך מדידת שאר הצמחים כמוסבר בשלב 1.3 כדי לקבוע את אורך הדף האחרון.
2. חותכים את החלק מעל הקרקע של המפעל. כדי לשמור על חלק meristematic שלם, לחתוך קרוב ככל האפשר אל השורשים (איור 1ii).
3. החל העלים החיצוניים, להסיר את כל העלים עד העלה עניין ידי unrolling אותם אחד בעדינות על ידי אחד. במידת צורך, להסיר כמה מילימטרים נוספים מהבסיס לנתק את העלים. כמו כן להסיר את עלי איפקס קטנים וסגורים על ידי עלה העניין (איור 1iii).
4. חותכים מקטע 3 ס"מ, החל מבסיס בצד אחד של וריד באמצע, ולאחסן אותו צינור 1.5 מ"ל מבחן מלא 3: 1 (v: v) אתנול אבסולוטי: פתרון חומצה אצטית (זהירות: ללבוש כפפות) ב 4 ° C. במשך 24 שעות עד מספר חודשים (איור 1iv). קטע זה ישמש מאוחר יותר כדי לקבוע את האורך של meristem.
5. מ הבצד השני של הווריד, לחתוך קטע 11 ס"מ מבסיס (איור 1 נ) ולמקם אותו בתוך שפופרת 15 מ"ל מלא אתנול אבסולוטי ב 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 6 שעות כדי להסיר פיגמנטים (איור 1 vi).
   הערה: בהמשך, השתמשו רק 10 הסנטימטרים הראשונים כדי לקבוע את פרופיל אורך תא (ראה דיון).
6. חדשו את אתנול אבסולוטי לסיבוב נוסף של ניקוי על 4 מעלות צלזיוס במשך לפחות 24 שעות (איור 1vi).
7. לבסוף, להחליף את אתנול האבסולוטי עם חומצה לקטית טהורה (זהירות: ללבוש כפפות) לניקוי ואחסון ב 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות או עד לשימוש נוסף (איור 1vi).

3. מדידות אורך meristem

1. הכן חיץ שטיפה המכילים נתרן כלורי 50 מ"מ (NaCl), 5 מ"מ חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA; זהירות: ללבוש כפפות) ו -10 מ"מ טריס (hydroxymethyl) חומצה aminomethane-הידרוכלורית (טריס-HCl; pH 7).
2. קח את קטע 3 ס"מ בסעיף 2.4 וכן הלאהAK אותו למאגר במשך 20 דקות (איור 1vii).
3. בזמן ההמתנה, להשתמש חיץ שטיפה להכין פתרון מכתים 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) של 1 מיקרוגרם / מ"ל, שמירה על אותה על הקרח בחושך.
4. כתם הגרעינים ידי צבת במגזר meristem במשך 2-5 דקות בתמיסה המכתימה DAPI. עבודה על הקרח בחושך (איור 1vii).
5. בדקו אותות קרינה על ידי הרכבה במגזר במהירות על כוס מיקרוסקופיה והמריחה עם מכסה זכוכית. תאי אפידרמיס צריכים להראות קרינה, בעוד שכבות תאי הבסיס לא צריכות.
6. אם המכתים אינו מספיק, לשים במגזר בחזרה הפתרון המכתים DAPI עבור כמה דקות נוספות.
7. כדי לעצור את המכתים, הר המגזרים בטיפת שטיפת חיץ בשקופית מיקרוסקופיה ומכסה כיסוי זכוכית.
8. השתמש מיקרוסקופ מצויד קרינת UV בהגדלת 20X, המאפשר הדמיה של כ -1,000 epidermאל תאים בבת אחת. גלול לאורך קטע ולחפש דמויות mitotic שגשוג (metaphase, anaphase, telophase, ו cytokinesis), אך להימנע חלוקת התא המכונן של (1viii איור) בפיתוח הפיוניות ^9. גדר שם דמות mitotic הדיסטלי ביותר ממוקמת.
9. לקבוע את אורך meristem על ידי מדידת המרחק בין הבסיס של העלה והדמות mitotic ביותר דיסטלי אפידרמיס. השתמש תמונות תוכנה לניתוח (למשל, ImageJ) כדי למדוד את אורכו של מסגרת התמונה.
   1. לספור את מספר המסגרות שמכסות את אורך meristem המלא (מהבסיס עלה לנתון mitotic הדיסטלי ביותר) ו להכפיל את המספר הזה לפי אורך מסגרת אחת כדי לקבל את אורך meristem המלא (1ix איור).

4. פרופיל אורך תא

1. קח במגזר המאוחסן חומצה לקטית (שלב 2.5) ולמקם אותו בזהירות על הספסל. חותכים את השנינות מגזריםחה אזמל ב 10 מקטעים של 1 ס"מ כל אחת (איור 1x).
2. הר המגזרים עלו הרצופים בשקופית מיקרוסקופ ב טיפה קטנה של חומצה לקטית. הקפד להתמודד באופן עקבי גם את adaxial או למעלה בצד abaxial. באופן עקרוני, אין העדפת צד מסוים.
3. השתמש מיקרוסקופ מצויד התערבות הפרש לעומת זאת אופטיקה (DIC) לנתח את המגזרים, החל מבסיס העלה. מדוד עם תוכנת ניתוח התמונה אורך תאי אפידרמיס לשכפל 20 לפחות ב קבצים סמוכים ישירות לקבצי הפיוניות על מנת לבחור את סוג התא אותו בעקביות.
   1. האם זה על עמדות ברווחים שווים לאורך אחד ממגזרי (4 עמדות לכל להספיק קטע), ולוודא כדי לרשום את המיקום המתאים לכל מדידה לאורך (1xi איור) עלה.
4. לקבוע את אורך התא הממוצע בכל מ"מ לאורך הציר עלה באמצעות p חלקת פולינום מקומיrocedure, ויושם R-סקריפט (איור 1xii; קובץ משלים 1).
   הערה: The-סקריפט R מספק סדרה של נתונים עם הגדלת חלקה. כמות החלקה הנדרשת היא שרירותית ו אידיאלי צריך רק להסיר את הרעש המקומי, אך לא להשפיע על עקומת הכולל. הקפד להשתמש באותה כמות של החלקה עבור כל הדגימות בתוך בניסוי אחד.
5. ממוצע אורך תא במיקום כל בין צמחים ובעלי לחשב את סטיית התקן ליצור פרופיל אורך התא לאורך ציר עלה.

5. חישובים של פרמטרים קינמטית (ראה משלים קובץ 2)

1. חשב את הימלר על ידי לקיחת השינוי באורך עלה בין שתי נקודות זמן רצופות (למשל, 24 שעות, כמו בשלב 1.3) וחלוקתו את מרווח הזמן.
2. חשבתי את אורך צמיחת האזור _(GZ L) המתאים דיסטלי עמד מהבסיס שבו תאים מגיעים 95% של ce הבוגרת שלהםאורך ll על פרופיל אורך תא smoothened.
   1. קח לכל עמדה על% 95 פרופיל אורך תא smoothened של הממוצע של כל אורכי התא הבאים עמדה (איור 2).
   2. השוואת אורכי תא smoothened (שלב 4.4) עם אורך תא מחושב 95% בכל אחת מעמדות. החל מהבסיס של העלה, אזור הגידול ומסתיים במצב שבו אורך התא בפועל שווה 95% של אורכי התא הבאים (איור 2; לראות משלי נתונים 2).

איור 2:. קביעת מועד לסיום לאזור הצמיחה meristem: במיקום מצוין עם כוכב אדום, גודל התא בפועל הוא קטן מ -95% (קו מקווקו אדום) של גודל התא הממוצע של כל התאים הבאים עמדה זו (אדום מוצק קַו). סופו של אזור הגידול _(GZ L; מצוין עם ablue כוכב) ממוקם שבו 95% (קו כחול מנוקד) של גודל התא הממוצע של כל התאים הבאים עמדה זו (הקו הכחול מוצק) שווה לגודל התא בפועל. אגף אזור (D), אזור התארכות (E), ואת האזור הבוגר (M). חצים המקווקווים מציינים ההתכנסות בין הגודל המקומי ו -95% ביחס לגודל הממוצע על החלק הדיסטלי של העלה בעת מעבר מהעמדות הבסיסיות אל קצה העלה. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.

3. חשב את אורך אזור התארכות (L _אל) כהפרש בין אורך של אזור הגידול _(GZ L) ואת גודל meristem (L _mer; נקבע בשלב 3).
4. חשבתי את אורך התא הבוגר _(מחצלת l) כמו אורך תא הממוצע באזור הבוגר.
5. מחלקים את הימלר ידי _מחצלת l כדי להשיג אתשיעור ייצור תאים (P).
6. לחשב את מספר התאים באזור התארכות (N _אל) כהפרש בין _GZ N ו- N _mer. מספר תאי meristem _(mer N) שווה למספר המצטבר של תאים הממוקמים במרווחים המתאימים meristem. מספר תאים באזור צמיחה _(GZ N) שווה למספר המצטבר של תאים הממוקמים במרווחים החופף את אזור הגידול.
7. חשב את קצב חלוקת התא הממוצע (ד) כפי _mer P / N. משך מחזור התא _(ג T) שווה ln (2) / D.
8. לחשב את הזמן באזור ההתארכות (T _אל) על ידי חלוקת N _אל ידי P. השעה באזור חלוקה שווה log _{2 (mer} N) * _ג T. אורכו של תאים עוזב את meristem _(div l)שווה אורך תא מהפרופיל אורך תא smoothened בסוף של meristem.
9. חשב את קצב התפשטות תאים הממוצע (R _אל) באמצעות הנוסחה הבאה: ln _(מחצלת l) -ln _(div l)] / T _אל.

תוצאות

הנה, אנחנו מראים השוואה בין צמחים מושקים (שליטה, 54% תכולת מים בקרקע, (SWC)) וצמחים נתונים בתנאי עקת בצורת (בצורת, 34% SWC) במונחים של צמיחת העלה שלהם. כל הצמחים גדלו בתא צמיחה בתנאים מבוקרים (16 שעות ביום / 8 שעות בלילה, 25 ° C / 18 ° C יום / לילה, 300-400 μEm ^-2 שניות

Discussion

ניתוח kinematic מלא על עלי תירס מאפשר קביעת הבסיס הסלולר של צמיחה עלה ומאפשר את העיצוב של אסטרטגיות דגימה יעילות. אף על פי הפרוטוקול הוא פשוט יחסית, קצת זהירות מומלצת השלבים הקריטיים הבאים: (1) חשוב לנתק את העלים הצעירים, סגורים (שלב 2.3) מבלי לפגוע meristem, מאז קביעת אורך meristem (ש?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pots	Any	Any	We use pots with the following measueres, but can be different depending on the treatment/study : bottom diameter: 11cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot.
Planting substrate	Any	Any	We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study.
Ruler	Any	Any	An extension ruler that covers at least 1,5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants.
Seeds	Any	NA	Seeds can be ordered from a breeder.
Scalpel	Any	Any	The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.
15 ml falcon tubes	Any	Any	The 15 ml falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid.
Eppendorf tubes	Any	Any	The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution.
Gloves	Any	Any	Latex gloves, which protect against corrosive reagents.
Acetic acid	Any	Any	CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3
Absolute ethanol	Any	Any	CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion
Lactic acid >98%	Any	Any	CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1
Sodium chloride (NaCl)	Any	Any
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Any	Any	CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity – Single exposure, category 3
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl)	Any	Any	This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract.
4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI)	Any	Any	Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation.
Ice	Any	NA	The DAPI solution has to be kept on ice.
Fluorescent microscope	AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other		Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length.
Microscopic slide	Any	Any
Cover glass	Any	Any
Tweezers	Any	Any	Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.
Image-analysis software	Axiovision (Release 4.8) from Zeiss	NA	The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well.
Microscope equipped with DIC	AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other		Any  microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths.
R statistical analysis software	R Foundation for Statistical Computing	NA	Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/
R script	NA	NA	We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC.  Kernel Smoothing: Chapman & Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquire with the corresponding author. We have versions for Mac and Windows.