Cinématique Analyse de la division cellulaire et Expansion: Quantifier la base cellulaire de la croissance et du développement d&#39;échantillonnage Zones dans<em&gt; Zea mays</em&gt; Feuilles

Résumé

Quantifying cell division and expansion is of crucial importance to the understanding of whole-plant growth. Here, we present a protocol to calculate cellular parameters determining maize leaf growth rates and highlight the use of these data for investigating molecular growth regulatory mechanisms by directing developmental stage-specific sampling strategies.

Résumé

Growth analyses are often used in plant science to investigate contrasting genotypes and the effect of environmental conditions. The cellular aspect of these analyses is of crucial importance, because growth is driven by cell division and cell elongation. Kinematic analysis represents a methodology to quantify these two processes. Moreover, this technique is easy to use in non-specialized laboratories. Here, we present a protocol for performing a kinematic analysis in monocotyledonous maize (Zea mays) leaves. Two aspects are presented: (1) the quantification of cell division and expansion parameters, and (2) the determination of the location of the developmental zones. This could serve as a basis for sampling design and/or could be useful for data interpretation of biochemical and molecular measurements with high spatial resolution in the leaf growth zone. The growth zone of maize leaves is harvested during steady-state growth. Individual leaves are used for meristem length determination using a DAPI stain and cell-length profiles using DIC microscopy. The protocol is suited for emerged monocotyledonous leaves harvested during steady-state growth, with growth zones spanning at least several centimeters. To improve the understanding of plant growth regulation, data on growth and molecular studies must be combined. Therefore, an important advantage of kinematic analysis is the possibility to correlate changes at the molecular level to well-defined stages of cellular development. Furthermore, it allows for a more focused sampling of specified developmental stages, which is useful in case of limited budget or time.

Introduction

Analyse de la croissance dépend d'un ensemble d'outils qui sont couramment utilisés par les scientifiques de plantes pour décrire le génotype déterminé les différences de croissance et / ou des réponses phénotypiques à des facteurs environnementaux. Ils comprennent la taille et le poids des mesures de la plante entière ou un organe et les calculs des taux de croissance à explorer les mécanismes sous-jacents de la croissance. Croissance organique est déterminée par la division cellulaire et de l'expansion au niveau cellulaire. Par conséquent, incluant la quantification de ces deux procédés dans des analyses de croissance est essentiel pour comprendre les différences de croissance organe entier ^1. Par conséquent, il est crucial d'avoir une méthodologie appropriée pour déterminer les paramètres de croissance cellulaire qui est relativement facile à utiliser par des laboratoires non spécialisés.

L' analyse cinématique a déjà été établie comme une approche fournissant un cadre puissant pour le développement de modèles de croissance de l' organe ^2. La technique a été optimisé pour les systèmes linéaires,tels que les racines d' Arabidopsis thaliana et les feuilles monocotylédones, mais également pour les systèmes non-linéaires, tels que les feuilles dicotylédone ^3. De nos jours, cette méthodologie est de plus en plus utilisée pour étudier comment génétiques, hormonaux, développementaux et les facteurs environnementaux influencent la division cellulaire et l' expansion dans divers organes (tableau 1). En outre, il fournit également un cadre pour lier les processus cellulaires à leurs règlements biochimiques, moléculaires et physiologiques sous - jacents (tableau 2), bien que les limites peuvent être imposées par la taille des organes et de l' organisation spatiale des techniques qui nécessitent des quantités plus élevées de matières végétales (par exemple, métabolite mesures, de la protéomique, etc.).

Feuilles monocotylédones telles que le maïs (Zea mays) feuille, représentent des systèmes linéaires dans lesquels les cellules se déplacent à partir de la base de la feuille vers la pointe, en passant successivement à travers la zone de méristèmes et de l' allongement pour atteindre la maturitézone. Cela en fait un système de modèle idéal pour les études quantitatives de la configuration spatiale de la croissance ^4. De plus, les feuilles de maïs ont de grandes zones de croissance (méristème et zone d'allongement couvrant plusieurs centimètres ⁵⁾ et offrent des possibilités d'études à d' autres niveaux d' organisation. Cela permet de l'enquête sur les mécanismes de régulation (putatifs) contrôlant la division cellulaire et de l' expansion, quantifiée par analyse cinématique grâce à une gamme de techniques moléculaires, des mesures physiologiques, et des approches de biologie cellulaire (tableau 2).

Ici, nous fournissons un protocole pour effectuer une analyse cinématique dans les feuilles monocotylédones. Tout d'abord, nous expliquons comment procéder à une analyse appropriée à la fois la division cellulaire et l'élongation des cellules en fonction de la position le long de l'axe de la feuille et la façon de calculer les paramètres cinématiques. Deuxièmement, nous montrons aussi comment cela peut être utilisé comme base pour la conception d'échantillonnage. Ici, nous discutons deux cas: haute résolution d'échantillonnage d'und axée échantillonnage, permettant une meilleure interprétation des données et le gain de temps / argent, respectivement.

Tableau 1. Aperçu des analyses cinématique des méthodes de quantification de la division cellulaire et de l' expansion dans divers organes.

organe	référence
feuilles monocotylédones	16, 20, 21, 22
pointes des racines	2, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29
feuilles dicotylédones	21, 30, 31
méristème apical	32

Tableau 1. Aperçu des analyses cinématique des méthodes de quantification de la division cellulaire et de l' expansion dans divers organes.

Tableau 2. Lien entre les processus cellulaires quantifiés par l'analyse cinématique à leur régulation au niveau moléculaire. Les références à diverses études reliant la quantification des processus cellulaires aux résultats des tests biochimiques et moléculaires chez diverses espèces et des organes. Endotransglucosylase Xyloglucan (XET), malondialdéhyde (MDA), les kinases cycline-dépendantes (CDK). S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.

Protocole

NOTE: Le protocole suivant pour l'analyse cinématique est valable uniquement pour les feuilles pendant la croissance à l'état stable. Cela implique un taux d'allongement de la feuille stable et la répartition spatiale de la longueur de la cellule et à l' expansion d'une feuille au cours d' une période de plusieurs jours à ^6.

1. Croissance des plantes et des mesures de feuilles Allongement Rate (LER)

1. Choisissez une feuille en croissance stable et un stade de développement d'intérêt.
   NOTE: Il y a une différence entre la croissance à l'état stable et la croissance répétitive, ce qui implique des modèles spatiaux similaires sur les feuilles successives sur le même axe. Pendant les premiers stades de la croissance des semis, les feuilles successives croissent généralement plus rapidement en raison de la taille croissante de la zone de croissance ^7. Bien que quelques positions des feuilles supérieures peuvent avoir un modèle de croissance similaire ^8, ceci est une phase transitoire qui peut être affectée par les traitements à l'étude. Il est donc important de comparer les lignes et tr eatments strictement sur la même position de la feuille, même si elle peut se développer à un autre moment. Même à un taux d'allongement constant, le profil de taux de croissance ne sont pas nécessairement identiques à différents stades de développement. Par conséquent, il est important d'analyser les feuilles au même stade de développement ^8, typiquement défini par le nombre de jours après la levée.
2. Pour effectuer une analyse cinématique complète de la croissance des feuilles de monocotylédones, croître au moins 15 plantes pour chaque traitement et le génotype dans des conditions contrôlées dans une chambre de croissance.
3. Au moment où la feuille d'intérêt apparaît (sortie de la volute de feuilles avoisinantes), commencer à mesurer la longueur de la feuille par jour avec une règle jusqu'à ce que la lame est complètement déployée (figure 1i). Longueur de la feuille implique la longueur à partir du niveau du sol à la pointe de la feuille. Veillez à ne pas casser ou d'endommager la feuille, car cela pourrait modifier sa croissance.

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Figure 1:. Aperçu schématique d'une analyse cinématique des feuilles de maïs La feuille d'intérêt est mesuré avec une règle pendant trois jours consécutifs pour calculer le taux Allongement Leaf (LER). Ensuite, la feuille est récoltée et un segment de trois centimètres est utilisée pour la détermination de la taille du méristème. Cela se fait en mesurant la longueur de la base jusqu'à mitotique chiffre le plus distal après coloration DAPI. (A) Exemples de figures de mitose prolifératives et (B) figures mitotiques formatives. Les onze premiers centimètres de la base de la feuille de l'autre côté de la nervure centrale sont utilisés pour couper dix segments d'un centimètre pour les mesures de longueur de la cellule. Ces mesures fournissent la base pour la création du profil de la longueur de la cellule, qui sert à déterminer la longueur des cellules matures (l _mat) et la longueur des cellules en laissant le méristème (l _div). le LER et l _tapis sont utilisés pour calculer le taux de production de cellules (P), tandis que l _div et L _mer sont utilisés pour calculer le nombre de cellules dans le méristème (N _mer). À son tour, P et N _mer sont utilisées pour calculer le taux moyen de division de cellule (D), qui est l'inverse de la durée du cycle cellulaire (T _c). Les flèches de la même couleur indiquent des paramètres qui sont utilisés pour calculer le paramètre suivant sur ces flèches. Les barres d'échelle = 40 pm. Les chiffres romains sont utilisés pour se référer à des procédures expérimentales spécifiques décrites dans le protocole. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

2. La récolte

1. Au stade de développement d'intérêt (par exemple, le troisième jour après la levée), choisir au moins cinq p représentantlants du lot sur lequel pour effectuer l'analyse cinématique. Continuer à mesurer le reste des plantes, comme expliqué dans l'étape 1.3 pour déterminer la longueur finale de la feuille.
2. Couper la partie de la plante au sol ci-dessus. Pour garder la partie méristème intact, couper le plus près possible des racines (Figure 1ii).
3. A partir des feuilles extérieures, retirez toutes les feuilles jusqu'à la feuille d'intérêt en les déroulage doucement un par un. Si nécessaire, retirez quelques millimètres supplémentaires de la base de détacher les feuilles. Également supprimer les feuilles apex petites et fermées par la feuille d'intérêt (Figure 1iii).
4. Couper un segment de 3 cm, à partir de la base sur un côté de la nervure centrale, et le stocker dans un tube de 1,5 ml d'essai rempli de 3: 1 (v: v) d'éthanol absolu: solution d'acide acétique (ATTENTION: porter des gants) à 4 ° C pendant 24 heures jusqu'à plusieurs mois (figure 1iv). Ce segment sera utilisée ultérieurement pour déterminer la longueur du méristème.
5. Duautre côté de la veine, couper un segment de 11 cm à partir de la base (Figure 1 v) et le placer dans un tube de 15 ml rempli d'éthanol absolu à 4 ° C pendant au moins 6 heures pour éliminer les pigments (figure 1 vi).
   NOTE: Plus tard, utilisez uniquement les 10 premiers cm pour déterminer le profil de longueur de la cellule (voir Discussion).
6. Renouveler l'éthanol absolu pour un autre tour de nettoyage à 4 ° C pendant au moins 24 heures (Figure 1VI).
7. Enfin, remplacer l'éthanol absolu avec de l' acide lactique pur (ATTENTION: porter des gants) pour le nettoyage et le stockage à 4 ° C pendant 24 h ou jusqu'à utilisation ultérieure (Figure 1VI).

3. méristèmes mesures de longueur

1. Préparer un tampon de rinçage contenant du chlorure de sodium 50 mM (NaCl), 5 mM d'acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA; ATTENTION: porter des gants) et Tris 10 mM (hydroxyméthyl) aminométhane-chlorhydrique (TRIS-HCl, pH 7).
2. Prenez le segment de 3 cm de la section 2.4 et ainsiak dans le tampon pendant 20 minutes (Figure 1vii).
3. En attendant, utilisez le tampon de rinçage pour préparer une solution à 4 ', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) coloration de 1 pg / ml, en le maintenant sur la glace et dans l'obscurité.
4. Colorer les noyaux en plaçant le segment de méristème pour 2-5 minutes dans la solution de coloration DAPI. Les travaux sur la glace et dans l'obscurité (Figure 1vii).
5. Vérifiez signal de fluorescence par le montage rapide du segment sur un verre de microscopie et en le recouvrant avec un verre de couverture. Les cellules épidermiques devraient montrer la fluorescence, tandis que les couches cellulaires sous-jacents ne devrait pas.
6. Si la coloration ne suffit pas, mettez le segment de retour dans la solution de coloration DAPI pendant quelques minutes supplémentaires.
7. Pour arrêter la coloration, monter les segments dans une goutte de rinçage tampon sur une lame de microscope et le couvercle avec un couvercle en verre.
8. Utiliser un microscope équipé d'UV-fluorescence à un grossissement de 20X, ce qui permet la visualisation de l'ordre de 1000 epidermecellules al à la fois. Faites défiler à travers le segment et rechercher des chiffres prolifératives mitose (métaphase, anaphase, télophase et cytocinèse), mais il faut éviter la division cellulaire formative du développement stomates (Figure 1viii) ^9. Définir où la figure la plus distale mitotique est situé.
9. Déterminer la longueur du méristème, en mesurant la distance entre la base de la feuille et la plus distale mitotique épidermique figure. Utilisez un logiciel d'analyse d' image (par exemple, ImageJ) pour mesurer la longueur de la trame d'image.
   1. Comptez le nombre de cadres qui couvrent la longueur du méristème complète ( à partir de la base de la feuille à la figure la plus distale mitotique) et multiplier ce nombre par la longueur d'une trame pour obtenir la longueur de méristèmes complète (Figure 1ix).

Longueur 4. Cellule Profil

1. Prenez le segment qui est stocké dans l'acide lactique (étape 2.5) et placez-le soigneusement sur le banc. Couper les segments d'espritha scalpel en 10 segments de 1 cm chacune (Figure 1x).
2. Monter les segments de feuilles successifs sur une lame de microscope dans une petite goutte d'acide lactique. Assurez-vous de toujours faire face soit le adaxial ou abaxial vers le haut. En principe, il n'y a pas de préférence pour un côté particulier.
3. Utiliser un microscope équipé contraste interférentiel différentiel (DIC) optique pour analyser les segments, à partir de la base des feuilles. Mesurer avec un logiciel d'analyse d'image de la longueur d'au moins 20 cellules épidermiques répliquée dans des fichiers directement adjacents aux fichiers stomates afin de sélectionner systématiquement le même type de cellule.
   1. Pour ce faire , à des positions également espacées le long de chacun des segments (4 positions par segment suffisent), et assurez - vous d'écrire la position correspondante pour chaque mesure tout au long de la feuille (Figure 1xi).
4. Déterminer la longueur moyenne des cellules à chaque mm le long de l'axe de la feuille en utilisant un lissage polynomial local procédure, mis en œuvre dans un R script (Figure 1xii; Fichier supplémentaire 1).
   NOTE: Le R-script fournit une série de données avec l'augmentation de lissage. La quantité de lissage nécessaire est quelque peu arbitraire et, idéalement, devrait tout simplement retirer le bruit local, mais pas d'incidence sur la courbe globale. Assurez-vous d'utiliser la même quantité de lissage pour tous les échantillons dans une seule expérience.
5. La moyenne de la longueur de la cellule au niveau de chaque position entre les plantes et de calculer l'erreur standard pour créer un profil de longueur de cellule le long de l'axe de la feuille.

5. Calculs de Kinematic paramètres (voir fichier complémentaire 2)

1. Calculer le LER en prenant la variation de la longueur de la feuille entre deux points de temps successifs (par exemple 24 heures, comme à l' étape 1.3) et en divisant par l'intervalle de temps.
2. Calculer la longueur de la zone de croissance (L _gz) correspondant à la position distale par rapport à la base où les cellules atteignent 95% de leur maturité thisll longueur du profil de la longueur des cellules lissée.
   1. Prendre pour chaque position sur le profil lissée de la longueur des cellules 95% de la moyenne de toutes les longueurs cellulaires suivantes cette position (figure 2).
   2. Comparer la longueur de la cellule lissées (étape 4.4) avec la longueur de la cellule 95%, calculée à chaque position. À partir de la base de la feuille, la zone de croissance se termine à la position dans laquelle la longueur de la cellule réelle est égale à 95% de la longueur des cellules suivantes (figure 2; voir les données supplémentaires 2).

Figure 2:. Détermination de la fin de la zone de croissance méristème: A la position indiquée par une étoile, la taille réelle de la cellule est inférieure à 95% (ligne rouge en pointillés) de la taille moyenne des cellules de toutes les cellules qui suivent cette position (solide rouge ligne). La fin de la zone de croissance (L _gz, indiqué abstar Lue) est situé à 95% (ligne bleue en pointillés) de la taille moyenne des cellules de toutes les cellules suivantes de cette position (ligne bleue) est égale à la taille réelle de la cellule. zone de division (D), zone d'allongement (E), et la zone mature (M). Flèches pointillées indiquent la convergence entre la taille locale et 95% de la taille moyenne sur la partie distale de la feuille lors du passage de la position de base à la pointe de la feuille. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

3. Calculer la longueur de la zone d'allongement (L _EL) comme étant la différence entre la longueur de la zone de croissance (L _gz) et la taille du méristème (L _mer, déterminée à l' étape 3).
4. Calculer la longueur de la cellule mature (l _mat) que la longueur moyenne des cellules dans la zone mature.
5. Diviser le LER par l _mat pour obtenir lele taux de production de cellules (P).
6. Calculer le nombre de cellules dans la zone d'allongement (N _el) comme la différence entre N et N _{gz mer.} Le nombre de cellules dans le méristème (N _FPE) est égal au nombre total de cellules situées dans les intervalles correspondant au méristème. Le nombre de cellules dans la zone de croissance (N _gz) est égal au nombre total de cellules situées dans les intervalles correspondant à la zone de croissance.
7. Calculer le taux de division cellulaire moyenne (D) P / N _mer. La durée du cycle cellulaire (T _c) est égale à ln (2) / D.
8. Calculer le temps dans la zone d'allongement (T _el) en divisant N _el par P. Le temps dans la zone de division est égal à log ₂ (N _mer) * T _c. La longueur des cellules en laissant le méristème (l _div)est égale à la longueur de la cellule du profil de la longueur de la cellule lissée à la fin de méristème.
9. Calculer le taux moyen d'expansion cellulaire (R _el) en utilisant la formule suivante: ln (l _mat) -ln (l _div)] / T _el.

Résultats

Ici, nous montrons une comparaison entre les plantes bien arrosées (contrôle, 54% la teneur en eau du sol, (CFC)) et les plantes soumises à des conditions de stress de la sécheresse (sécheresse, 34% SWC) en termes de croissance des feuilles. Toutes les plantes ont été cultivées dans une chambre de croissance dans des conditions contrôlées (16 h jour / 8 h nuit, 25 ° C / 18 ° C jour / nuit, 300-400 μEm ^-2 s ^-1 rayonnement photosynthétiquement actif (PAR...

Discussion

Une analyse cinématique complète sur les feuilles de maïs permet la détermination de la base cellulaire de la croissance des feuilles et permet la conception de stratégies d'échantillonnage efficaces. Bien que le protocole est relativement simple, une certaine prudence est recommandée dans les étapes essentielles suivantes: (1) Il est important de détacher les feuilles plus jeunes fermés (étape 2.3) sans endommager le méristème, puisque la longueur du méristème détermination (étape 3) exige la compl...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Pots	Any	Any	We use pots with the following measueres, but can be different depending on the treatment/study : bottom diameter: 11cm, opening diameter: 15 cm, height: 12 cm. We grow one maize plant per pot.
Planting substrate	Any	Any	We use potting medium (Jiffy, The Netherlands), but other substrates can be used, depending on treatment/study.
Ruler	Any	Any	An extension ruler that covers at least 1,5 meters is needed to measure the final leaf length of the plants.
Seeds	Any	NA	Seeds can be ordered from a breeder.
Scalpel	Any	Any	The scalpel is used during leaf harvesting to detach the leaf of interest from its surrounding leaves and right after harvesting to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.
15 ml falcon tubes	Any	Any	The 15 ml falcon tubes are used for storing samples used for cell length measurements during sample clearing with absolute ethanol and lactic acid.
Eppendorf tubes	Any	Any	The eppendorf tubes are used for storing samples used for meristem length measurements in ethanol:acetic acid 3:1 (v:v) solution.
Gloves	Any	Any	Latex gloves, which protect against corrosive reagents.
Acetic acid	Any	Any	CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1; Flammable liquids, categories 1,2,3
Absolute ethanol	Any	Any	CAUTION: Hazardous in case of skin contact (irritant), of eye contact (irritant), of inhalation. Slightly hazardous in case of skin contact (permeator), of ingestion
Lactic acid >98%	Any	Any	CAUTION: Corrosive to metals, category 1 Skin corrosion, categories 1A,1B,1C Serious eye damage, category 1
Sodium chloride (NaCl)	Any	Any
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Any	Any	CAUTION: Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), category 4 Skin irritation, category 2 Eye irritation, category 2 Skin sensitisation, category 1 Specific Target Organ Toxicity – Single exposure, category 3
Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris-HCl)	Any	Any	This material can be an irritant, contact with eyes and skin should be avoided. Inhalation of dust may be irritating to the respiratory tract.
4′,6-Diamidine-2′-phenylindole dihydrochloride (DAPI)	Any	Any	Cell permeable fluorescent minor groove-binding probe for DNA. Causes skin irritation. May cause an allergic skin reaction. May cause respiratory irritation.
Ice	Any	NA	The DAPI solution has to be kept on ice.
Fluorescent microscope	AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other		Any fluorescent microscope can be used for determining meristem length.
Microscopic slide	Any	Any
Cover glass	Any	Any
Tweezers	Any	Any	Tweezers are needed for unfolding the rolled maize leaf right after harvesting in order to cut a proper sample for cell length and meristem length measurements.
Image-analysis software	Axiovision (Release 4.8) from Zeiss	NA	The software can be downloaded at: http://www.zeiss.com/microscopy/en_de/downloads/axiovision.html. Other softwares such as ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) could be used as well.
Microscope equipped with DIC	AxioScope A1, Axiocam ICm1 from Zeiss or other		Any  microscope, equipped with differential interference contrast (DIC) can be used to measure cell lengths.
R statistical analysis software	R Foundation for Statistical Computing	NA	Open source; Could be downloaded at https://www.r-project.org/
R script	NA	NA	We use the kernel smoothing function locpoly of the Kern Smooth package (Wand MP, Jones MC.  Kernel Smoothing: Chapman & Hall/CRC (1995)). The script is available for Mac and Windows upon inquire with the corresponding author. We have versions for Mac and Windows.