קולון-26 קרצינומה גידול נושאות עכבר כמודל לחקר סרטן תשישות

Summary

Mice bearing the Colon-26 (C26) carcinoma represent a classical model of cancer cachexia. Progressive muscle wasting occurs in association with tumor growth, over-expression of muscle-specific ubiquitin ligases, and reductions in muscle cross-sectional area. Fat loss is also observed. Cachexia is studied in a time-dependent manner with increasing severity of wasting.

Abstract

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and activation of lipolysis and proteolysis systems. Cancer patients with cachexia benefit less from anti-neoplastic therapies and show increased mortality¹. Several animal models have been established in order to investigate the molecular causes responsible for body and muscle wasting as a result of tumor growth. Here, we describe methodologies pertaining to a well-characterized model of cancer cachexia: mice bearing the C26 carcinoma^2-4. Although this model is heavily used in cachexia research, different approaches make reproducibility a potential issue. The growth of the C26 tumor causes a marked and progressive loss of body and skeletal muscle mass, accompanied by reduced muscle cross-sectional area and muscle strength^3-5. Adipose tissue is also lost. Wasting is coincident with elevated circulating levels of pro-inflammatory cytokines, particularly Interleukin-6 (IL-6)³, which is directly, although not entirely, responsible for C26 cachexia. It is well-accepted that a primary mechanism by which the C26 tumor induces muscle tissue depletion is the activation of skeletal muscle proteolytic systems. Thus, expression of muscle-specific ubiquitin ligases, such as atrogin-1/MAFbx and MuRF-1, represent an accepted method for the evaluation of the ongoing muscle catabolism². Here, we present how to execute this model in a reproducible manner and how to excise several tissues and organs (the liver, spleen, and heart), as well as fat and skeletal muscles (the gastrocnemius, tibialis anterior, and quadriceps). We also provide useful protocols that describe how to perform muscle freezing, sectioning, and fiber size quantification.

Introduction

לבזבז שריר הוא סיבוך חמור של מצבים רפואיים שונים, כגון סרטן, אלח דם, כבד, שחמת כבד, לב ואי ספיקת כליות, מחלת ריאות חסימתית כרונית, ואיידס. בפרט, מבזבז שרירים ניכרת לפחות 50% מהחולים עם סרטן ^1. פסד של שרירי שלד בתוצאות הסרטן מפני שפלת חלבון מוגברת בשל יתר ההפעלה של מערכות פרוטאוליטים שרירי שלד ו / או ירידת חלבון סינתזה ^6. ליפוליזה ניכרה גם, מה שמוביל הדלדול של רקמת שומן. תשישות קלינית, קשורה באיכות מופחתת ואורך החיים מוערך סיבת המוות ב 20 - 30% מהחולים בסרטן ^7. שימוש במודלים ניסיוניים הדומות למחלות האנושיות ככל האפשר יהיה מועיל. במודל חיה אופטימלי מאופיין שחזור גבוה, כמו גם על ידי התערבות מוגבלת מטיפולים שונים והגורמים הצפויים שלדיאטה, מין, ועל רקע גנטי כי הם בדרך כלל משויכים מצבו הקליני ^8. עד כה, תשישות הסרטן נחקרה בעיקר במודלים של בעלי חיים המאופיינת השתלה של תאים סרטניים או הזרקה של חומרים מסרטנים, למרות שיטה חדשה היא להשתמש מהונדסים גנטיים עכברים רגישים להתפתחות הסרטן.

בעכברים נושאי קרצינומה C26 (המכונה גם נקודתיים-26 ו אדנוקרצינומה) מייצגים מודל היטב מאופיין בהרחבה בשימוש של תשישות סרטן ^2,5. הצמיחה של תוצאות הגידול C26 בגוף וירידה במשקל שרירים, בעיקר באמצעות שומן משופרת חלבון פירוק ^9. באופן כללי, משקל גידול 10% לעומת משקל גוף הכולל קשור לירידה של 20-25% ממשקל שרירי שלד דלדול יותר של שומן ^3,10. Hepatomegaly ו splenomegaly הם נצפו גם עם צמיחת הגידול, יחד עם הפעלת התגובה בשלב החריף ואת הגובה של infla פרורמות ציטוקינים mmatory ^3,11. בין אלה, זה ידוע היטב כי IL-6 ממלא תפקיד מרכזי בתיווך לבזבז שריר במודל C26, למרות ציטוקינים זה הוא כנראה לא inducer רק של תשישות ^12. מוגבה IL-6 הגורם לניוון שרירים דרך שפעול מסלול JAK / STAT3, עיכוב גורם שעתוק זה יכול למנוע שריר מבזבז ^3,4.

במהלך לבזבז שרירים הנגרמת C26, כמו במצבים רבים של ניוון שרירים, מסת שריר הוא איבד בעיקר באמצעות הפחתת תכולת החלבון בשריר פני סיבי השריר, ולא דרך מוות של תאים או אובדן סיבי ^13. בשנת תשישות C26, תזוזה לעבר אזורים חתך קטן הוא ציין הן בסיבים glycolytic חמצוני ^2. זה גם עולה בקנה אחד עם כוח שרירים מופחת ^5. קבוצות רבות ברחבי העולם לקחו את היתרון של מודל C26 כדי לגלות מתווכים חדשים של בזבוז שריר או תרופות רלוונטיות קלינית עבור CAC סרטןhexia. עם זאת, נהלים שונים עבור השימוש במודל זה דווחו, מעלה חששות על העקביות של הנתונים שהתקבלו פוזות חסמי שחזור בתנאי ניסוי שונים. כאן אנו מדווחים על שימוש טיפוסי של מודל זה לחקר תשישות הסרטן אשר מניבה נתונים מותאמים לשחזור.

Protocol

משפט ואתיקה: כל המחקרים שתוארו אושרו על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש ועדות של אוניברסיטת תומס ג'פרסון אינדיאנה הספר לרפואה של אוניברסיטת.

1. צמיחת תאי C26 והכנה

1. להשיג תאים סרטן המעי הגס C26 (המרכז הרפואי של אוניברסיטת מדינת אוהיו (OSUMC)) ולהכין מדיום הגידול להשלים (כלומר, גבוהה גלוקוז בינוני של הנשר שונה של Dulbecco (DMEM) המכיל 10% עוברית שור סרום (FBS), פירובט סודיום 1 מ"מ, 1% גלוטמין ו -1% סטרפטומיצין / פניצילין).
   הערה: על מנת לאפשר בין-ניסיוני שחזור טוב יותר, עדיף להשתמש בתאי C26 עם חלוף נמוך ככל האפשר.
2. השתמש דלפק תא זמין מסחרי לצלחת 50,000 תאים / ² סנטימטרים צלוחיות עם מדיום גידול להשלים. דגירה אותם באווירה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ עד ומחוברות משנה. הימנע culturing אותם בצפיפות גבוהה כדי קודםבידול נסחף אף אוזן גרון של פנוטיפים התא.
3. לאחר המעבר הראשון, מספיק תאי צלחת השתלתו המספר המתוכנן של חיות. ביום ההשתלה התא, לנתק את התאים על ידי trypsinization עם 0.02 מ"ל של תמיסת 0.25% טריפסין-EDTA לס"מ ^2, לנטרל את טריפסין על ידי הוספת לפחות 3 מ"ל של מדיום חדש לכל מ"ל של טריפסין, לקבוע ריכוז של תאים תאים / מ"ל , ו resuspend מספר התאים הדרושים לצורך הניסוי (1 x 10 ⁶ תאים לכל עכבר) ב- PBS סטרילית.
   הערה: תאים C26 להגיע confluency כאשר הצפיפות היא כ -500,000 תאים / ² ס"מ.

2. עכברים

1. בחר באקראי עכברי CD2F1 מבוגרים (לפחות 8 שבועות של גיל) לקבוצות (בדרך כלל שולט גידול נושאי) עם לפחות n = 6 לכל קבוצה.
   הערה: גידולי C26 לגדול Balb / c עכברים גם כן. עם זאת, בהתבסס על הניסיון שלנו, עכברי CD2F1 מייצגים שורה צדדית וכלכלית יותר עבור דגם גידול המסוים הזה. יתר על כך,דומה להגדרות הקליניות לממצאים שדווחו דגמים ניסיוניים אחרים של שריר הסרטן קשור המבזבזים ^14-16, הבדלים בין מיני תגובת תשישות C26 עשוי להיות גם ציינו ¹⁷ (ראה גם לוח 1).
2. להרדים את העכבר באמצעות isoflurane משאיפת (3% חמצן). שמירה על בעלי החיים תחת הרדמה בלעדי את הזמן הדרוש כדי לבצע את חיסון הגידול. ודא עכבר שוכב על משטח לוהט על מנת למנוע אובדן חום הגוף. לפני שתתחיל בהליך הזרקת גידול, לאשר הרדמה תקינה על ידי צובט את בוהן האחוריות בעדינות.
   הערה: בשל משך הליך זה (בדרך כלל כמה שניות), שימוש עין משחה וטרינרים אינו נדרש. מאותה הסיבה, חיות בקרה שעברו את ניתוח הדמה אינן צפויות לרדת במשקל.
3. באמצעות מזרק אינסולין 1 מ"ל סטרילי עם מחט 26-מד, להזריק במהירות 250 μl של פתרון המכיל את tumor תאים תת עורית ו intrascapularly ב כרית השומן של העכבר.
   הערה: חיות הבקרה תקבלנה 250 μl של תמיסת מלח סטרילית intrascapularly ב כרית השומן.
4. מניח את גב החיה בכלוב שלה. ישירות להתבונן בעכבר לפחות פעם ב -15 דקות עד שהוא יכול להגיב מניפולציה עדינה יש שהעלה רפלקס ליישר.
   הערה: אל תשאיר את העכבר ללא השגחה, ולשמור אותו בכלוב התאוששות חם המכיל מצע מוצק. יתר על כן, לא להחזיר את העכבר לחדר החיה עד שהוא התאושש לחלוטין מן ההרדמה. באופן כללי, עכברים לא צריכים להיות מאוחסנים בנפרד אלא אם החוקר ומטרתו להעריך את צריכת מזון בודדת. אם זה מקרה ואת השימוש בכלובים מטבולית אוטומטיים אינו זמין, הקלטה ידנית של צריכת מזון חייבת להתבצע, ואולי יומית ובאותו הזמן בכל יום.
5. בדוק את העכברים יומיים ולהקליט משקולות הגוף שלהם.
   הערה: הקלטת תוצאת מצב גוףהתנהגויות בכלוב בבית יכול להבדיל מעלות של התנהגות תשישות וחולי, אשר הוא שימושי עבור מחקרים טיפול ^18.

3. המתת חסד וגביית הדם

1. כאשר אובדן משקל גוף ב מארחי הגידול לעומת שולטת מגיע 5%, 10%, או 15% (קלה, בינונית, ו תשישות חמורה, בהתאמה) לעומת משקולות הגוף ההתחלתי שלהם, להרדים את העכברים.
   הערה: ניסוי טיפוסי יבוצע עד קבוצה אחת מגיעה הרזית 10%, שעליה זמן כל הקבוצות מומתות. הרזיה גוף נבחנת על ידי מדידת משקל הגוף כולל של הגידול.
2. מניחים את העכבר תחת הרדמה כללית isoflurane (3% חמצן). להקיז דם באמצעות לנקב לב (כ 1 - 1.5 מ"ל).
3. אסוף את דם K ₂ -EDTA (מ"ג 18) צינורות ריקים ומניח אותם על קרח. צנטריפוגה הדם (2,000 XG במשך 15 דקות ב 4 ° C) לאסוף את / סרום פלזמה.
4. להרדים את העכבר באמצעות גנקע ervical. המשך כריתת רקמות אוסף איברים.

רקמות 4. כריתת איברים

הערה: לשימוש של רקמות מבחני ביולוגיה ביוכימי או מולקולריים, מתכננת לשקול כל איבר ורקמה ומקום שבר מייד לתוך cryotubes מראש שכותרתו. הצמד להקפיא בחנקן נוזלי חנות ב -80 ° C.

1. על מנת למנוע זיהום של דגימות רקמה עם פרווה, לרסס אתנול 70% על כל הגוף.
2. מניח את העכבר על מצע לנתיחה בעמדת פרקדן ולהרחיב איבר אנכי על ידי הצמדת רגליו אל מהדק buret גבוה.
3. אחוז העור של גפיים התחתונים עם מלקחי דומון ולהשתמש מספריים בסדר המעוקלים כדי להסיר את העור ואת fascia בעדינות, חושף את בטן השריר הבסיסית של הגפיים התחתונים.
4. זהה את שריר הסובך על אחורי גפיים תחתונים על ידי מקורו בבית condyles לרוחב המדיאלי על הירך האחורית והחדרתו בcalcaneus באמצעות גיד calcaneal.
   1. המשך לחתוך את גיד calcaneal הגסטרוקנמיוס. אחוז הקצה הדיסטלי של הגסטרוקנמיוס עם מלקחיים דומון ולמשוך את הבטן שרירים כלפי מקורו. בעזרת מספריים, לחתוך את השריר בראשית הצירים הקרובים ככל האפשר אל הירך. מניח את השריר בצלחת. לשקול את זה מיד ולהקפיא אותו צינור בחנקן נוזלי.
      הערה: הקפד לא שיחתוך את שריר הסוליה יחד עם הגסטרוקנמיוס. אם זה יקרה, להסיר soleus בקפידה על ידי משיכתו בעדינות את עם מלקחיים.
5. המשך לזהות ולהסיר את השריר הקדמי tibialis מראשיתה על פני שטח anterolateral של הטיביה והחדרתו על היתדות המדיאלי באמצעות הגיד הדיסטלי שלה.
   1. על מנת לקבל מינוף, להחזיק את כף הרגל על ​​ידי לתפוס את הספרות עם האצבע המורה והאגודל. הכנס את קצה מלקחי דומון מייד תחת הגיד דיסטלי השטחי של tibialis ולעבור מלקחיים כך blצד unt ניתן להשתמש כדי לנתק את בטן שריר tibialis מרקמת החיבור הבסיסית.
   2. חותך את הגיד הדיסטלי באמצעות המספריים מעוקלים בסדר, ולאחר מכן לחתוך את השריר על המקור, קרוב ככל האפשר אל השוקה.
6. פתח את חלל הבטן על ידי ביצוע חתך sagittal החל באזור hypogastric ומרגש superiorly לאזור ברום הבטן, לעצור את החתך מעל הסרעפת.
   הערה: עומק החתך צריך להיות מספיק רק לפרוץ את דופן הבטן השרירה ואת fascia הצפק הבסיסי.
7. מוציא בזהירות את הכבד ידי אחיזה אותו עם המלקחיים שקצו הבוטים, ולהשתמש מספריים מעוקלים בסדר לנתח משם כל כלי דם או רקמת חיבור המצמידים את הכבד אל החלל. יש להיזהר שלא להשאיר שום אונות מאחורי. לשקול ולהצמיד להקפיא את הכבד בתוך שפופרת בחנקן נוזלי.
8. באמצעות המלקחיים שקצותיהם הבוטים, להתרחק המעי, ולאחר מכן לחשוף ובעדינות להסירהטחול. אחוז הטחול בעדינות עם מלקחיים שקצהו בוטה ולהשתמש הגב או על הצד הקהה של במספריים מעוגלים בסדר לנתח משם כל כלי רקמת חיבור או דם דבקות הטחול אל חלל. לשקול ולהצמיד להקפיא אותו צינור בחנקן נוזלי.
9. זהה את רפידות שומן אשכים, סומכים יותרת האשך (אצל גברים) או רחם (בנקבות). בעדינות לתפוס את כרית שומן epididymal עם המלקחיים שקצו הבוטים למשוך את הרקמות מתוך החלל. בעזרת המספריים מעוקלים בסדר, לחתוך את כל רקמת אשכים שעשויים להיות מחוברי כרית השומן. לשקול את כרית השומן ולהצמיד להקפיא אותו צינור בחנקן נוזלי.
   הערה: באופן כללי, רקמת שומן זה נחשב נציג של מסת השומן בגוף הכולל בעכברים וירידה במשקל עם תשישות. רפידות שומן אחרים ניתן לזהות באופן דומה, גזור, מוסר, ומשקלו.
10. השתמש במספריים מעוגלים בסדר כדי לפתוח את החזה של החיה. לחתוך את הצלעות מצורפות בשני הגבולות לרוחב של sternum. הסר את עצם החזה. באמצעות שני זוגות מלקחיים, לתפוס כל צד של כלוב הצלעות ולמשוך בכל צד רוחבי כדי לפתוח את חלל בית החזה.
11. בעדינות למשוך את הלב עם מלקחיים. בזהירות שיחתוך את הלב עם המספריים המעוקלים בסדר על ידי ניתוק אב העורקים אטריום השמאל. הקפד לרוקן את האיבר של כל דם שיורית ידי סופג אותו בעדינות נגד כמה נייר סופג. לשקול ולהצמיד להקפיא אותו צינור בחנקן נוזלי.

הקפאת שרירים 5. הרכבה

1. לטבול את החצי התחתון של מבחנת פלסטיק קטנה (50 מיליליטר) המכילה איזופנטאן לתוך חנקן נוזלי. איזופנטאן מוכן לשימוש כאשר הוא הופך להיות צמיג מעט ויוצר רירי למינציה לבן מוצק הפנימית של הכוס (טמפרטורה: -160 מעלות צלזיוס).
   הערה: השתמש תמיד nonsparking ברונזה או אלומיניום כלי יד. הימנע נושם אדי מוצר. השתמש עם אוורור מתאים. אם התמודדות עם לשפוך ואוורור הוא בלתי אפשרי או impracticאל, ללבוש נשימה מתאימה.
2. להקפיא כמה בינוני הטבעה על צ'אק (פקק) על ידי טבילה זה בקצרה (10 שניות) לתוך איזופנטאן.
3. טפל השריר (למשל., את tibialis או הגסטרוקנמיוס) על ידי מחזיק אותו הגיד, אנכי ביחס הפקק, כדי לשמור על הכיוון של הסיבים ולאפשר עבור חתכים.
4. בזהירות למקם את סוף החלק של השריר הטרי על גבי מדיום ההטבעה הקפוא.
   הערה: השריר ידבק. חשוב לא להקיף את השריר לחלוטין עם ההטבעה בינונית. כמו כן, חשוב לשמור על הכיוון האנכי לקביעה הבאה של החתך באזור.
5. טובל את צ'אק עם השריר המחובר לאמבטית איזופנטאן (בפעם ההקפאה הרגילה היא 7 - 15 שניות, תלוי בגודל הדגימה ורכב).
   הערה: טבילה בתמיסת ההקפאה לא צריכה להימשך יותר מ נדרש להקפיא את הדגימה לחלוטין. הקפאת frac יהיה ארוך מדיture לחסום רקמות, תוך זמן קצר מדי יגרום להיווצרות קרח קריסטל. טיפוס היטב קפוא יהיה לבן גירים.
6. לאחר הקפאת הדגימה, ולמקם אותו לתוך שקית ניילון קטנה או צינור הדגימה (50 מ"ל) ומיד ולאחסן אותו במקפיא עמוק ב -80 מעלות צלזיוס או בחנקן נוזלי.

6. ניתוח של הנתונים הגולמיים

1. על מנת לשלוט על שונה מבחינת גודל של העכברים, לנרמל את משקל הגוף הסופי (FBW); גידול ללא משקל גוף; ו פגר, איברים, רקמות ומשקל (הביע בגרמים) בהתאם למשקל הגוף ההתחלתי (IBW), ולבטא אותם כמו "משקל / 100 מ"ג IBW".
   הערה: לחילופין, ישנם חוקרים לנרמל את מסת השריר לאורך השוקה.
2. השתמש תוכנה לניתוח נתונים. מצא את הממוצע ואת SD של המשקולות המנורמלות. בביצוע ניתוחים סטטיסטיים עם מבחני t של סטודנט מזווג בין הבקרות C26 נושאות עכברים.
   הערה: תוצאות ניתן להציג ביחס לגוף (IBW ו-חינם גידול FBW), גידול, איבר, ומשקולות רקמות.

7. שרירים חתך

1. הגדר את טמפרטורת העבודה של החדר הפנימי cryostat לסביבות -23 מעלות צלזיוס.
2. אפשר הדגימה (נשמרו קודם ב -80 ° C) להתאקלם בבית טמפרטורת עבודה (כמה שעות צריך להיות מספיק).
3. Cut מספר חלקים עבים 8-מיקרומטר של הדגימה (רצוי הקדמי tibialis או השרירים הגסטרוקנמיוס) ולאסוף אותם בשקופיות זכוכית.
   הערה: חותך את הסעיף ב באזור אמצע הבטן של השריר. כמו כן, למען הדיוק, לחתוך את החלקים בניצב לציר הגובר.
4. שמור את שקופיות זכוכית בפנים הקאמרית cryostat. אל תתנו להם להפשיר אם המטרה היא לבצע IF / מחקרים IHC או מכתים האנזימטית.
5. אחסן את השקופיות ב -80 מעלות צלזיוס במשך ניתוחים נוספים.

8. הערכת גודל Myofiber ידי Laminin Immunofluorescence (חלופה 1)

s = "jove_content"> הערה: לצורך ההערכה של מורפולוגיה שרירים חתך באזור (CSA), hematoxylin ו eosin (H & E) - כמו גם immunofluorescence (IF) שיטות מכתימות מבוססות מתקבלות מערכות כדי לקבוע גודל סיבים ^19. למרות צביעת H & E סעיפי שריר מייצג שיטת ערך והנוחה עבור הניתוח של מורפולוגיה, השימוש בגישת IF ¹⁴ הוא מהיר בצורה משמעותית ובצניעות יותר מדויק מאשר בשיטה המבוססת E H &. שיטות H & E מתוארות להלן.

1. הסר קטעי רקמה מאחד את cryostat או אחסון -80 מעלות צלזיוס ולאפשר להם לאזן לטמפרטורת החדר (כ 5 - 10 דק ').
   הערה: על מנת להימנע אינטראקציות שאינן ספציפיות הקשורות נוגדנים ראשוניים העלו בעכברים, רצויה גם נוגדני שימוש וגדל מין אחר או לעשות שימוש זמינה מסחרי "עכבר על-עכבר" ערכות immunodetection.
2. לטבול את הסעיפים-מגניב מראשמתנול ed (-20 מעלות צלזיוס) במשך 10 דקות.
3. לשטוף את הסעיפים בטמפרטורת החדר 1x PBS במשך 5 דקות.
4. הסר את PBS ולהשתמש עט עבור יישומים immunohistochemical להקיף את הסעיפים בשקופית. אל תתנו סעיפים יבשים לחלוטין בכל נקודה.
5. למרוח למאגר חסימה מתאים (5 - 8% FBS ב PBS או 5% סרום עיזים ב PBS) על החלקים עבור שעה 1 ב RT.
6. הסר את חוצץ החסימה.
7. החל גם אנטי laminin ארנב (1:30) או אנטי-בדיסטרופין העכבר (1:30) נוגדן ראשוני בחסימת המאגר בסעיפים עבור שעה 2 ב RT (או לילה ב 4 ° C) בתא לח.
8. שטפו את החלקים עם 1x PBS במשך 5 דקות.
9. הסר את החיץ לשטוף ולשטוף סעיפים שוב 1x PBS במשך 5 דקות.
10. הסר את חיץ לשטוף ולהחיל נוגדנים משני פלורסנט ראויה (1: 1,000 בחסימת המאגר) בסעיפים בתא לח במשך שעה 1 ב RT.
11. הסר את הנוגדנים משני ולשטוף את החלקים עם 1x PBS במשך 5דקות.
12. הסר את החיץ לשטוף וחזור על לשטוף עם 1x PBS במשך 5 דקות. הסר את החיץ לשטוף ולכסות את החלקים עם כוס כיסוי באמצעות בתווך מימים מבוססים.
13. זהה את תכונות מורפולוגיות של השריר באמצעות תמונות דיגיטליות של הסעיף המוכתם. כדי לעשות זאת, משתמש במיקרוסקופ אור פלואורסצנטי הפוכה עבור סעיפי IF (מטרה בהגדלת 10X או 20X מתאימה), יחד עם תוכנה ללכידת מצלמת תמונה דיגיטלית. מניח סרגל קנה מידה בכל תמונה דיגיטלית (20 - 30 שדות אקראיים מומלצים לכל קטע שריר) כדי להקל על כימות של CSA. התמונה צריכה להיות נשמר בפורמט .TIF להיות תואם עם תוכנת ניתוח התמונה באמצעות תוכנית ImageJ.
14. השתמש מאקרו ImageJ להבחין רקמת חיבור מרקמות התכווצות (גודל myofiber) באמצעות נוכחותם של נוגדנים משני ניאון endomysium ^20.
    הערה: מאקרו וההוראות זמינים authORS, ריצ'רד ליבר ושינון ברימנר.
15. פתח את התוכנית ImageJ ידי לחיצה כפולה על סמל בשולחן העבודה.
16. טען את המאקרו CSA על ידי לחיצה אחת על הכרטיסייה "תוספים". מזיז את הסמן למטה כדי לבחור באפשרות "Install" על ידי לחיצה על זה פעם.
17. טען את המאקרו חתך ידי בחירתו מהתיקייה זה נשמר ב, ולאחר מכן לחץ על "פתח".
18. לאחר מאקרו נפתח, פתח את התמונה היסטולוגית המכיל את סרגל קנה המידה על ידי לחיצה על "קובץ" ולאחר מכן "פתח" מסרגל הכלים ImageJ.
19. לאחר התמונה נפתחת, בחר את "כלי קו הישרים" בתכנית ImageJ על ידי לחיצה על הסמל עם הקו הישר.
20. לאחר "כלי קו הישרים" מסומנים, לחץ פעם אחת על הקצה השמאלי ביותר של סרגל קנה המידה ולאחר מכן לחץ פעם אחת על העכבר הימני ביותר בקצה בר המידה. כאשר נעשה בצורה נכונה, לא צריך להיות קו צהוב מעולף על סרגל קנה המידה.
21. וודא כי Yelloקו w עדיין מעולף על סרגל קנה מידה, בחר את הכרטיסייה "לנתח" מסרגל הכלים ImageJ ידי לחיצה עליו פעם.
22. בלשונית "לנתח", להזיז את הסמן מטה ובחר "סולם להגדיר" על ידי לחיצה על זה פעם.
23. בחלון "קבע סולם", אל תשנה את הערך "המרחק בפיקסלים" תיבה. הזן את המרחק הידוע של סרגל קנה המידה בתיבה "המרחק מוכר". שנה את היחידות בתיבת "יחידת האורך" להתכתב עם יחידות סרגל קנה המידה (כלומר, מיקרומטרים = מיקרומטר). לבסוף, בחר "גלובלי" על ידי לחיצה על התיבה שמשמאל של "גלובל" פעם.
24. סגור את החלון "קבע סולם".
25. פתחו את התמונה הראשונה כדי להימדד על ידי לחיצה על הכפתור "O" על המקלדת. שים מוקפץ חלון המאפשר למשתמש למצוא ובחר את התמונה כדי להימדד מהתיקייה זה נשמר ב. בחר את התמונה על ידי לחיצה על זה פעם אחת ואז לחיצה על "פתח".
26. לאחר הפתיחה, חלון אמור להופיע לבחירת הטווח המקובל למדידות CSA ועבור המעגליות.
    הערה: הגדרות אלו נותרות בדרך כלל לערכי ברירת המחדל שלהם. עם זאת, אם אדם רוצה לשנות הגדרות אלה, כדי להיות בטוחים כדי לשמור על הערכים זהים עבור כל תמונה ברציפות להימדד הניסוי.
27. לאחר קביעת הטווח מעגלי CSA, להתבונן בתמונה המכוסית בפיקסלים אדום עם חלון "סף". התאם את הסף של התמונה באמצעות הסורגים בחלון "סף" עד סיבי השריר מולאו באופן מדויק עם פיקסלים אדומים.
    הערה: לנסות להשיג את המספר הגדול ביותר של סיבים שאינם נוגעים זה בזה; אם הסיבים הם נוגעים, הם יימדדו כמו סיב אחד גדול, אשר יהיה צורך לערוך במורד הזרם.
28. לאחר קביעת הסף, לחץ על הכפתור "1" במקלדת כדי למדוד את סיבי השריר.
29. הקף את סיבי השריר הפרט עם קו צהוב.העבר דרך התמונה ולהסיר חפצים או סיבים כפולים אשר נבחרו על ידי התכנית. כדי לעשות זאת, בחר המבנים שאינם סיבי-ידי לחיצה עליהם פעם אחת, ולאחר מכן ללחוץ על כפתור "D" במקלדת. פעולה זו תמחק אותם מן המדידות.
30. לבחור ולהעתיק את המידות מן "חלון ערך מדידה," ולהדביק אותם לתוך גיליון אלקטרוני לניתוח נוסף.
    הערה: הערכים המתקבלים יכולים לשמש גם כדי להעריך את ניתוח התפלגות סיבים, אשר בדרך כלל מייצג פרמטר שימושי כדי לקבוע אם צמיחת גידול קדם שינוי בכיוון סיבי שריר קטן.
31. סגור את כל החלונות הפתוחים ImageJ על ידי לחיצה על "X" בפינה השמאלית-עליונה של חלונות.
32. פתח תמונה חדשה כדי להימדד על ידי לחיצה על "O" ו חזרה על שלבים 8.24 - 8.29.

הערכת 9. גודל Myofiber מ H & E מוכתם סעיפים (חלופה 2)

1. מניחים את הכוסמגלשות לצנצנות Coplin המכיל מסוננים hematoxylin האריס במשך 8 דקות.
   הערה: לחלופין, hematoxylin המאייר יכול לשמש אם כתם אינטנסיבי פחות הוא רצוי.
2. יש לשטוף את השקופיות במים deionized.
3. טובלים את השקופיות במי ברז עד 5 דקות.
4. במהירות לשטוף אותם במים ללא יונים, ולאחר מכן לדגור אותם בתמיסת 1% eosin מסונן עבור פחות מ -2 דקות.
   הערה: אם כתם אינטנסיבי יותר הוא רצוי, להוסיף 1 - 2 טיפות של חומצה אצטית (0.01% או פחות) לפתרון eosin.
5. להתחיל את צעדי ההתייבשות. יש לשטוף את השקופיות אתנול 70% בפחות מ 1 דקות.
6. טובלים את השקופיות אתנול 90% דקות 1.
7. טובלים את השקופיות אתנול 95% דקות 1.
8. טובלים את השקופיות אתנול 100% למשך 2 דקות.
9. טובלים את השקופיות קסילן במשך 2 דקות. להעביר שקופיות למשנהו צנצנת קופלי המכיל קסילן טרי למשך 2 דקות יותר.
   הערה: שמור את השקופיות קסילן (לא יותר מ 1 hr) עד שהם coverslipped.
10. מניחים את coverslips על הסעיפים השרירים באמצעות Permount או מדיום של בחירת הרכבה מבוססת קסילן.
11. שימו לב שקופיות הזכוכית הצבעונית E H & תחת מיקרוסקופ עם הגדלה 20X, ולרכוש תמונות של האזור סעיף השריר כולו. להשיג תמונות באמצעות מיקרוסקופ בהיר-אור, מצלמה דיגיטלית, תוכנה ללכידת תמונה.
    הערה: הנוכחות של סרגל קנה מידה או תמונה של מיקרומטר נלקחה ב ההגדלה אותו תידרש לקבוע את CSA. כנ"ל, להקליט לפחות 20 - 30 שדות אקראיים עבור כל מקטע שריר.
12. להעריך את גודל myofiber באמצעות תוכנת ImageJ. פתוח כל תמונה דיגיטלית. הגדר את קנה המידה כאמור לעיל. מדוד לפחות 1,500-2,000 סיבי שריר לכל שריר באמצעות כלי בחירה ביד החופשית, התחקות היקף הסיבים עם עכבר או עבור קלט מהר, עם מכשיר קלט של Tablet ועט.

איסוף נתונים 10. וניתוח

1. כדי להקים גודל סיבי שריר, להעריך את שטח סיב "הממוצע."חשב אמצעי SD עבור המדידות המתקבלות עבור כל שריר, כולל הוא את האזור בקוטר של Feret. בנוסף, על מנת להעריך האם הגדרת הניסוי קשורה שינוי בכיוון קטן או גדול סיבי שריר, לנתח את" חלוקת הסיבים . "
2. להעריך את המשמעות של התוצאה על ידי ביצוע מבחן t מזווג עבור שתי קבוצות. לקבוע את היחס בין הערכים שהתקבלו עבור קבוצת עכברי C26 ועבור קבוצת הביקורת. מגרש את הערכים על גרף דיווח SD האמצעים ואת היסטוגרמה התדירה ההפצה / שנועדה להפגין את המשמרת בגדלי סיבים.

תוצאות

קינטיקה צמיחת גידול C26 להראות שלב בפיגור עבור 7 הראשון - ד 8 לאחר הזרקה, ואחריו צמיחת תאי מעריכים (4 - 5 ד). המסה של הגידול מגיע בסופו של דבר ~ 10% ממשקל הגוף (כ -2 גרם; איור 1 א-ב). במהלך השלב הראשון, הגידול יכול להיות ממוקם על ידי מישוש בלבד ומ?...

Discussion

במיוחד בשלבים האחרונים שלה, סרטן המעי הגס הוא קשור להתפתחות של תשישות, האחראית על תוצאות פחות טובות וירידה באיכות חיי המטופל. מחקרים רבים התמקדו בטיפול תנאים משני לסרטן; עם זאת, למרות מאמצים רבים בכיוון זה, עדיין אין טיפול מאושר תשישות סרטן ^21. לפיכך, קיים הכרח כי ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture Flasks	Falcon - Becton Dickinson	35-5001
DMEM	Cellgro	10-017-CV
FBS	Gibco	26140
Streptomycin-Penicillin	Cellgro	30-002-CI
CD2F1 mice	Harlan	060
Anesthesia apparatus	EZ-Anesthesia	EZ-7000
2-Methyl Butane	Sigma-Aldrich	M32631
OCT	Tissue-Tek	4583
Cryostat	Leica	CM1850
Cork disks	Electron Microscopy Sciences	63305
Superfrost plus glass slides	VWR	48311-703
Anti-Laminin Rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	L9393
Anti-Dystrophin Mouse Monoclonal antibody	Vector Laboratories	VP-D508
Alexa Flour 594 anti-mouse IgG	Life Technologies	A11062
Alexa Flour 594 anti-rabbit IgG	Life Technologies	A21211
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	GHS216
Eosin	Sigma-Aldrich	HT110332
Xylene	Acros Organics	422680025
Cytoseal-XYL	Thermo	8312-4
Microscope	Zeiss	Observer.Z1
Bamboo Tablet	Wacom	CTH-661
Prism 7.0 for Mac OS X	GraphPad Software, Inc.
Excel for Mac 2011	Microsoft Corp.
Image J	US National Institutes of Health	IJ1.46	http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Microtainer	BD	365873