Die Colon-26-Karzinom Tumor-tragenden Maus als Modell für die Untersuchung von Krebs Kachexie

Zusammenfassung

Mice bearing the Colon-26 (C26) carcinoma represent a classical model of cancer cachexia. Progressive muscle wasting occurs in association with tumor growth, over-expression of muscle-specific ubiquitin ligases, and reductions in muscle cross-sectional area. Fat loss is also observed. Cachexia is studied in a time-dependent manner with increasing severity of wasting.

Zusammenfassung

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and activation of lipolysis and proteolysis systems. Cancer patients with cachexia benefit less from anti-neoplastic therapies and show increased mortality¹. Several animal models have been established in order to investigate the molecular causes responsible for body and muscle wasting as a result of tumor growth. Here, we describe methodologies pertaining to a well-characterized model of cancer cachexia: mice bearing the C26 carcinoma^2-4. Although this model is heavily used in cachexia research, different approaches make reproducibility a potential issue. The growth of the C26 tumor causes a marked and progressive loss of body and skeletal muscle mass, accompanied by reduced muscle cross-sectional area and muscle strength^3-5. Adipose tissue is also lost. Wasting is coincident with elevated circulating levels of pro-inflammatory cytokines, particularly Interleukin-6 (IL-6)³, which is directly, although not entirely, responsible for C26 cachexia. It is well-accepted that a primary mechanism by which the C26 tumor induces muscle tissue depletion is the activation of skeletal muscle proteolytic systems. Thus, expression of muscle-specific ubiquitin ligases, such as atrogin-1/MAFbx and MuRF-1, represent an accepted method for the evaluation of the ongoing muscle catabolism². Here, we present how to execute this model in a reproducible manner and how to excise several tissues and organs (the liver, spleen, and heart), as well as fat and skeletal muscles (the gastrocnemius, tibialis anterior, and quadriceps). We also provide useful protocols that describe how to perform muscle freezing, sectioning, and fiber size quantification.

Einleitung

Muskelschwund ist eine ernste Komplikation bei verschiedenen klinischen Zuständen wie Krebs, Sepsis, Leberzirrhose, Herz- und Nierenversagen, chronische obstruktive Lungenerkrankung und AIDS. Insbesondere ist Muskelschwund in mindestens 50% der Patienten mit Krebs ¹ evident. Der Verlust der Skelettmuskulatur bei Krebs resultiert aus einer erhöhten Proteinabbau aufgrund der Überaktivierung der Skelettmuskulatur proteolytischen Systeme und / oder verringerte Proteinsynthese ^6. Lipolyse ist auch offensichtlich, zum Abbau von Fettgewebe führt. Klinisch Kachexie ist mit verminderter Qualität und Länge des Lebens verbunden und geschätzt wird , in 20 die Ursache des Todes zu sein - 30% der Krebspatienten ^7. Verwendung von experimentellen Modellen, die die menschliche Krankheit möglichst genau ähneln vorteilhaft wäre. Eine optimale Tiermodell wird durch eine hohe Reproduzierbarkeit sowie durch begrenzte Interferenz von verschiedenen Therapien und unvorhersehbaren Faktoren gekennzeichnetDiät, Geschlecht und genetischen Hintergrund, der ⁸ mit dem klinischen Zustand in der Regel verbunden sind. Bisher hat Krebskachexie sucht hauptsächlich in Tiermodellen durch Transplantation von Krebszellen oder Injektion von Karzinogenen gekennzeichnet, obwohl eine neue Methode zu verwenden, ist genetisch veränderte Mäuse anfällig für die Entwicklung von Krebs.

Mäuse , denen das C26 - Karzinom Lager stellen eine gut charakterisierte und extensiv genutzte Modell der Tumorkachexie ^2,5 (auch als Kolon-26 und Adenokarzinom bezeichnet). Das Wachstum der C26 Tumor Ergebnisse in Körper und Muskelgewichtsverlust, vor allem durch eine verbesserte Fett- und Proteinabbau ^9. Im allgemeinen wird eine 10% ige Tumorgewicht gegenüber der Gesamtkörpergewicht mit einer Reduktion von 20-25% in der Skelettmuskelmasse und eine größere Abreicherung von Fett ^3,10 zugeordnet. Hepatomegalie und Splenomegalie sind auch mit Tumorwachstum, zusammen mit der Aktivierung der Akutphasenreaktion und der Erhöhung von pro-INFLA beobachtetmmatory Cytokinspiegel ^3,11. Unter diesen ist bekannt , dass IL-6 eine entscheidende Rolle spielt , Muskelschwund in der C26 - Modell in der Vermittlung, obwohl dieses Zytokin ist wahrscheinlich nicht der einzige Induktor von Kachexie ^12. Erhöhte IL-6 verursacht Muskelatrophie durch Aktivierung des JAK / STAT3 Pathway, und kann diesen Transkriptionsfaktor Hemmen verhindern ^3,4 Muskelschwund.

Während C26-induzierte Muskelschwund, wie in vielen Bedingungen der Muskelatrophie, wird Muskelmasse weitgehend durch die Verringerung der Muskelproteingehalt über Muskelfasern verloren, nicht durch den Zelltod oder den Verlust von Fasern ^13. In C26 Kachexie, eine Verschiebung hin zu kleineren Querschnittsflächen ist sowohl in glykolytischen und oxidativen Fasern ² beobachtet. Dies ist auch mit reduzierter Muskelkraft ⁵ konsistent. Viele Gruppen haben weltweit Vorteil des C26-Modell genommen, um neue Vermittler von Muskelschwund entdecken oder klinisch relevante Medikamente gegen Krebs cacHexia. Jedoch haben viele verschiedene Verfahren für die Verwendung dieses Modells wurde, berichtet Bedenken hinsichtlich der Konsistenz der erhaltenen Daten Anheben und Barrieren Reproduzierbarkeit in verschiedenen experimentellen Bedingungen darstellen. Hier berichten wir über eine typische Anwendung dieses Modell für die Untersuchung von Tumorkachexie, die standardisierte und reproduzierbare Daten liefert.

Protokoll

Ethikerklärung: Alle beschriebenen Studien genehmigt wurden durch die Institutional Animal Care und Verwenden Ausschüssen der Thomas Jefferson University und der Indiana University School of Medicine.

1. C26 Zellwachstum und die Vorbereitung

1. Erhalten C26 Darmkrebszellen (Ohio State University Medical Center (OSUMC)) und bereiten vollständigen Wachstumsmedium (dh mit hoher Glukose Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 1 mM Natriumpyruvat, 1% Glutamin und 1% Streptomycin / Penicillin).
   HINWEIS: Um eine bessere inter experimentelle Reproduzierbarkeit zu ermöglichen, ist es vorzuziehen, C26-Zellen bei einer Passage so gering wie möglich zu verwenden.
2. Verwenden Sie einen im Handel erhältlichen Zellzähler 50.000 Zellen / cm ² in Flaschen mit komplettem Wachstumsmedium auf die Platte. Sie in einer befeuchteten Atmosphäre bei 37 ° C und 5% CO ₂ bis zum subkonfluenten. Vermeiden sie in hoher Dichte Kultivierung zur vorherigenent Differenzierung und Driften der Zelle Phänotypen.
3. Nach dem ersten Durchgang, genügend Zellen Platte werden in der geplanten Anzahl von Tieren implantiert. Am Tag der Zellimplantation, dissoziieren die Zellen durch Trypsinierung mit 0,02 ml von 0,25% Trypsin-EDTA - Lösung pro cm ^2, Neutralisieren des Trypsins durch Zugabe von mindestens 3 ml frisches Medium pro ml Trypsin, Zellkonzentration in Zellen / ml bestimmen , und die Zahl der Zellen für das Experiment (1 x 10 ⁶ Zellen pro Maus) in sterilem PBS benötigt resuspendieren.
   HINWEIS: Die C26 - Zellen Konfluenz erreichen , wenn die Dichte beträgt etwa 500.000 Zellen / cm ^2.

2. Mäuse

1. Randomize Erwachsenen CD2F1 Mäuse (mindestens 8 Wochen alt) in Gruppen (in der Regel kontrolliert und Tumor-Träger) mit mindestens n = 6 pro Gruppe.
   HINWEIS: C26 Tumoren wachsen in Balb / c-Mäusen als auch. Doch aufgrund unserer Erfahrung stellen CD2F1 Mäuse eine vielseitigere und wirtschaftlichen Gastgeber für dieses bestimmte Tumormodell. Außerdem,ähnlich den klinischen Einstellungen und die Feststellungen in anderen experimentellen Modellen von Krebs-assoziierten Muskel berichtet ^14-16, geschlechtsspezifische Unterschiede in der Reaktion auf C26 Kachexie verschwenden auch ¹⁷ beobachtet werden kann (siehe auch Tabelle 1).
2. Anesthetize die Maus durch Inhalation (3% in Sauerstoff) unter Verwendung von Isofluran. Pflegen Sie das Tier unter Narkose ausschließlich für die Zeit notwendig, um die Tumorimpfung durchzuführen. Sicherstellen, dass die Maus liegt auf einem Heizkissen, um den Verlust von Körperwärme zu verhindern. Vor der Tumorinjektion Verfahren beginnen, überprüfen Sie die ordnungsgemäße Betäubung durch sanft die hinteren Zehen einklemmen.
   HINWEIS: Aufgrund der Dauer dieses Verfahrens (im allgemeinen einige Sekunden) wird die Verwendung von Tieraugensalbe nicht erforderlich. Aus dem gleichen Grund, den Kontrolltieren, die Scheinoperation unterzogen werden nicht, Gewicht zu verlieren erwartet.
3. Mit einer sterilen 1-ml Insulinspritze mit einer Nadel 26 Gauge, schnell 250 ul der Lösung injizieren, um die t enthält,umor Zellen subkutan und intrascapularly in das Fettpolster der Maus.
   HINWEIS: Die Kontrolltiere 250 ul steriler Kochsalzlösung intrascapularly in das Fettpolster erhalten.
4. Legen Sie das Tier zurück in seinen Käfig. Direkt beobachten mindestens einmal mit der Maus alle 15 Minuten, bis es auf sanfte Manipulation reagieren kann und einen aufrichtenden Reflex zurückgewonnen.
   HINWEIS: Lassen Sie die Maus unbeaufsichtigt und halten Sie sie in einem warmen Erholungskäfig, die ein festes Substrat enthält. Darüber hinaus bringen nicht die Maus an den Tierraum, bis es vollständig aus der Narkose zurückgewonnen wird. Im Allgemeinen Mäuse müssen nicht einzeln gehalten werden, es sei denn, der Prüfer individuelle Nahrungsaufnahme zu beurteilen soll. Wenn dies der Fall ist, und die Verwendung von automatischen metabolischen Käfigen ist nicht verfügbar, manuelle Aufnahme der Nahrungsaufnahme durchgeführt werden müssen, möglicherweise täglich und in der gleichen Zeit jeden Tag.
5. Schauen Sie sich die Mäuse täglich und nehmen ihre Körpergewichte.
   Hinweis: Die Aufnahme der Körperzustand Partitur undKäfig Verhaltensweisen können Grad der Kachexie und Krankheitsverhalten unterscheiden, die für die Behandlung Studien ¹⁸ nützlich ist.

3. Euthanasie und Blutentnahme

1. Wenn die Körpergewichtsverlust in den Tumor Hosts im Vergleich zu Kontrollen von 5% erreicht hat, 10% oder 15% (leicht, mittel und schwere Kachexie, respectively) im Vergleich zu ihren ursprünglichen Körpergewichte, einschläfern die Mäuse.
   HINWEIS: Ein typisches Experiment wird durchgeführt, bis eine Gruppe von 10% Gewichtsverlust erreicht, bei welcher Zeit alle Gruppen eingeschläfert werden. Körpergewichtsverlust wird durch Messen des Körpergewichts, einschließlich des Tumor beurteilt.
2. Platzieren Sie die Maus unter Isofluran-Narkose (3% in Sauerstoff). Zeichnen Blut mittels Herzpunktion (ca. 1-1,5 ml).
3. Sammeln Sie das Blut in K ₂ EDTA (18 mg) Leerrohre und legen Sie sie auf Eis. Zentrifuge das Blut (2.000 xg für 15 min bei 4 ° C) und das Plasma / Serum zu sammeln.
4. Euthanize die Maus mit Hilfe von cervical Luxation. Gehen Sie zur Gewebeentnahme und Organsammlung.

4. Gewebe- und Organ Excision

HINWEIS: Bei Verwendung von Gewebe in biochemischen oder molekularbiologischen Tests planen jedes Organ und Gewebe zu wiegen und ein Fragment sofort in voretikettierten Cryotubes platzieren. Schnellfrost in flüssigem Stickstoff und bei -80 ° C.

1. Um eine Kontamination von Gewebeproben mit Fell zu vermeiden, Spray 70% Ethanol über den ganzen Körper.
2. Platzieren Sie die Maus auf einer Dissektion Bett in Rückenlage und erweitern ein Glied vertikal durch den Fuß auf eine erhöhte buret Klemme befestigt wird.
3. Fassen Sie die Haut der unteren Extremität mit Dumont Pinzette und verwenden Sie die gebogenen feinen Schere sanft die Haut und Faszien zu entfernen, um die darunter liegende Muskelbäuche der unteren Extremität auszusetzen.
4. Identifizieren Sie den Musculus gastrocnemius auf der hinteren unteren Extremität durch seinen Ursprung an den lateralen und medialen Kondylen am hinteren Oberschenkel und seine Insertion ander Calcaneus über die Fersensehne.
   1. Gehen die gastrocnemius Fersensehne zu schneiden. Fassen Sie das distale Ende des Gastrocnemius mit Dumont Zange und ziehen Sie den Muskelbauch in Richtung auf seine Herkunft. Mit einer Schere, schneiden Sie den Muskel am Ursprung so nah wie möglich an den Oberschenkelknochen. Setzen Sie den Muskel in einer Schale. Wiegen Sie es sofort und frieren sie in ein Röhrchen in flüssigem Stickstoff.
      HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht die Soleusmuskel zusammen mit dem gastrocnemius auszuschneiden. Wenn das geschieht, sorgfältig soleus entfernen, indem Sie es vorsichtig aus mit der Zange herausziehen.
5. Gehen Sie zu identifizieren und die Tibialis-anterior-Muskel von seinem Ursprung an der anterolateralen Oberfläche der Tibia und seine Einführung am medialen Keilschrift über seinem distalen Sehne auszuschneiden.
   1. Um Einfluss zu haben, halten Sie den Fuß durch die Ziffern mit dem Zeigefinger und Daumen zu erfassen. Führen Sie die Spitze Dumont Zange unmittelbar unter der oberflächlichen distalen Sehne des Tibialis und bewegen Sie die solche Zange, dass die blunt Seite kann die tibialis Muskelbauch aus dem zugrunde liegenden Bindegewebe zu lösen verwendet werden.
   2. Schneiden Sie die distale Sehne der feinen gekrümmten Schere, und dann schneiden Sie den Muskel am Ursprung, so nah wie möglich an der Tibia.
6. Öffnen Sie die Bauchhöhle durch einen sagittalen Schnitt Durchführung im Unterbauch beginnen und oben auf der Magengegend zu bewegen, Stoppen der Einschnitt knapp über der Membran.
   HINWEIS: Die Tiefe des Einschnitts sollte nur genug sein, um die Bauchmuskelwand und die darunter liegende Peritonealdialyse Faszie zu durchbrechen.
7. Entfernen Sie vorsichtig die Leber, indem sie es mit den stumpfen Pinzette, und verwenden Sie die feinen gebogenen Schere greifen keine Blutgefäße oder Bindegewebe zu sezieren entfernt, die die Leber zu dem Hohlraum zu halten. Achten Sie darauf, keine Lappen hinter sich zu lassen. Wiegen Sie und lassen Sie die Leber in einem Röhrchen in flüssigem Stickstoff einfrieren.
8. Unter Verwendung der stumpfen Pinzette, den Darm weg bewegen, und dann aussetzen und zart entfernendie Milz. Fassen Sie die Milz sanft mit den stumpfen Pinzette und verwenden Sie die Rückseite oder stumpfen Seite der feinen gebogenen Schere Ankleben der Milz zu dem Hohlraum keine Bindegewebe oder Blutgefäße zu sezieren entfernt. Wiegen Sie und lassen Sie sie in ein Röhrchen in flüssigem Stickstoff einfrieren.
9. Identifizieren Sie die Gonaden Fettpolster, angrenzend an den Nebenhoden (bei Männern) oder der Gebärmutter (bei Frauen). Fassen Sie die epididymal Fettpolster mit den stumpfen Pinzette und ziehen des Hohlraums des Gewebes aus. Mit Hilfe der feinen gekrümmten Schere, schnitt jede Gonadengewebe entfernt, die mit dem Fettpolster befestigt werden kann. Wiegen Sie die Fettpolster und gefrieren lassen Sie sie in ein Röhrchen in flüssigem Stickstoff.
   HINWEIS: Im Allgemeinen ist dies Fettgewebe als repräsentativ für die Gesamtkörperfettmasse bei Mäusen und sinkt in Gewicht mit Kachexie. Andere Fettpolster können in ähnlicher Weise identifiziert, seziert, entfernt und gewogen.
10. Verwenden Sie die gebogenen feinen Schere, um die Brust des Tieres zu öffnen. Schneiden Sie die Rippen an den beiden Seitenrändern des st wegernum. Entfernen Sie das Brustbein. Mit zwei Paar Zangen, greifen auf jeder Seite des Brustkorbs und jede Seite ziehen seitlich die Brusthöhle zu öffnen.
11. ziehen Zart das Herz mit der Zange. das Herz mit den gekrümmten feinen Schere vorsichtig auszuschneiden durch die Aorta in den linken Vorhof trennt. Stellen Sie sicher, das Organ aller Restblut zu leeren, indem fein es gegen einige saugfähiges Papier aufnehmen. Wiegen Sie und lassen Sie sie in ein Röhrchen in flüssigem Stickstoff einfrieren.

5. Muscle Einfrieren und Montage

1. Tauchen Sie die untere Hälfte eines kleinen Plastikbecher (50 ml), das Isopentan in flüssigen Stickstoff. Das Isopentan ist einsatzbereit, wenn es etwas zähflüssig wird und bildet eine solide weißem Laminat Futter in das Innere des Bechers (Temperatur: -160 ° C).
   HINWEIS: Immer funken Bronze oder Aluminium Handwerkzeug verwenden. Vermeiden Produktdampf einatmen. Bei ausreichender Belüftung verwenden. Wenn Umgang mit einem Spill und Belüftung ist unmöglich oder impractical, einen geeigneten Atemschutz tragen.
2. Gefriert einige Einbettmedium auf einem Spannfutter (Kork) durch kurzes Eintauchen (10 sec) in Isopentan.
3. Behandeln Sie den Muskel (z. B. die tibialis oder gastrocnemius) , indem sie von der Sehne, vertikal zur Kork, um Halten der Ausrichtung der Fasern zu erhalten und für die Querschnitte zu ermöglichen.
4. Vorsichtig Position den Endteil des frischen Muskel oben auf dem gefrorenen Einbettmedium.
   HINWEIS: Der Muskel wird bleiben. Es ist wichtig, nicht vollständig um den Muskel zu umgeben mit Medium eingebettet wird. Es ist auch wichtig, um die vertikale Ausrichtung für die nachfolgende Bestimmung der Querschnittsfläche zu erhalten.
5. Dip das Spannfutter mit dem daran befestigten Muskel in das Isopentan-Bad (die übliche Gefrierzeit ist 7-15 sec, je nach Probengröße und Zusammensetzung).
   HINWEIS: Das Eintauchen in der Gefrierlösung sollte nicht länger dauern als vollständig benötigt wird, um die Probe einzufrieren. Einfrieren zu lang ist die Fracture den Gewebeblock, während eine zu kurze Zeit die Bildung von Eiskristallen führen wird. Eine gut gefrorene Probe wird kreideweiß sein.
6. Nach der Probe Einfrieren, legen Sie sie in einen kleinen Plastikbeutel oder Probenröhrchen (50 ml) und speichern Sie es sofort in einem Tiefkühlschrank bei -80 ° C oder in flüssigem Stickstoff.

6. Analyse der Rohdaten

1. Um Variationen in der Größe der zu Kontrollmäusen, normalisieren die endgültige Körpergewicht (FBW); tumorfreien Körpergewicht; und Karkasse, Orgel und Gewebegewicht (in Gramm) nach dem anfänglichen Körpergewicht (IBW) und Express sie als "Gewicht / 100 mg IBW".
   HINWEIS: Alternativ normalisieren einige Forscher die Muskelmasse an der Tibia Länge.
2. Verwenden Sie eine Software für die Datenanalyse. Finden Sie den Mittelwert und SD der normalisierten Gewichte. Führen Sie eine statistische Analyse mit ungepaarten Student-t-Tests zwischen den Kontrollen und C26 tragenden Mäusen.
   HINWEIS: Die Ergebnisse können auf Körper relativ dargestellt werden (IBWund tumorfreien FBW), Tumor, Organ und Gewebegewichte.

7. Muscle Sectioning

1. Stellen Sie die Arbeitstemperatur des Kryostaten inneren Kammer auf etwa -23 ° C.
2. Erlauben der Probe (zuvor bei -80 ° C gelagert) bei der Arbeitstemperatur zu akklimatisieren (ein paar Stunden sollte genug sein).
3. Cut mehrere 8 um dicke Abschnitte der Probe (vorzugsweise der tibialis anterior oder gastrocnemius Muskeln) und sammeln sie auf Glasobjektträger.
   HINWEIS: Schneiden Sie den Abschnitt in der Mitte Bauchregion des Muskels. Auch aus Gründen der Genauigkeit, schneiden die Abschnitte senkrecht zu der Montageachse.
4. Halten Sie die Glasplättchen im Inneren der Kryostatkammer. Lassen Sie sie nicht auftauen, wenn das Ziel auszuführen IF / IHC Studien oder enzymatische Färbung ist.
5. Lagern Sie die Folien bei -80 ° C für weitere Analysen.

8. Bewertung von myofiber Größe von Laminin Immunofluoreszenz (Alternative 1)

Hinweis: Für die Bewertung der Muskelmorphologie und Querschnittsfläche (CSA), Hämatoxylin und Eosin (H & E) - sowie Immunfluoreszenz (IF) -basierte Färbemethoden Systeme werden akzeptiert Fasergröße ¹⁹ bestimmen. Obwohl die H & E - Färbung der Muskelschnitte für die Analyse der Morphologie eine wertvolle und bequeme Methode darstellt, ist die Verwendung eines IF Ansatz ¹⁴ wesentlich schneller und bescheiden genauer als die H & E-basierte Methode. H & E-Methoden sind unten beschrieben.

1. Entfernen Gewebeschnitte von entweder dem Kryostaten oder -80 ° C Lagerung und damit sie sich auf Raumtemperatur äquilibrieren (ca. 5 - 10 min).
   HINWEIS: Um unspezifische Wechselwirkungen mit primären in Mäusen Antikörper, assoziiert zu vermeiden, ist es ratsam, entweder Verwendung Antikörper in einer anderen Spezies erhöht oder die Verwendung von im Handel erhältlichen "Maus-on-Maus" Immunnachweis-Kits zu machen.
2. Tauchen Sie die Abschnitte in der Vor-kühlened Methanol (-20 ° C) für 10 min.
3. Waschen Sie die Abschnitte in Raumtemperatur 1x PBS für 5 min.
4. Entfernen Sie die PBS und mit einem Stift für immunhistochemischen Anwendungen die Abschnitte auf der Folie zu umschließen. Lassen Sie sich nicht Abschnitte an jedem Punkt vollständig trocken.
5. Ein geeignetes Blockierungspuffer (5 bis 8% FBS in PBS oder 5% Ziegenserum in PBS) auf die Abschnitte für 1 h bei RT.
6. Entfernen Sie den Blockierungspuffer.
7. Gelten entweder ein Kaninchen anti-Laminin (1:30) oder eines Maus-Anti-Dystrophin (1:30) primärem Antikörper in Blockierungspuffer zu den Abschnitten für 2 h bei RT (oder über Nacht bei 4 ° C) in einer feuchten Kammer.
8. Waschen Sie die Abschnitte mit 1x PBS für 5 min.
9. Entfernen Sie den Waschpuffer und wasche Abschnitte wieder in 1x PBS für 5 min.
10. Entfernen der Waschpuffer und wenden eine richtige fluoreszierenden Sekundärantikörper (1: 1000 in Blocking-Puffer) in den Abschnitten in einer feuchten Kammer für 1 Stunde bei RT.
11. Entfernen Sie den sekundären Antikörper und waschen Sie die Abschnitte mit 1x PBS für 5Minute
12. Entfernen Sie den Waschpuffer und wiederholen Sie die Wäsche mit 1x PBS für 5 min. Entfernen der Waschpuffer und bedecken die Abschnitte mit einem Deckglas ein Medium auf wässriger Basis verwendet wird.
13. Identifizieren Sie die morphologischen Merkmale des Muskels durch digitale Bilder des gefärbten Abschnitt verwenden. Um dies zu tun, einen invertierten Fluoreszenzlichtmikroskop verwenden für IF Abschnitte (a 10X oder 20X Vergrößerung Ziel angemessen ist), zusammen mit einer Digitalkamera und Bildaufnahmesoftware. Legen Sie eine Maßstabsleiste in jedem digitalen Bild (20 - 30 Zufallsfelder sind für jeden Muskel Abschnitt empfohlen) die Quantifizierung der CSA zu erleichtern. Die Bilder sollten im .tif-Format gespeichert werden mit der Bildanalyse-Software kompatibel zu sein, die ImageJ Programm.
14. Verwenden ein ImageJ Makro Bindegewebe von kontraktilen Gewebe (myofiber Größe) durch die Anwesenheit des fluoreszierenden Sekundärantikörpers in der Endomysium ²⁰ unterscheiden.
    HINWEIS: Das Makro und Anweisungen sind vom Auth verfügbarors, Richard Lieber und Shannon Bremner.
15. Öffnen Sie das ImageJ Programm durch einen Doppelklick auf das Symbol auf dem Desktop.
16. Legen Sie das CSA Makro, indem Sie einmal die Registerkarte "Plugins" klicken. Bewegen Sie den Cursor zu wählen Sie die Option "Installieren", indem Sie einmal darauf klicken.
17. Laden Sie die Querschnitts Makro indem es aus dem Ordner auswählen es in gespeichert wurde, und klicken Sie dann auf "Öffnen".
18. Sobald das Makro geöffnet wurde, öffnen Sie das histologische Bild der Maßstabsleiste enthält, die durch "Datei" klicken und "Öffnen" aus dem ImageJ Symbolleiste dann.
19. Nachdem das Bild geöffnet wird, wählen Sie die "Gerade-Tool" in der ImageJ Programm, indem sie mit der geraden Linie auf das Symbol klicken.
20. Sobald die "Gerade-Tool" ausgewählt ist, klicken Sie einmal auf der äußersten linken Ende der Skala bar und dann klicken Sie einmal auf der äußersten rechten Ende der Skala bar. Wenn es richtig gemacht, sollte es eine gelbe Linie auf der Skala bar überlagert werden.
21. Sicherzustellen, dass die yellow Linie immer noch auf der Skala bar überlagert wird, wählen Sie die "Analyse" Registerkarte aus der ImageJ Symbolleiste durch einmaliges Anklicken.
22. Im "Analysieren" Registerkarte, bewegen Sie den Cursor nach unten und wählen "Skala" durch einmaliges Anklicken.
23. In der "Set-Skala" Fenster, ändern Sie nicht den Wert in der "Abstand in Pixeln" -Box. Geben Sie den bekannten Abstand der Maßstab in der "bekannten Abstand" -Box. Ändern Sie die Einheiten in der "Längeneinheit" Box mit den Maßstabsbalken Einheiten entsprechen (dh & mgr ; m = & mgr; m). Schließlich wählen Sie "global" durch das Feld auf der linken Seite "Global" einmal klicken.
24. Schließen Sie das "Set-Skala" Fenster.
25. Öffnen Sie das erste Bild werden gemessen, indem die "O" -Taste auf der Tastatur drücken. Beachten Sie ein Fenster Pop-up, dass der Benutzer das Bild zu finden und auswählen können aus dem Ordner gemessen werden, um es in gespeichert wurde. Wählen Sie das Bild auf einmal, klicken und dann auf "Öffnen".
26. Nach dem Öffnen eines Fensters sollte für die Auswahl des akzeptablen Bereichs für CSA-Messungen und für Zirkularität erscheinen.
    HINWEIS: Diese Einstellungen werden in der Regel links auf die Standardwerte. Wenn man jedoch wünscht, diese Einstellungen zu ändern, müssen Sie die Werte gleich für jedes aufeinanderfolgende Bild zu halten, in dem Experiment gemessen werden.
27. Nach dem CSA-Bereich und Zirkularität Einstellung, beobachten Sie das Bild in roten Pixeln mit einem "Threshold" Fenster abgedeckt. Stellen Sie die Schwelle des Bildes mit Hilfe der Bars in der "Threshold" Fenster, bis die Muskelfasern genau gefüllt mit roten Pixeln in.
    HINWEIS: Der Versuch, die größte Anzahl von Fasern zu erhalten, die einander nicht berühren; wenn Fasern berühren, werden sie als eine große Faser gemessen werden, der stromabwärts bearbeitet werden müssen.
28. Nach dem Einstellen der Schwelle, drücken Sie die Taste "1" auf der Tastatur, um die Muskelfasern zu messen.
29. Kreisen Sie die einzelnen Muskelfasern mit einer gelben Linie.Navigieren Sie durch das Bild, und entfernen Sie Artefakte oder Doppel Fasern, die durch das Programm ausgewählt wurden. Um dies zu tun, wählen Sie die Strukturen, die keine Fasern sind, indem sie einmal darauf klicken, und drücken Sie dann die "D" -Taste auf der Tastatur. Dies wird ihnen von den Messungen zu löschen.
30. Wählen Sie und die Messungen von dem kopieren "Messwertfenster", und fügen Sie sie in eine Tabelle für die weitere Analyse.
    HINWEIS: Die erhaltenen Werte können auch die Faserverteilungsanalyse zur Beurteilung verwendet werden, die im Allgemeinen ein nützlicher Parameter stellt eine Verschiebung zu kleineren Muskelfasern zu bestimmen, ob das Tumorwachstum fördert.
31. Schließen Sie alle geöffneten Fenster in ImageJ durch das "X" in der oberen linken Ecke des Fensters klicken.
32. Öffnen Sie ein neues Bild zu werden, indem man die Taste "O" gemessen und Schritte 8,24 Wiederholung - 8.29.

9. Auswertung von myofiber Größe von H & E-gefärbten Schnitten (Alternative 2)

1. Das GlasDias in Färbetrog für Harris Hämatoxylin 8 min gefiltert enthält.
   HINWEIS: Alternativ kann Mayer Hämatoxylin verwendet werden, wenn eine weniger intensive Fleck erwünscht ist.
2. Spülen Sie die Folien in VE-Wasser.
3. Tauchen Sie die Folien in Leitungswasser für bis zu 5 min.
4. spülen Sie sie schnell in VE-Wasser, und sie dann für weniger als 2 min in gefilterten 1% Eosin Lösung inkubiert.
   HINWEIS: Wenn eine intensivere Fleck gewünscht wird, fügen Sie 1 bis 2 Tropfen Essigsäure (0,01% oder weniger) an die Eosin-Lösung.
5. Beginnen Sie die Entwässerung Schritte. Spülen Sie die Folien in 70% Ethanol für weniger als 1 min.
6. Tauchen Sie die Folien in 90% Ethanol für 1 min.
7. Tauchen der Objektträger in 95% Ethanol für 1 min.
8. Tauchen der Objektträger in 100% Ethanol für 2 min.
9. Tauchen Sie die Folien in Xylol 2 min. Verschieben Sie die Folien in ein anderes Copley Glas mit frischem Xylol für weitere 2 min.
   HINWEIS: Halten Sie die Folien in Xylen (nicht länger als 1 Stunde), bis sie eingedeckt werden.
10. Legen Sie die coverslips an den Muskelpartien mit Permount oder Xylen-basierten Montage Medium der Wahl.
11. Beachten Sie die H & E-gefärbten Glasobjektträger unter einem Mikroskop mit einer 20-facher Vergrößerung, und erwerben Bilder des gesamten Muskelquerschnittsfläche. Erhalten Sie Bilder durch ein helles Lichtmikroskop, Digitalkamera und Bildaufnahmesoftware.
    HINWEIS: Die Anwesenheit eines Maßstabsbalken oder ein Bild von einem Mikrometer bei der gleichen Vergrößerung aufgenommen wird benötigt, um die CSA zu bestimmen. Wie oben Rekord mindestens 20 - 30 Zufallsfelder für jeden Muskel Abschnitt.
12. Bewerten Sie die myofiber Größe mit ImageJ Software. Öffnen Sie alle digitalen Bild. Stellen Sie wie oben die Waage. Messen Sie mindestens 1.500-2.000 Muskelfasern pro Muskel mit der freihändigen Auswahlwerkzeug, das Aufspüren der Faserumfang mit einer Maus oder, für eine schnellere Eingabe, mit einem Tablet-Eingabegerät und Stift.

10. Datenerhebung und Analyse

1. Um Muskelfasergröße, beurteilen die durchschnittliche Faser "Bereich zu etablieren."Berechnen Mittel und SD für die Messungen für jeden Muskel erhalten, die sowohl den Bereich und den Durchmesser des Feret. Darüber hinaus, um zu beurteilen, ob die experimentelle Einstellung mit einer Verschiebung in Richtung entweder kleiner oder größer Muskelfasern verbunden ist, analysieren die" Faserverteilung . "
2. Bewerten Sie die Bedeutung des Ergebnisses durch eine ungepaarte T-Test für zwei Gruppen durchgeführt wird. Bestimmen Sie die Verhältnisse zwischen den Werten für den C26-Mäuse-Gruppe und der Kontrollgruppe erhalten. Zeichnen Sie die Werte auf einem Diagramm, das die Mittel SD Berichterstattung und die Frequenzverteilung / Histogramm zeigt die Verschiebung der Fasergrößen ausgerichtet.

Ergebnisse

C26 Tumorwachstum Kinetiken zeigen eine lag-Phase für den ersten 7 - 8 d nach der Injektion, gefolgt von einer exponentiellen Zellwachstums (4 bis 5 d). Die Tumormasse erreicht schließlich ~ 10% des Körpergewichts (etwa 2 g; 1A-B). Während der ersten Phase kann der Tumor nur durch Palpation lokalisiert werden und erscheint als eine kleine Vorwölbung der Haut. In der zweiten Phase wird der Tumor als eine Masse unter der Haut beobachtet. Selten wird d...

Diskussion

Vor allem in seinen letzten Stadien ist Darmkrebs mit der Entwicklung von Kachexie, die schlechtere Ergebnisse und Verringerung der Lebensqualität des Patienten verantwortlich ist. Viele Studien haben sich auf die Behandlung von Zuständen Sekundar zu Krebs fokussiert; jedoch trotz vieler Bemühungen in dieser Richtung gibt es noch keine zugelassene Therapie für Krebs Kachexie ^21. Daher ist es zwingend notwendig, dass die Tiermodelle der menschlichen Pathologie so eng wie möglich, um ähneln Übersetzung d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture Flasks	Falcon - Becton Dickinson	35-5001
DMEM	Cellgro	10-017-CV
FBS	Gibco	26140
Streptomycin-Penicillin	Cellgro	30-002-CI
CD2F1 mice	Harlan	060
Anesthesia apparatus	EZ-Anesthesia	EZ-7000
2-Methyl Butane	Sigma-Aldrich	M32631
OCT	Tissue-Tek	4583
Cryostat	Leica	CM1850
Cork disks	Electron Microscopy Sciences	63305
Superfrost plus glass slides	VWR	48311-703
Anti-Laminin Rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	L9393
Anti-Dystrophin Mouse Monoclonal antibody	Vector Laboratories	VP-D508
Alexa Flour 594 anti-mouse IgG	Life Technologies	A11062
Alexa Flour 594 anti-rabbit IgG	Life Technologies	A21211
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	GHS216
Eosin	Sigma-Aldrich	HT110332
Xylene	Acros Organics	422680025
Cytoseal-XYL	Thermo	8312-4
Microscope	Zeiss	Observer.Z1
Bamboo Tablet	Wacom	CTH-661
Prism 7.0 for Mac OS X	GraphPad Software, Inc.
Excel for Mac 2011	Microsoft Corp.
ImageJ	US National Institutes of Health	IJ1.46	http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Microtainer	BD	365873