טיפול של רצועות ליגמנט עם תרגיל ממוזג בסרום: רקמות תרגום הנדסה דגם

Summary

אנו מציגים מודל של רקמת ליגמנט שבה מבנים תלת-מימדיים מטופלים בסרום המותאם על-ידי התרגיל האנושי ונותחו עבור תוכן קולגן, פונקציה וביוכימיה סלולרית.

Abstract

ניסויים במבחנה חיוניים להבנת מנגנונים ביולוגיים; עם זאת, הפער בין תרבות רקמת monolayer ופיזיולוגיה אנושית הוא גדול, ואת התרגום של הממצאים הוא לעתים קרובות עניים. לכן, יש מספיק הזדמנויות עבור גישות ניסיוניות אלטרנטיביות. כאן אנו מציגים גישה שבה תאים אנושיים מבודדים מן שרידי רקמת השריר הקדמית של האדם הקדמי, מורחבת בתרבות, ומשמשת ליצירת רצועות מהונדסות. פעילות גופנית משנה את הסביבה הביוכימית בדם, כך שהפונקציה של רקמות רבות, איברים ותהליכים גופניים משופרים. בניסוי זה, התקשורת תרבות הבנייה ליגמנט היה להשלים עם נסיוני האדם בסרום כי כבר "מותנה" על ידי תרגיל. לכן ההתערבות רלוונטית יותר מבחינה ביולוגית, שכן רקמה ניסיונית נחשפת לסביבה הביוכימית האנדוגנית המלאה, כולל חלבונים מחברים ותרכובות נלוות, אשר ניתן לשנותם במקביל לפעילות שלסוכן לא מוכר של עניין. לאחר הטיפול ניתן לנתח מיתרים מהונדסים לתפקוד מכני, לתוכן קולגן, למורפולוגיה ולביוכימיה סלולרית. בסך הכל, ישנם ארבעה יתרונות עיקריים לעומת התרבות monolayer המסורתית מודלים של בעלי חיים, של המודל הפיזיולוגי של רקמות ליגמנט זה מוצג כאן. ראשית, מבנים רצועות הם תלת מימדיים, המאפשרים תכונות מכניות ( כלומר , פונקציה) כגון מתח מתיחה האולטימטיבי, עומס מתיחה מקסימלי, מודולוס, כדי לכמת. שנית, את enthesis, את הממשק בין boney אלמנטים sinew, ניתן לבחון בפירוט ובתוך הקשר פונקציונלי. שלישית, הכנת מדיה בסרום שלאחר האימון מאפשרת את ההשפעות של הסביבה הביוכימית הממושכת, שאחראית על מגוון רחב של הטבות בריאותיות של פעילות גופנית, להיחקר באופן לא משוחק. לבסוף, מודל ניסיוני זה מקדם מחקר מדעי באופן אנושי ואתי על ידי החלפת השימושחיות, המנדט העיקרי של המכון הלאומי לבריאות, המרכז לבקרת מחלות, ומנהל המזון והתרופות.

Introduction

פציעות טלאי ופציעות הן נפוצים ויכולים להשפיע על הניידות הרגילה ועל איכות החיים. התערבות כירורגית הוא הכרחי לעתים קרובות אבל יכול להיות הצלחה מוגבלת ומגוונת ^{4 , 5} . ההבנה הנוכחית של איך הגידים והרצועות לפתח, לבש, להגיב על פגיעה אינה שלמה, ולכן מודלים מחקר יעיל נדרשים כדי לספק תובנה בפיתוח טיפולים יעילים יותר ⁵ . כדי להתמודד עם פער הידע הזה, ניתן להשתמש במודלים של בעלי חיים, אך במחקרים של vivo מורכבים מטבעם עם קושי בשליטה על הסביבה ומיקוד התערבויות ישירות לרקמות המיועדות. לעומת זאת, הסביבה הניסויית יכול בקלות להיות נשלט, פיקוח במבחנה עם התרבות המסורתית monolayer התא. עם זאת, טכניקה זו עשויה oversimplify הסביבה הכימית מכני ולכן לא יכול recapituמאוחר ההתנהגות vivo של התאים. הנדסת רקמות הוא מסוגל להתחתן עם היתרונות של המורכב בסביבה vivo במודלים של בעלי חיים עם שליטה של ​​הסביבה חוץ גופית מספק כלי נוסף ללמוד פיזיולוגיה. בנוסף, חמושים עם הבנה טובה יותר של התפתחות הליגמנט, הנדסת הרקמות עשוי גם לספק מקור של רקמה שתל כאשר שחזור כירורגי נדרש ⁶ . לכן, השיטה המתוארת כאן מאמת רקמות במבחנה 3D מהונדסים שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד פונקציה ליגמנט מורפולוגיה.

פיברין מבוססי גיד או מבנה הרצועות שימשו כמודל במבחנה כדי ללמוד תהליכים פיזיולוגיים כולל קולגן פיברילוגנזה ⁷ ופיתוח גיד ⁸ , כמו גם יישומים translational שבו התועלת שלהם כמו רקמות השתל הוערך מודל כבשים של הקדמי cruCial ligament (ACL) שחזור ⁹ . המעבדה שלנו הקימה בעבר מודל ליגמנט מהונדס תלת-ממדי המפרש שני מכחולים, חומר סידן פוספט-חלופי, עוגני בטון. מודל זה יכול להיות נתון בתנאים ניסויים שונים בקלות על ידי השלמת התקשורת תרבות עם גורמים ביולוגיים ¹⁰ או החלת גירוי מכני ¹¹ . חשוב לציין, מודל זה העצם אל העצם מאפשר ניתוח מעמיק של enthesis, את הממשק בין בוני אלמנטים sinew, אשר רגישים לפציעה.

המחקר הדגיש כאן ¹ כדי להציג את המתודולוגיה הזו, היינו מעוניינים בהשפעה של שינויים המיוצרים על ידי פעילות גופנית בסביבה הביוכימית על תפקוד הליגמנט. פעילות גופנית משפרת את תפקוד הסלולר ואיבר במגוון רחב של רקמות בכל הגוף ^{2 , 3 , 12} , אפקט שניתן לייחס לשחרור של ידועים שונים (למשל, IL-6 ¹³ , IL-15 ¹⁴ , מטאורין כמו ¹⁵ , אקסוסומים ^{16 , 17} ), וכן גורמים ביוכימיים אחרים לא ידועים שפורסמו לתוך מחזורית מערכתית . יתר על כן, הסביבה שלאחר הביוכימיה מועשרת בהורמונים מגיב פעילות גופנית, ששחרורו מגורה על ידי גירוי מערכת העצבים הסימפתטית של בלוטות הפרשה ( למשל , cortisol ו catecholamines מ בלוטת יותרת הכליה ¹⁸ , הורמון גדילה של יותרת המוח הקדמית ¹⁹ ). עם זאת, אני vivo n , אי אפשר להבדיל את ההשפעות של גירוי מכני של פעילות גופנית מ מימוש- induced שינויים ביוכימיים. בעוד כמה מחקרים מאופיינים עלייה צפויה של הורמונים במחזור מסוים ציטוקינים בתגובה למימושכפי שצוין לעיל, ישנם גורמים רבים מדי, ידועים ובלתי ידועים, לסכם בנאמנות במבחנה. כלומר, בידוד כמה גורמים עבור מחקר במבחנה מספקת מספקת מענה המורכבות של התגובה הביוכימית. במחקר זה, חקרנו כיצד שינויים בסרום ביוכימי בסרום, הנגרמים על ידי פעילות גופנית, משפיעים על פונקציית הרצועות המהונדסות. כדי לבודד את ההשפעות של השינויים הביוכימיים, השגנו סרום ממשתתפים אנושיים לפני ואחרי התקף של פעילות גופנית התנגדות והשתמשו בו לטפל ברצועות מהונדסים 3D שנוצר באמצעות fibroblasts היברידית הקדמית (ACL) היברידית הקדמית (ACL). באמצעות מודל זה, אנו יכולים לקבל נתונים פונקציונליים, כולל השפעות על תכונות מכניות ותוכן קולגן, כמו גם לכמת את ההשפעות על איתות מולקולרי.

Protocol

ההליכים הבאים עומדים בפרוטוקול שאושר על ידי המוסד לביקורת מוסדית של אוניברסיטת קליפורניה, דייוויס; להתייעץ עם מועצת האתיקה המקומית לפני תחילת המחקר.

1. בידוד fibroblasts ראשוני משרידי ACL האדם

הערה: לשמור על סטריליות ולבצע את כל השלבים בארון בטיחות ביולוגי (BSC).

1. לקבל אישור מהמועצה המתאימה לבדיקת אתיקה לגבי איסוף ושימוש ברקמות אנושיות כפי שמתואר להלן.
2. הכן 5x אנטיביוטיקה / antimycotic (ABAM) פתרון על ידי דילול 100x אנטיביוטיקה / antimycotic פתרון 1x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS)
3. איסוף שברי רקמה ACL ב 5X פתרון ABAM בצינור 50 מ"ל חרוטי, לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד שלב העיכול. חותכים רקמות קטנות יותר עם סכין גילוח אם יש צורך לגודל מרבי של 1 x 1 x 1 ס"מ ³ .
   זהירות: לציית לתקנות Biohazard המקומי עבורשימוש נאות בחומר ביוכיארד וניקוי והסרת פסולת ביולוגית.
4. הכן כמות מספקת של פתרון collagenase להטביע את שברי רקמות. ממיסים collagenase סוג II (1 מ"ג / מ"ל) ב גלוקוז גבוהה של Dulbecco שונה בינוני הנשר (DMEM) המכיל 1x פניצילין / סטרפטומיצין, ו 20% בסרום שור עוברית (FBS) ומסנן ב 0.22 מיקרומטר.
5. לשטוף את רקמת ACL 3 פעמים PBS.
6. רקמת תקציר. העברת רקמת ACL לצינור חדש 50 מ"ל חרוטי ולהוסיף נפח מספיק של פתרון collagenase להטביע את הרקמה. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך הלילה (~ 17 שעות).
7. לפני משך העיכול הושלם, להכין התקשורת צמיחה (GM) על ידי השלמת DMEM התקשורת גלוקוז גבוהה עם 10% FBS ו 100 U / מ"ל ​​פניצילין.
8. 15 דקות לפני זמן העיכול הושלמה, מערבולת בקצרה רקמות המכילות 50 מ"ל צינור 3 פעמים כל 5 דקות.
9. באמצעות פיפטה 25 מ"ל סרולוגי, triturate הרקמה מתעכל במרץ לשבור את tiלהזיז עוד ולסלק תאים.
10. צנטריפוגה ב XG 1500 במשך 5 דקות. לשאוב supernatant ו resuspend גלולה ב 10 מ"ל GM.
11. חזור על שלבים 1.8-1.9 שלוש פעמים נוספות.
12. לאחר צנטריפוגה האחרון, resuspend גלולה ב 5-10 מ"ל GM. השתמש מדגם קטן ההשעיה התא לבצע ספירת תאים עם hemocytometer ולהעריך את הכדאיות התא באמצעות Trypan כחול.
13. פלייט ההשעיה תא על 15 ס"מ רקמות תרבות רקמות בצפיפות של 3-4 x 10 ⁵ תאים לכל צלחת.
14. תרבות כדי מפגש 70% חממה סטרילית מתוחזק על 37 מעלות צלזיוס 5% CO ₂ , שינוי GM כל שלושה ימים. השתמש או לאחסן (ראה להלן) תאים בתוך 5 מעברים.
15. להקפיא תאים לשימוש עתידי.
    1. תאים Trypsinize ב מפגש 70% כדלקמן. לשאוב התקשורת לשטוף תאים עם PBS. הוסף מספיק מראש חימם (37 מעלות צלזיוס) 0.05% טריפסין רק כדי לכסות את החלק התחתון של צלחות תרבות רקמות. המקום צלחות באינקוביה תרבותAtor במשך 5 דקות ~ עד התאים מנותקים (לוודא תאים צפים באמצעות מיקרוסקופ אור). השתמש פיפטה לאסוף תאים לוותר על צינור פלקון.
    2. צנטריפוגה תאים גלולה, תאים resuspend ב DMEM התקשורת גלוקוז גבוהה המכילה 20% FBS ו 10% dimethyl sulfoxide (DMSO). ההשעיה תא Aliquot לתוך cryovials מגניב ב -1 ° C / min לפחות 24 שעות. חנות cryovials קפואים בחנקן נוזלי.

2. הכן צלחות מצופה סיליקון

1. הכן 35 מ"מ צלחות תרבות רקמה: הסר מכסים לפרוס את הצלחות פתוח על משטח שטוח.
2. מערבבים סיליקון אלסטומר לפי הוראות היצרן.
3. השתמש מזרק 10 מ"ל לוותר על כ 2 מ"ל לכל צלחת 35 מ"מ.
4. אפשר סיליקון לרפא בטמפרטורת החדר במשך 2-3 ימים.

3. הכן עוגנים מלט Brushite

1. מראש, להכין סיליקון הפוך תבניות המכיל אנחנו גליליLls להיווצרות עוגן. הפוך תבניות יכול להיעשות על המפרט של העוגן הרצוי צורה וגודל.
   1. לקבוע את הגובה הרצוי ואת הקוטר של העוגן הסופי. פרוטוקול זה משתמש תבנית מותאמת אישית שנוצרו מ סיליקון מלאכה ב 35 מ"מ צלחת רקמה תרבות שבה צילינדרים מפלסטיק של כ 3.25 מ"מ קוטר הוצבו, המאפשר גובה עובש סופי של כ 6.5 מ"מ. מידות העוגן הסופי הן כ 3-3.5 מ"מ גובה ועל 3.4 מ"מ קוטר עם 1.5 פינים מ"מ בולטות מהחלק התחתון של העוגן.
   2. הוסף סיליקון לא מאובטחת על צלחת 35 מ"מ שבו עובש ייעשה. מניחים גלילי פלסטיק בהתאם.
      הערה: גודל גלילי הפלסטיק יקבע את קוטר העוגנים הסופיים. המיקום של צילינדרים מפלסטיק ואת כמות סיליקון בשימוש יכול להיות שונה כדי לייצר עוגנים של גבהים שונים. עובי בין החלק התחתון של הבארות בתבנית לבין החלק התחתון של התבנית עצמה יהיה דEtermine כמה סיכה יכול לבלוט מהחלק התחתון של העוגן המאפשר העוגן מאוחר יותר להיות מוצמד בבטחה בצלחת מצופה סיליקון.
   3. לאחר המאפשר סיליקון לרפא, להסיר את צילינדרים פלסטיק להסיר את התבנית מן צלחת 35 מ"מ.
2. הכן 3.5 M אורתופוספוריק / 100 מ"מ פתרון חומצת לימון. ממיסים 0.961 גרם חומצת לימון ב 11.5 מ"ל חומצה אורתופוספורית. תביא את נפח הפתרון של עד 50 מ"ל עם מים MilliQ. פתרון חנות בטמפרטורת החדר ולהגן מפני האור.
3. הכנת תבניות: מניחים סיכה אחת קטנה במרכז כל באר גלילי בתבניות.
4. שלב β-tricalcium פוספט ו אורתופוספוריק / פתרון חומצת לימון בריכוז 1 גרם / מ"ל ​​בסירה פלסטיק לשקול על הקרח.
5. מערבבים את המלט במרץ באמצעות מגרד תא פלסטיק.
6. Triturate המלט להמשיך ערבוב תערובת פיפטה לתוך התבנית
7. צנטריפוגה עובש מלא דקות 1 ב 2,250 x גרם.
8. אפשר עוגנים צמנט brushite להגדיר בטמפרטורת החדר לילה.
9. הסר עוגנים מן התבנית ואת סיכה שני עוגנים 12 מ"מ בנפרד בכל צלחת מצופה סיליקון.
10. לעקר צלחות מוצמד על ידי ריסוס עם אתנול 70%, מילוי הן את הצלחות ואת המכסים, ואת הנחת לתוך BSC. לאחר לפחות 30 דקות, לשאוב צלחות ולהחליף מכסים, אחסון ב BSC עד הצורך.

4. השגת סרום אנושי

1. ודא כי אישור על ידי המועצה המתאימה לבדיקת אתיקה הושג עבור פרוטוקול זה.
2. ודא כי הסכמה מדעת הוסברה על ידי בני אדם להשתתף בהתערבות נתונה ( כגון התעמלות, מזון או התערבות סמים) אשר ישפיע על השינויים הרצויים בסרום. כאן, אנו מתארים את האוסף במנוחה ו 15 דקות לאחר תרגיל התנגדות.
3. באמצעות phlebotomist מאומן, להשיג מדגם דם נח מן משתתף על ידי וניקור לתוך מיכל מתאים פונו.
4. איסוף דגימת דם לאחר האימון 15 דקות לאחר המשתתפים לעסוק בפרוטוקול התרגיל הרצוי. כפי שתואר לעיל ¹ , להשתמש בפרוטוקול ההתנגדות התנגדות בניסוי זה כדי לעורר תגובה ביוכימית אנדוגני.
   1. יש המשתתפים לבצע חמש קבוצות של לחץ רגל עם מנוחה דקה אחת בין קבוצות. לאחר מכן, יש לבצע את המשתתפים קבוצה של הרחבות הברך ומערכת של תלתלי ההאמסטרינג ברצף ללא מנוחה ולאחר מכן לחזור על תרגילי גב אל גב שלוש פעמים עם מנוחה 1 דקות בין קבוצות.
5. אפשר דם קריש לפני צנטריפוגה ב XG 1500 במשך 10 דקות. בתנאים סטריליים, העברת סרום צינורות סטרילי עבור תוספת התקשורת בעתיד (בסרום מאוחסן על 4 מעלות צלזיוס) וניתוח ביוכימי (aliquot קטן של בסרום מאוחסן ב -20 מעלות צלזיוס).

5. טופס הנדסה מיתרים

הערה: מראש, הרחב את ראשיBroblasts ולהכין צלחות מצופה סיליקון עם עוגנים מברשת מוצמד.

1. הכינו ריאגנטים:
   1. הכן תרומבין. ממיסים טרומבין בקר ב 200 U / מ"ל ​​ב DMEM גלוקוז מדיה גבוהה. מסנן ב 0.22 מיקרומטר, aliquot, ואת החנות ב -20 מעלות צלזיוס.
   2. הכינו פיברינוגן. ממיסים פיברינוגן בקר ב 20 מ"ג / מ"ל ​​ב DMEM התקשורת גלוקוז גבוהה. לדגור על 3-4 שעות אמבט מים 37 מעלות צלזיוס, מתערבל כל 30 דקות כדי לסייע בפירוק. מסנן ב 0.22 מיקרומטר (מסננים מרובים ייתכן שיהיה צורך), aliquot, ואת החנות ב -20 מעלות צלזיוס.
   3. הכן aprotinin. ממיסים aprotinin ב 10 מ"ג / מ"ל ​​במים. מסנן ב 0.22 מיקרומטר, aliquot, ואת החנות ב -20 מעלות צלזיוס.
   4. הכן חומצה aminohexanoic. ממיסים חומצה aminohexanoic ב 0.1g / mL במים. מסנן ב 0.22 מיקרומטר, aliquot, ואת החנות ב 4 ° C.
   5. הכן חומצה אסקורבית. ממיסים חומצה אסקורבית ב DMEM התקשורת גלוקוז גבוהה בריכוז של 50 מ"מ. מסנן ב 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 ° C.
   6. הכן L-proline. ממיסים L-proline ב PBS בריכוז של 50 מ"מ. מסנן ב 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 ° C.
   7. הכן גורם הצמיחה טרנספורמציה β1 (TGF-β1). לשחזר TGF-β1 על פי הנחיות היצרן בריכוז של 10 מיקרוגרם / מ"ל. Aliquot ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
2. לקבוע את מספר המבנים הנדרשים לניסוי ולוודא מספר מספיק של צלחות מוצמדים מוכנים. מומלץ גם לשכפל ביולוגי וטכני. במחקר ¹ מודגש כאן, השתמש שכפול טכני משוכפל ו 12 משכפל ביולוגי (בסרום מ 12 אנשים במנוחה לאחר פעילות גופנית).
   הערה: בצע את השלבים הבאים בתנאים סטריליים ב BSC.
3. הרחב תאים על ידי culturing בצלחות 15 ס"מ כדי מפגש 70%. 2.5 x 10 ⁵ תאים נדרשים לכל לבנות.
4. תאים trypsinize ו resuspend ב GM בריכוז של 3.67 x 10⁵ תאים / מ"ל.
5. יצירת תמהיל הראשי עבור מספר מבנים נדרש: עבור 1 לבנות, תערובת הראשי מכיל 681 ההשעיה תא μL (המכיל 2.5 x 10 ⁵ תאים), 29 thrombin μL, 2 aprotinin μL, ו 2 חומצה aminohexanoic μL.
6. לאחר ערבוב תערובת הראשי היטב, להוסיף μL 714 לכל צלחת מוצמד בדפוס "דמות 8" סביב עוגני צמנט המברשת. ודא כי התמהיל הראשי ישירות הקשר הצדדים של העוגנים.
7. בעדינות להקיש על כל צלחת להפיץ את התמהיל הראשי באופן שווה על פני הצלחת.
8. עבור צלחת אחת בכל פעם, להוסיף במהירות פיברינוגן 286 μL בצורה dropwise באופן שווה על צלחת אחת ומיד להחליק את הצלחת קדימה ואחורה מצד לצד על פני השטח של BSC להפיץ את הפיברינוגן כדי ליצור את ג'ל פיברין מוטבע תאים . המשך לצלחת הבאה.
9. מניחים את המבנים חממה סטרילית מתוחזק על 37 מעלות צלזיוס 5% CO2 ו דגירהבמשך לפחות 15 דקות כדי לאפשר פילמור של הפיברינוגן.
10. הכן מספיק חומרי הזנה (FM) עבור 2 מ"ל לכל לבנות. מוסף GM עם חומצה אסקורבית 200 מיקרומטר, פרוולין 50 מיקרומטר, ו 5 ng / mL TGF-β1.
11. הוסף 2 מ"ל FM כדי לכסות כל מבנה. תרבות המבנים חממה סטרילית מתוחזקת על 37 מעלות צלזיוס ו 5% CO ₂ עבור סכום כולל של 14 ימים או לנקודת הקצה הרצויה, מרענן את התקשורת בכל יום שני עם 2 מ"ל FM

6. מתיחה בדיקה הנדסה מיתרים

הערה: בדיקות מתיחה בוצעה באמצעות בודק מתיחה בנוי באופן מיוחד באמבטיה PBS; לאחור מכווצת אחיזה כי הם מצמידים את הכוח מתמר להחזיק brushite מלט עוגנים במקום במהלך הבדיקה.

1. לקבוע את אורך ורוחב של מבנים הרצועה באמצעות מחוגה דיגיטלי; לחשב את אזור החתך של הרקמה.
2. בטל את הצמדת הרצועה מהצלחת והנח את העוגניםאחוריים מכווצים לאחור, להבטיח את המבנה הוא שקוע PBS.
3. התאם את המרחק בין האחיזה, הגדרת אורך המבנה באורך הראשוני.
4. להתחיל את הבדיקה: זן לבנות לכישלון בקצב זן של 0.4 מ"מ / s (או ~ 3% / s).
5. לאחר השלמת הבדיקה, לעבד את שרידי רקמות עבור תוכן קולגן (ראה סעיף 7).
6. מן הנתונים העומס העומס כתוצאה, לחשב מתח נתונים זן לכמת תכונות מכניות של עניין; למשל, עומס מתיחה מקסימלי, חוזק מתיחה האולטימטיבי מודולוס ( כלומר , רכוש אלסטי מעל אזור ליניארי של עקומת מתח הלחץ).

7. כימות של תוכן קולגן של רצועות מהונדסים

1. הסר רצועות מהונדסים מן עוגנים צמנט brushite ויבש על 120 מעלות צלזיוס למשך 25 דקות.
2. קביעת מסה יבשה של בונה מקום צינורות בודדים 1.5 מ"ל. מבנים יבשים עשויים להיות מאוחסנים בטמפרטורת החדרעד עיבוד נוסף.
3. לכל לבנות, להוסיף 200 μL 6 M HCl. מרתיחים ב 120 מעלות צלזיוס בלוק חימום למשך 2 שעות במכסה המנוע.
   זהירות: HCl הוא מאוד קורוזיבי וחומצי, השימוש מרתיחות הוכחה / בטוח לנעול צינורות או שיטה אחרת של צינורות הבטחה מומלץ.
4. צנטריפוגה צינורות לזמן קצר כדי לאסוף נוזלים, ולהשאיר אותם uncapped להתאדות ב 120 מעלות צלזיוס בלוק חימום עבור 1.5 שעות במכסה המנוע קטר.
5. Resuspend גלולה כתוצאה 200 חיץ hydroxyproline μL. חנות ב -20 מעלות צלזיוס עד הצורך.
   1. הכן חיץ hydroxyproline. ב 300 מ"ל מים, להוסיף 16.6 גרם חומצת לימון, 4 חומצה אצטית מ"ל, 11.4 גרם NaOH ומערבבים עד מומס. PH כדי 6-6.5 ולהביא נפח עד 500 מ"ל. הוסף 250 μL טולואן כמו משמר חנות ב 4 ° C מוגן מפני האור.
6. הכינו ריאגנטים.
   1. הכן Trans-4-Hydroxy-L-proline. ממיסים במים כדי להפוך פתרון 4 מ"ג / מ"ל.
   2. הכן chloramine-T. ממיסים במים כדי להפוך פתרון 14.1 מ"ג / מ"ל.
   3. הכן אלדהיד פרכלורט. ממיסים 1.5 גרם 4-dimethylaminobenzaldehyde ב 6 מ"ל 1-propanol, 2.6 mL חומצה perchloric (זהירות: חמצן, מחמצן חזק, להשתמש באמצעי זהירות מתאימים), ו 0.5 מ"ל מים.
7. בתוך קבוצה של צינורות 1.5 מ"ל חדש, לדלל מדגם של כל גלולה resuspended במאגר hydroxyproline לנפח של 200 μL.
   הערה: הדילולים עשויים לנוע בין 1: 4 ל 1:50 מדגם: חיץ בהתאם לתכולת הקולגן הצפויה של המדגם; לכן יש צורך בבדיקת ניסוי וטעייה כדי לקבוע גורם דילול המתאים למדגם הדגימה הנתון (כלומר, למקם את הדגימות לכיוון אמצע העקום התקני).
8. הכן סטנדרטים hydroxyproline. לדלל hydroxyproline במאגר hydroxyproline (ראה סעיף 7.5.1) עד 80 מיקרוגרם / מ"ל. ביצוע דילולים סדרתי לעשות 6-8 200 תקנים μL בין 0-20 מיקרוגרם / מ"ל.
9. הוסף 150 μL 14.1 מ"ג /מ"ל כלורמין T פתרון לכל מדגם רגיל מדולל. וורטקס ו דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.
10. הוסף 150 μL אלדהיד פרכלוראט פתרון למדגם כל מדגם מדולל. וורטקס ו דגירה בבלוק חימום ב 60 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. להשליך את פתרון עודף אלדהיד פרכלורט כמו פסולת מסוכנת על פי תקנות מקומיות (מכיל חומצה perchloric).
11. אפשר סטנדרטים דגימות להתקרר, לפני aliquoting 200 μL של כל, כפולות, לתוך צלחות 96-היטב.
12. קרא צלחת ב 550 ננומטר ספקטרופוטומטר. להשליך את הצלחת ואת נפח הנותרים צינורות 1.5 מ"ל כמו פסולת מסוכנת על פי תקנות מקומיות (מכיל חומצה perchloric).
13. חישוב סך קולגן חלק קולגן.
    1. המר את הערך absorbance עבור כל מדגם מיקרוגרם של hydroxyproline באמצעות עקומת hydroxyproline רגיל.
    2. הכפל כל היטב על ידי 2.5 לחשב כמות hydroxyproline בהמדגם המדולל. נזכיר כי רק 200 של 500 תערובת μL הכולל (200 μL מדולל מדגם + 150 μL כלוראמין T +150 μL AP פתרון) מתווסף כל מדגם היטב.
    3. הכפל ידי גורם דילול (סעיף 7.7) לחשב כמות hydroxyproline במדגם המקורי.
    4. לחלק לפי 0.137 לחשב את כמות הקולגן (מניחה כי קולגן מכיל 13.7% hydroxyproline ²⁰ ).
       הערה: שפע של hydroxyproline יונקים בקולגן משתנה מעט על פני רקמות ומינים יונקים; לדוגמה, חזיר וכבש אכילס גיד מכילים 13.5 ו 13.7% (מסה הידרוקספרוולינה / מסה רקמה יבשה), בהתאמה ²¹ . הנה, להשתמש 13.7% כדי להעריך hydroxyproline אחוזים אחוזים בקולגן, אשר משמש לחישוב התוכן קולגן של מדגם רקמה באמצעות המשוואה הבאה:
       
    5. מחלקים על ידי המסה היבשה כדי לחשב את קולגן קולגןCtion להמיר לאחוז.
       

8. כימות נקודות קצה מולקולריות

הערה: בנוסף לתוצאות העיקרי של בדיקות מתיחה ותוכן קולגן, endpoints מולקולרי ניתן למדוד על רקמות 2D או 3D כדי להוסיף תובנה מכניסטית. Bioassays ניתן להשתמש כדי לקבוע endpoints מולקולרית (ראה את הסעיף הבא להלן בהקשר הקשר ההשפעה של הסרום לאחר פעילות גופנית על תפקוד במבחנה ליגמנט).

1. עבור רקמת 3D:
   1. הכינו מבנים בהתאם לשלב 5 לעיל.
   2. לאחר בניית טיפול / התערבות, הצמד להקפיא בונה חנקן נוזלי.
   3. בעזרת טיט ועלי קירור על קרח יבש, לטחון בונה לתוך אבקה. המשך בשלב 8.4 / 5).
2. עבור רקמות 2D:
   1. התרבות האנושית ACL fibroblasts כדי מפגש באחדOlayer שש צלחות היטב המכיל DMEM.
   2. לשאוב DMEM וליישם התקשורת טיפול על פי אסטרטגיית הניסוי שלך ( למשל , קורס זמן או ניסויים בתגובה המינון).
   3. לשאוב התקשורת התקשורת לשטוף תאים עם PBS.
   4. תאים לגרד לאסוף באמצעות חיץ החילוץ המתאים / מגיב (ראה הבא).
3. ניתוח ביטוי חלבון: השתמש במאגר החילוץ cytosolic ( למשל , סוכרוז 250 מ"מ, 50 מ"מ טריס pH 7.4, 5 מ"מ MgCl2, ו קוקטייל פרוטאז / phosphatase מעכב) כדי להשיג lysates חלבון. ביצוע assay ריכוז חלבון וניתוח להמשיך על פי נהלים תקן המערבי כתם.
4. ניתוח ביטוי גנים: לבודד RNA הכולל באמצעות 500 μL בידוד RNA מגיב על פי הוראות היצרן כדי להשיג באיכות גבוהה RNA. בצע שעתוק לאחור בזמן אמת ניתוח כמותי PCR על פי נהלים סטנדרטיים.
5. בידוד דנ"א: בידוד לכמת gדנ"א אטומי באמצעות דנ"א בידוד מגיב על פי הוראות היצרן. לכמת את ריכוז ה- DNA באמצעות ספקטרופוטומטר כדי למדוד את absorbance מדגם ב 260 ננומטר.

תוצאות

סקירה כללית של מבנה הלגמה המהונדס והתערבות ניסיונית

איור 1 מציג סקירה של היווצרות של מיתרים מהונדסים. צמנט ברושיט, חומר תחליפי עצם ²² מיוצר על ידי שילוב של חומצה אורתופוספורית / פתרון חומצת לימון עם פוספט β-tricalcium בבארות גלילי. לחלופין, אם לא ישירות מדידה פונקציה מכנית של הרקמות, 3-0 משי sutures יכול לשמש עוגנים היווצרות של רקמות. אלה הם הצמיד 12 מ"מ מלבד מנות מצופה 35 מ"מ סיליקון מעוקר על ידי השריית באתנול 70%. Fibroblasts מבודדים שרידים ליגמנט הקדמי הצלב שהושג במהלך ניתוח שחזור ACL. לאחר התרחבות, 2.5 x 10 ⁵ תאים הם encapsulated בג 'ל פיברין נוצר במרקחת צלחת המבורשת עוגן צלחת. לאחר היווצרות, רצועה constrUcts ניתן לבדוק שינויים בתכונות מכניות, תוכן קולגן, התפשטות תאים, ביטוי גנים, רמות חלבון, מורפולוגיה רקמות.

לאורך התרבות, התאים חוזה את הג 'ל הפיברין וליצור רקמה ליניארית בין שני עוגנים ( איור 2 א ). לאחר 1-2 ימים בתרבית, התאים יש המצורפת ג'ל פיברין, תהליכים תא המורחבת, והחל להפעיל כוחות המתיחה ( איור 2 ב ). כמו ג'ל פיברין הוא התכווץ על ידי כוחות המתיחה נשבר על ידי אנזימים הסלולר, המתח נוצר בין שתי נקודות עוגן תאים שלנו ליישר במקביל לציר זה ( איור 2 ב ) ולהתחיל להפקיד קולגן. לאחר 4-5 ימים, המבנים התכווצו סביב עוגנים להרכיב רקמה גלילית ליניארית ( איור 2 א , בשלב זה גירויים חיצוניים עשויים להיות מיושמים על המערכת (intervEntion בשלב זה נמנע שיבוש תהליך היווצרות רקמות ליניארי). התערבויות עשויות לכלול השלמת התקשורת התרבותית בסרום אנושי או בבעלי חיים לאחר התערבות נתונה, ציטוקינים אקסוגניים וגורמי גדילה, שימוש בגירוי מכני או שינוי גורמים סביבתיים אחרים כגון מתח חמצן. באמצעות התקשורת צמיחה (DMEM עם 10% FBS ו 100 U / מ"ל ​​פניצילין) בתוספת 200 מיקרומטר חומצה אסקורבית, 50 מיקרומטר L-proline, ו 5 ng / mL TGF-β1, קבענו כי התפשטות תאים ממשיך לאורך תרבות 2 שבועות ( איור 2C ) ואכן, מיקרוסקופ אור מגלה רקמה צפופה המכילה תאים מיושרים מאוד 14 ימים של תרבות ( איור 2 ב ).

הערכת רצועות מהונדסות

בסוף תקופת התרבות, רצועות מהונדסות ניתן להעריך בווארייטY של דרכים. יתרון גדול של מערכת זו היא היכולת לקבוע שינויים פונקציונליים לרקמה באמצעות בדיקה מכנית, הערכה חיונית בהתחשב בתפקיד מכני של הליגמנט הילידים. בדיקות מתיחה Uniaxial ניתן להשתמש כדי למדוד תכונות מכניות כולל עומס לכישלון, חוזק מתיחה האולטימטיבי, מודולוס של יאנג. תכונות Viscoelastic ניתן גם למדוד עם הרפיה מתח בדיקות זחילה. איור 3 א מתאר ליגמנט מהונדסים שנערך אחיזה מכווצת לאחור בבוחן מתיחה uniaxial בנוי אישית. אחיזה ימין מחובר מתמר כוח למדוד את העומס על פני הרצועה כמו הרקמה הוא מתוח לכישלון. איור 3 ב מראה נציג מתח מתח זן למבחן לכישלון. לאחר שעברו בדיקות מכניות, מבנים זהה יכול להיות מיובש ומעובד assay hydroxyproline ²³ כדי להעריך את התוכן קולגן הכולל, כמו גם bioche אחריםמבחני mical. עם מספר מספיק של דגימות נוספות לכל תנאי, בדיקה יסודית של התערבות ניסיונית ניתן לבצע, כולל השפעתה על התפשטות תאים, ביטוי גנים וחלבון, מורפולוגיה היסטולוגית. בעוד 14 ימים היא נקודת קצה טיפוסית ללימודינו, רצועות מהונדסות ממשיכות לשפר את התכונות המכאניות שלהן ואת התוכן קולגן דרך 28 ימים של התרבות כפי שמוצג באיור 3C והוא יכול לשרוד לפחות 3 חודשים בתרבות ²⁴ .

השתנות התורם היא שיקול חשוב לשיחזור ניסיוני. איור 4 מציג ניסוי מייצג שדווח על ידי Lee et al. ²⁵ בהשוואה ל -7 תורמי ACL שונים (n = 3 זכר ו- n = 4 נקבה) המדגימים מאפייני מתיחה טיפוסיים ותוכן קולגן לאחר תרבות בת שבועיים בשבוע הקודם בתוספת התקשורת הצמיחה. שימוש בתאים מאוספי ACL דומים, גיל התורם, זמן לאחר פציעה, מין וכו ', הרצועות המהונדסות מדגימות שונות נמוכה בין התורמים למאפיינים דומים בין תורמים לגבר, למעט ההבדל בשבר קולגן. במחקר הנ"ל שימשו רצועות מהונדסות כמודל במבחנה כדי לחקור מדוע נשים נמצאות בסיכון גבוה משמעותית לפציעה של ACL מאשר לגברים, והוכיחו כי פיברובלסטים של ACL המבודדים מתורמות נשיות אינם יוצרים באופן טבעי רצועות חלשות מהונדסות פחות ופחות קולגן.

ההשפעה של הסרום לאחר פעילות גופנית בסרום על תפקוד ליגמנט במבחנה

הוכחנו בעבר את היכולת של רצועות מהונדסות לשמש כדי לחקור תהליכים פיזיולוגיים ^{1 ,}Ss = "xref"> 25. בניסוי המייצג הבא כפי שדווח על ידי West et al. ¹ , קבענו את ההשפעות הביוכימיות של התרגיל על תפקוד הליגמנט ולהאיר את המתודולוגיה ואת הממצאים כאן. הקמנו גידים מהונדסים תוך שימוש בתאי ACL אנושיים והשתמשנו בהתערבות, ביום 7 של התרבות, המורכבת ממדיה תרבותית המותנית בסרום אנושי שנאסף לפני או לאחר האימון. בקצרה, גייסנו גברים צעירים בריאים וגבינו דגימות דם לפני ואחרי התקף חריף של תרגילי התנגדות שמגביר את ההורמונים וההורמונים בציטוקינים, כולל הורמון גדילה אנושי (GH). הסרום האנושי היה מבודדים דגימות דם לפני ואחרי פעילות גופנית והשתמשו במקום בסרום שור העובר בתקשורת התרבות עבור השבוע השני של תרבות המהונדסים מהונדסים ( איור 5 א ). דגימות סרום לאחר ואחרי האימון נותחו באמצעות ELISA לשינויים ב- GH ובגורם הצמיחה דמוי האינסולין 1 (IGF-1),ריכוז אשר ניתן לשנות על ידי תרגיל ( איור 5 ב ). מידע זה שימש לקישור השפעות סרום על הרצועות המהונדסות עם שינויים בסרום בתגובה לאימון. לאחר תקופה של 14 יום תרבות, מבניות הליגמנט הוערכו באמצעות בדיקה מכנית וקביעת hydroxyproline של תוכן קולגן והוכיחו עלייה משמעותית הן עומס מתיחה מקסימלית תוכן קולגן בתגובה לסרום שלאחר האימון. במטרה להעריך האם השפעה זו קשורה לשחרור של GH או IGF-1, רצועות מהונדסות נוצרו בניסוי נפרד וטופלו בתגובת מינון של GH רקומביננטי או IGF-1. מעניין, בעוד GH בסרום עלה בדם ( איור 5B -i), הגדלת בהדרגה ריכוז רקומביננטי GH בתקשורת התרבות לא להגדיל את התוכן קולגן ( איור 5D -i) או מכנימאפיינים (נתונים לא מוצגים) ברצועות מהונדסות. לעומת זאת, רמות ה- IGF-1 בסרום לא גדלו לאחר האימון, אך ניסוי תגובה-מיגדר גילה כי רמות גבוהות יותר בתקשורת התרבות שיפרו את התוכן קולגן של מבנים ליגמנט ( איור 4D- II). לכן, בעוד שהפעילות הגופנית גרמה לעלייה חדה בתפקוד GH לאחר ההתעמלות, ניסוי התגובה-מינון באמצעות rhGH מעלה ספק באשר לשאלה האם GH אחראי באופן ישיר לשיפור פנוטיפי של הרצועות המהונדסות (לפחות, ה- 22 kDa isoform בלבד אינו נראה אחראי). לעומת זאת, בעוד ש- IGF-1 בסרום לא השתנה לאחר 15 דקות לאחר האימון, בדיקת ה- RIGF-1 על פני טווח רחב של ריכוזים העלתה כי IGF-1 מסוגל לשפר את תוכן הקולגן; עם זאת, יש לציין כי הגדלת ריכוז -1 ריג 'י דרך טווח כי רמות פיזיולוגיות מוערך לא להגדיל באופן משמעותי את התוכן קולגן. לכן, המיוחד שלאחר האימון סרום enviroנמנט היה חשוב לשיפור המנגנון והקולגן של הרצועות המהונדסות.

במחקר שהודגש כאן, נפח הנפילה הניסויית היה מוגבל בשל שיקולים אתיים; כך, bioassays 2D לטווח קצר, אשר היו דרישות נמוכות יותר בסרום, שימשו כדי להמשיך לחקור את המנגנונים המולקולריים האחראים על הגידול קולגן שנצפתה. ACL fibroblasts היו מתורבת כדי מפגש של 6 גם צלחות וטיפל במשך שעה 1 עם מנוחה או לאחר פעילות גופנית בסרום, לעומת תגובות מינון של GH רקומביננטי, IGF-1, TGF-β1 ואת ההפעלה של מטרות PI3K / mTORC1 , ERK1 / 2, ומסמכי האיתות של סאמד נקבעו. בנוכחות סרום לאחר האימון, המסלול PI3K / mTORC1 ו- ERK1 / 2 הראה פעילות גדולה יותר כפי שהוערך על ידי זרחון של S6K ( איור 5D -i) ו ERK1 / 2 ( איור 5D- II), בהתאמה.בהשוואה לתגובות ההורמונים והציטוקינים, בעוד של- GH הייתה השפעה חיובית קטנה על איתות mTOR ( איור 5D- i) ו- IGF-1 הראו השפעה חיובית במינון הנמוך ביותר, שלושת הטיפולים של GH, IGF-1 ו- TGF -β1 לא הביא בחשבון את העלייה ב- PI3K / mTORC1 ו- ERK1 / 2. יחדיו, מודל הליגמנט התלת-ממדי שלנו והנתונים הדו-ממדיים הדו-ממדיים מצביעים על כך שסביבת הסרום שלאחר האימון יכולה לשפר את תפקוד הרצועות המהונדסות ותוכן קולגן באמצעות הפעלת מסלולי PI3K / mTORC1 ו- ERK1 / 2.

לסיכום, בעזרת מודל ליגמנט מהונדס בשילוב עם סרום ממוזג המימוש, הצלחנו לחקור את ההשפעה של סביבת סרום לאחר האימון על תפקוד ליגמנט מהונדס וקולגן, 2) לקשר בין השינויים ברמות הפנוטיפ של הליגמנט עם שינויים בריכוז ההורמון בסרום, במטרה לקבוע אילו שינויים בסרום הובילו לשינויEs ב רצועות מהונדסות, ו iii) להרחיב את היקף העבודה באמצעות bioassays 2D כדי לחקור מטרות מולקולריות של הסביבה ביוכימיים בסרום כדי לקבוע מנגנונים מולקולריים המופעלים על ידי בסרום שלאחר האימון המוביל שיפורים בתפקוד הליגמנט.

איור 1: סקירה כללית של היווצרות ושימוש ברצועות מהונדסות. עוגני צמנט מברשיט מיוצרים ומוצמדים לתוך לוחות מצופים סיליקון. Fibroblasts ראשוני מבודדים מורחבת שרידי ACL. רצועות מהונדסות נוצרות על ידי encapsulating fibroblasts בג 'ל פיברין סביב שני עוגני צמנט המברשת. רצועות מהונדסות מתורבתות ומטופלות עם הכימיקל הספציפי או המכני ( למשל , באמצעות bioreactor) גירויים הרצוי. בנקודת הקצה הרצויה, רצועות מהונדסות ניתן לאסוף ולהעריך עבור מכניקהL נכסים, ביטוי גנים, תוכן קולגן, ביטוי חלבון, היסטולוגיה. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 2. פיברובלסטים הליגמנט העיקרי ליצור פיברין מבוססי העצם מהונדסים ליגמנט פורש על שני עוגנים צמנט brushite. ( א ) לאורך זמן, את fibroblasts החוזה פיברין ג'ל סביב עוגנים צמנט המברשת יוצרים רקמה ליניארית. ( ב ) בשלושת הימים הראשונים, התאים לצרף את הג 'ל פיברין להפעיל כוחות המתיחה, יישור התאים עם הציר הארוך של המבנה. מעל 14 ימים, התאים יוצרים רקמת מיושר. סולם בר = 160 מיקרומטר. ( ג ) תוכן הדנ"א של הרצועות המהונדסות ממשיך לגדול oVer 14 ימים בתרבות כמו התאים להתרבות. הנתונים מוצגים כ- ± SD עם n = 3-4 מבנים לקבוצה. קבוצות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 3: תכונות מכניות ליגמנט מהונדסים ותוכן קולגן משתפרים עם הזמן. ( א ) מבנים ליגמנט נבדקים באופן חד-משמעי כדי לקבוע את ההשפעה של התערבות נתונה על תפקוד הליגמנט. כפי שמוצג, שני יצוק הפוך, 3D מודפס אחיזה להחזיק עוגנים בצורת הדדית כי הם גישור על ידי הגידים מהונדסים. עוגנים מצמידים מנוע stepper ומתמר כוח ליצור מתח / מתח הקימורים של רקמות נבדק, המאפשר תכונות מכניות ניתן לקבוע. ( B </ Strong>) נציג מתח עקומת זן מתוך רצועה מהונדסים מתוחים לכישלון. במשך 28 ימים, ( C ) חוזק מתיחה (UTS), ( D ) עומס מתיחה מקסימלי (MTL), ( E ) מודולוס יאנג, ו ( F ) חלק קולגן להמשיך ולשפר. הנתונים מוצגים כ- ± SD עם n = 5 מבנים לקבוצה. * מציין הבדל משמעותי מכל הקבוצות האחרות. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 4: רצועות מהונדסות ניתן להעריך עבור פונקציונליות ותוכן ביוכימי, הצגת השתנות התורם נמוך. רצועות הנדסה נוצרו 7 תורמים שונים (n = 3 זכר, n = 4 נקבה). לאחר שבועיים( B ) חוזק מתיחה סופי (UTS), ( C ) מודולוס יאנג, ( D ) אזור חתך (CSA), ( E ) סך התוכן קולגן לכל לבנות, ו ( F ) קולגן כמו שבריר של מסה יבשה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD ומשמעות סטטיסטית הייתה עם מבחן t של התלמיד. * מציין הבדל משמעותי מקבוצות אחרות (p <0.05). איור מותאם מ Lee et al. ²⁵ אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

איור 5. רצועות הנדסה להפגין שינויים מכניים וביוכימיים בתגובה bioloהתערבויות גומיות. ( A ) סרום היה מבודד משיכות דם שנאספו מן הנבדקים לפני (RestTx) ולאחר האימון (ExTx) והשתמשו בטיפול ברצועות מהונדסות בשבוע השני של התרבות. ( B ) (i) הורמון גדילה אנושי (GH) ו- (ii) רמות גורמי גדילה דמויי אינסולין (IGF) -1 ברמות הנותרות וסרום המימוש נמדדו באמצעות ELISA. ( C ) רצועות מהונדסות שטופלו ב- ExTx הראו שיפור בתוכן קולגן (i) עומס מתיחה מקסימלי. משמעות סטטיסטית של השוואות זוגיות (RestTx ו- ExTx) נותחה על ידי מבחן t עם רמת מובהקות ברמת p <0.05. ( D ) מינון התגובה של (i) GH ו (ii) IGF-1 שימש כדי לקבוע תרומות אפשריות של גורמים אלה לשינויים בתוכן קולגן עקב ExTx. E) bioassays 2D שימשו כדי להשוות את ההשפעות של מינונים גדלים של GH, RestTx, ו- ExTx על מטרות איתות מולקולרי כגון זרחון של (i) S6K ^Thr389 ו- (2) ERK1 / 2 ^{Thr202 / Tyr204} . השוואה סטטיסטית של יותר משתי קבוצות ניסיוניות בוצעה באמצעות ANOVA ו- HSD של Tukey. הנתונים מוצגים כפי שהוצגו כמו הממוצע ± SD. * מציין הבדל משמעותי בין שליטה (p <0.05) ו § מציין הבדל משמעותי מ 150 ng / mL ו 300 ng / mL IGF-1. איור מתואם ממערב ואח '. ¹ אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.

Discussion

כתב היד הנוכחי מתאר מודל של רקמת ליגמנט שהיא פלטפורמה ניסיונית שימושית לחוקרים עם קשת רחבה של נושאים מחקריים, החל בפיתוח רקמות ועד לשאלות טרנסלוציוניות / קליניות. מודל הליגמנט המהונדס המתואר כאן מבוסס על פרוטוקול רב-תכליתי שניתן להתאימו בנקודות שונות לאורך כל תהליך העבודה ( איור 1 ודיון ). יתר על כן, הטבע רדוקציוניזם מטבעו של הסביבה חוץ גופית יכול להיות קרוב יותר לתחום הפיזיולוגי על ידי השלמת התקשורת להאכיל עם מותנה האדם או בסרום החיה.

מבנים יכול להיווצר באמצעות fibroblasts ממגוון מקורות
בעוד המתודולוגיה ותוצאות נציג המוצגים כאן מבוססים על השימוש fibroblasts ACL העיקרי, פרוטוקול בידוד התא יכול להיות מותאם לאיסוף סוגים אחרים של fibroblasts ראשוני. כפי שתוארבאיור 4 , רצועות מהונדסות שנוצרו עם תאים ראשוניים המבודדים מתורמים אנושיים צעירים מראים שונות נמוכה של התורם. תאים ראשוניים מוגבלים על ידי בידוד ראשוני והגבלת מעבר; את השימוש של שורות תאים עשוי לשפר את reproducibility של ניסויים. השימוש בסוגי תאים אחרים עשויים לדרוש שינויים בתרבית התקשורת תאים וגיבוש ג'ל פיברין. לדוגמה, ראינו כי בתאי גזע mesenchymal האדם (MSCs) אינם מסוגלים ליצור רקמות ליניאריות בין עוגני צמנט brushite במשך 2 שבועות בעוד הסוס מעולה דיגיטליות מכופף פיברובלסטים הגידים, תאי מוח העצם תאים סטרומה, אפרוח חזה fibroblasts , ו Murine C3H10T1 / 2 MSCs במהירות החוזה לעכל את הג 'ל פיברין כדי ליצור רקמה ליניארית (תצפיות שלא פורסמו). ניגוד זה עשוי להיות תוצאה של הבדלים בקבלנות התא, התפשטות, וייצור אנזימים פיברינוליטיים.

יישום של כימיקליםו גירוי מכני
בשיטה המתוארת כאן, רקמות מבוססות פיברין סביב עוגנים צמנט brushite, ומאפשרת את היישום של גירוי מכני באמצעות bioreactor מתיחה ¹¹ , כמו גם עבור בדיקות מתיחה בסוף הנקודה. הנוכחות של המלט brushite מרכך רקמות רכות (enthesis) גם מהווה הזדמנות לחקירה נוספת ושיפור ^{22 , 26} (ראה סעיף יישומים קליניים להלן). זה בסביבה חוץ גופית , התרומה של גורמים כימיים מכניים ניתן לזהות בקלות רבה יותר; דוגמה לכך מוצגת בתרשים 5 , לפיה הופרדה ההשפעה של סביבת הסרום לאחר האימון מהגירויים המכניים של התרגיל. מחקרים פיילוט עשוי להיות נחוץ כדי לקבוע מסגרת זמן של התערבויות ניסיוניות, הרכב הטיפולים, ואת נקודות הקצה המתאימות כדי לצפות שינוי הנצפה. FoR, במחקר שלאחר הלידה ¹ , אורך הטיפול הניסיוני הוגבל על ידי אספקת הסרום ששימש להשלמת חומרי התקשורת, שממנה הורכבו מבנים בכל יום שני. יתר על כן, במהלך השבוע השני של התרבות, התקשורת התרבותית נוספה עם מנוחה או לאחר פעילות גופנית בסרום עם חומצה אסקורבית ו- L-proline נשמר תוך TGF-β1 הוסרה. TGF-β1 הוא גורם גדילה פרו-פיברוטי ידוע, אשר מגביר בסרום לאחר פעילות גופנית ²⁷ . לכן, כדי למנוע הסתרת השפעות TGF-β1 הקשורות לסרום שלאחר האימון, ציטוקין זה לא נשמר בתקשורת התרבותית.

זה מודל הנדסה מהונדסים יכול לשמש גם כדי לבדוק את ההשפעה של מתיחה מכנית. על ידי הנדסה לאחור הדוגמאות הדגם להחזיק את המברשת המלט עוגן מסתיים (בדומה בודק מתיחה uniaxial מתואר באיור 1 ), bioreactors למתוח יכול להיות מתוכנן כדי להתאים eng רצועות מוטות. המעבדה שלנו השתמשה בעבר מודל זה כדי לחקור את התגובה איתות מולקולרי של רצועות מהונדסים למתוח מתיחה uniaxial ב bioreactor ¹¹ בהתאמה אישית אשר יספק הבנה טובה יותר עבור תכנון רציונלי של פרדיגמה למתוח במבחנה או אפילו, פוטנציאלית, in vivo מתיחה / פעילות / יישומים טיפוליים.

הערכת רצועות מהונדסות
כמו בתרבות monolayer המסורתית, 3D בונה יכול להיות assayed עבור ביטוי הגן / חלבון; בנוסף, מורפולוגיה 3D שלהם גם מספק את ההזדמנות להעריך שינויים פונקציונליים מורפולוגיים ומבנים יכול להישמר בתרבות לטווח ארוך מחקרים ( איור 3 ). בעוד שרצועות מהונדסות אינן מקבילות לרצועות הילידים, הבוגרות, הן נושאות דמיון לגידים מתפתחים / מיתרים ומתנהגים באופן דומה לרקמות הילידים בתגובה לחומרים מזינים"26, גורמי גדילה ¹⁰ , הורמונים ²⁵ , ופעילות גופנית ^{11 , 28} לכן, בעוד שהזהירות מוצדקת לפני ביצוע הכללות רחבות מכל מודל במבחנה , תוצאות מבחני רצועות ליגמנט עשויות לחשוף או להודיע ​​על מנגנון פיזיולוגי מסוים שעלול להיות אחר בלתי אפשרי לחקור in vivo.

מוסף מדיה להאכיל עם סרום מותנה עבור מודל גמיש ודינמי עם יישומים נרחבים
מטבולום הסרום האנושי הוא תרכובת של 4,500 מרכיבים הכוללים, אך לא רק, גליקופרוטאינים, ליפופרוטאינים, נגזרות שומנים, מצעי אנרגיה, מטבוליטים, ויטמינים, אנזימים, הורמונים, נוירוטרנסמיטורים, ושפע של אבני בניין / ביניים. ²⁹ בדיקה נוספת של מטבוליום בסרום אנושי על פי מחלקות מורכבות ²⁹ מגלה תוספותOnal היתרונות של שילוב נסיוב ניסיוני לתוך ניסויים במבחנה. כלומר, רוב 4500 ~ תרכובות בסרום הם הידרופובי או נגזר שומנים בדם, מדגיש את החשיבות של חלבונים מחייב עבור תחבורה / solubilization. מכאן נובע כי ניסוי מסובך אנדיוגנית התחבורה הדינמיקה התחבורה, ומכאן bioavailability אינטראקציות היעד מורכב, יהיה כמעט בלתי אפשרי. לכן, נסיוב ניסיוני יעיל במיוחד עבור מחקר של תרכובות שידוע כי הם תלויים מולקולות אביזר עבור solubilization, תחבורה, יעד מחייב, מנגנון הפעולה.

למעבדה שלנו יש עניין רב בתועלת הבריאותית של פעילות גופנית. פעילות גופנית משפרת את תפקוד הסלולר והאיבר במגוון רחב של רקמות בכל הגוף ¹² , תופעה שניתן לייחס למגוון גורמים (לדוגמה, IL-6 ¹³ , IL-15 ¹⁴ , Meteorin-like ¹⁵ ,Exosomes ^{16 , 17} ) אשר משוחררים לתוך מחזורית מערכתית. הסמינר הביוכימי שלאחר ההתעמלות משקף גורמים המשוחררים הן כתוצאה מהורמונים של שרירים, והן כתוצאה משחרור של מערכת העצבים הסימפתטית של בלוטות הפרשה ( למשל , קורטיזול וקטכולאמינים מבלוטת יותרת הכליה ¹⁸⁾ . הורמון מן יותרת המוח הקדמית ¹⁹ ). לאחרונה השתמשנו במודל של סרום לפני ואחרי פעילות גופנית כדי לחקור את ההשפעות של האימון הביוכימי הממושך על רקמות מהונדסות. ¹ למרות שנותרו שאלות מחקר רבות הקשורות למחקר גופני, המודל אינו מוגבל בדרך זו. לדוגמה, ניתן להשיג סרום, ממקורות בעלי חיים או ממקורות אנושיים, בעקבות התערבויות תזונתיים או פרמקולוגיות, או מקבוצות גיל שונות או מאוכלוסיות קליניותS. בדרך זו, תרכובות אקזוגניות או אנדוגניות של עניין יהיו נוכריות בסרום ובמדיה הטיפולית, בכמויות ביו-זמינות ויפעלו עם רקמת המטרה בתיאום עם הסביבה האנדוגנית ( כלומר , בהקשר פיזיולוגי יותר). גישה זו היא דינמית, שכן קיימת סבירות גבוהה כי התערבות נתונה תפעיל אפקט רב-אברתי (ורב-תרכובות), ולפיכך יחול שינוי בסביבה הפיזיולוגית. בעוד גישה זו מציבה אתגרים מסוימים, שכן משתנים ביוכימיים מערכתיים מרובים משתנים בו זמנית, זוהי גישה שעשויה לסייע להתגבר על החסרונות של מתודולוגיה ניסיונית רדוקציוניסטית בלבד ^{31 , 32} . יחדיו, ביצוע סרום מותאם יחד עם רקמות מהונדסות ( in vitro biomimetic ) רקמות יכול לשמש ככלי פיזיולוגיה, תזונה ושאלות מחקר קליני.

יישומים קליניים רבים
המודל להנדסת רקמות המוצג כאן יכול לשמש כדי לחקור שאלות אנטומיות קליניות מחקר מסורתיים במודלים חוץ גופית לא יכול. רצועה או גיד in vivo מכיל רך ל-קשה רקמת המעבר האזור שנקרא enthesis. את enthesis, אשר חשוף פגיעה מכנית הקשורות ³³ , ניתן ללמוד בחתך רוחב באמצעות טכניקות מיקרוסקופיה היסטוכימית אלקטרונים ^{22 , 26} . זה ממשק ייחודי חשוב כפליים עבור אלה עם ניידות נמוכה או מוגבלת מאז חוסר פעילות גופנית פוגעת ביכולת של רקמת חיבור להעברת עומס לאזורים של ציות נמוך עד ³⁴ , וכתוצאה מכך בסופו של דבר ירידה כללית של תאימות רקמות סיכון מוגבר לפציעה.

המעבדה שלנו השתמשה לאחרונה זה מודל הנדסת רקמות ^{25 <}/ Sup> כדי להדגים אוכלוסייה אחרת, ספורטאיות, הנמצאות בסיכון לפציעות רקמות חיבור: שכיחות פציעות ACL גדולה פי חמישה בקירוב מזכריהן הגברים ³⁵ . מנגנונים פוטנציאליים העומדים בבסיס הפער בין המינים בפגיעה נחקרו על ידי טיפול במבני ליגמנט עם ריכוזים פיזיולוגיים של הורמון המין הנשי, אסטרוגן, בריכוזים שחיקו את השלבים במחזור החודשי. מעניין, ריכוז גבוה של אסטרוגן מעכב את ביטוי הגן ופעילות של lysl oxidase, האנזים העיקרי האחראי ליצירת ליזין ליזין חוצה קישורים מטריצה ​​קולגן של מיתרים וגיידים. חשוב לציין, 48 h של אסטרוגן גבוה (כדי לדמות את השלב follicular) ירד ליגמנט לבנות נוקשות מבלי לשנות את צפיפות הקולגן של המבנים. מנקודת מבט פיזיולוגית, הדבר מעיד על כך שהעליות ברמות הליגמנט אצל הנקבות עשויות לנבוע, לפחות בחלקן,היווצרות קישורים. מנקודת מבט ניסויית, ממצאים אלה מדגישים את התועלת של מודל בניית התלת-ממד, אשר אפשר לבחון את הפעילות המקושרת המקושרת. מנקודת מבט קלינית, מודל זה יכול לשמש כעת במהירות המסך עבור התערבויות שיכולות למנוע את ההשפעות השליליות של אסטרוגן של פונקציה ליגמנט.

הערות סיכום
כאן הצגנו מתודולוגיה מפורטת להיווצרות של מיתרים מהונדסים ואת התועלת שלהם כמו 3D במודל רקמות במבחנה . המודל מותאם מאוד למגוון רחב של מטרות, מתן גמישות בסוג התא, התערבויות, ואת מדדי התוצאה של עניין. השלמת חומרי הזנה עם סרום מותנה מוסיף הקשר פיזיולוגי כי לא ניתן להשיג בסביבה מסורתית במבחנה , שיפור הדוגמנות של פיזיולוגיה vivo . בקיצור, אנחנו מאמינים שזה מצב רלוונטיL עם השלכות מרגש עבור קידום הן בתחומי הפיזיולוגיה והנדסת רקמות.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Austerlitz Insect pins, minutien stainless steel, size 0.20	Entomoravia	N/A	For brushite cement anchors; include info on multiple sources and alternative products
β-tricalcium phosphate	Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, UK)	N/A	For brushite cement anchors; include whether it's hazardous /toxic
o-phosphoric acid, 85% (w/w)	EMD Millipore	PX0995	For brushite cement anchors; include info on preparation
Citric acid	Sigma-Aldrich	251275-500g	For brushite cement anchors
Falcon 35mm tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772A	For silicone-coated plates
Sylgard 184 silicone elastomer kit	Ellsworth Adhesives	4019862	For silicone-coated plates
1X Phosphate-buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	SH3002802	For cell isolation and expansion
100X antibiotic/antimycotic solution	VWR	45000-616	For cell isolation
Type II collagenase	Thermo Fisher Scientific	17101015	For cell isolation
100X penicillin/streptomycin solution	Thermo Fisher Scientific	15140122	For cell isolation
Steriflip-GP, 0.22 µm pore, polyethersulfone, gamma irradiated	EMD Millipore	SCGP00525	For reagent sterilization
DMEM high glucose with sodium pyruvate and L-glutamine	VWR	10-013-CV	For cell and tissue culture
Fetal bovine serum	BioSera	FBS2000	Component of tissue digestion media and growth media
Penicillin G Potassium Salt	MP Biomedicals	0219453680 - 100 MU	Component of growth media. Dissolve in water to 100,000 U/mL, filter sterilize, aliquot, and store at -20°C.
CELLSTAR polystyrene tissue culture dishes (145 x 20 mm)	VWR	82050-598	For cell culture
Trypan blue	Thermo Fisher Scientific	T10282	For cell isolation
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher Scientific	25200056	For cell culture. Dilute to 0.05% in PBS
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	472301	For cell freezing media
Nalgene Mr. Frosty Cryogenic Freezing Container	Thermo Fisher Scientific	5100-0001	For cell freezing
BD Vacutainer Red Plastic 10 ml	Fisher Scientific	367820	For human serum collection
Bound Tree Insyte Autoguard IV Catheters, 22ga x 1inch Needle	Fisher Scientific	354221	For human serum collection
Thrombin, bovine origin	Sigma-Aldrich	T4648-1KU	For engineered ligament formation. Dissolve at 200 U/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20°C.
Fibrinogen, bovine origin	Sigma-Aldrich	F8630-5G	For engineered ligament formation. Dissolve at 20 mg/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20°C.
Aprotinin from bovine lung	Sigma-Aldrich	A3428	For engineered ligament formation. Dissolve at 10 mg/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20°C.
6-Aminohexanoic acid	Sigma-Aldrich	07260-100g	For engineered ligament formation. Dissolve at 0.1g/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at 4°C.
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate	Sigma-Aldrich	A8960-5G	Component of feed media. Dissolve in DMEM high glucose media at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4°C.
L-proline	Sigma-Aldrich	P5607-25G	Component of feed media. Dissolve in PBS at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4°C.
Transforming growth factor-β1	Peprotech	100-21	Component of feed media. Reconsistute according to manufacturer's instructions at a concentration of 10 μg/mL. Aliquot and store at -20°C.
Stericup-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, 250 mL, radio-sterilized	EMD Millipore	SCGPU02RE	For reagent sterilization
Hydrochloric acid	Fisher Scientific	A144-212	Dilute in water to 6M
4-Dimethylaminobenzaldehyde	Sigma-Aldrich	39070-50g	For hydroxyproline assay
Chloramine-T trihydrate	Sigma-Aldrich	402869-100g	For hydroxyproline assay
trans-4-Hydroxy-L-proline	Sigma-Aldrich	H54409-100g	For hydroxyproline assay
1-propanol	Sigma-Aldrich	279544-1L	For hydroxyproline assay
Perchloric acid	Sigma-Aldrich	311421-250ml	For hydroxyproline assay
Acetic acid, glacial	EMD Millipore	AX0073-9	For hydroxyproline assay
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	S318-500	For hydroxyproline assay
Toluene, anhydrous	Sigma-Aldrich	244511-1L	For hydroxyproline assay
Corning Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates	Fisher Scientific	07-200-656	For hydroxyproline assay