ניתוח Dissection, סריקה microCT ו morphometric של Baculum

Summary

מבנים ביולוגיים רבים חסרים ציוני דרך להגדרה בקלות, מה שהופך אותו קשה ליישם שיטות morphometric המודרנית. כאן אנו מדגימים שיטות ללמוד את baculum העכבר (עצם הפין), כולל לנתיחה וסריקת microCT, ואחריו שיטות חישוביות להגדיר-ציוני למחצה המשמשים לכמת גודל וצורת וריאציה.

Abstract

morphometrics המודרנית מספקת שיטות רבות עצמה כדי לכמת וריאצית גודל וצורה. דרישה בסיסית רשימת קואורדינטות מגדירות ציוניות; אולם קואורדינטות כזה חייב לייצג מבנים הומולוגיים פני דגימות. בעוד אובייקטים ביולוגיים רבים מורכבים של ציוני דרך זיהו בקלות כדי לספק את ההנחה של הומולוגיה, רבים חסרים מבנים כאלה. פתרון אפשרי אחד הוא מתמטי-ציונים חצי מקום על אובייקט המייצג באותו האזור מורפולוגיים ברחבי דגימות. כאן, אנו ממחישים צינור שפותח לאחרונה להגדיר למחצה ציוני דרך מתמטית מן baculum העכבר (עצם הפין). השיטות שלנו צריכות לחול על מגוון רחב של חפצים.

Introduction

תחום morphometrics כולל מגוון של שיטות לכמת את הגודל והצורה של הטופס ביולוגי, צעד מהותי בחקירה מדעית ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} באופן מסורתי, הניתוח הסטטיסטי של גודל וצורה מתחיל על ידי זיהוי נקודות ציון על מבנה ביולוגי, ולאחר מכן מדידת מרחקים ליניארי, זוויות יחסיות, אשר יכול להיות מנותחת מסגרת רבה-משתנית. לנדמרק המבוסס הגיאומטרית Morphometrics הוא גישה אשר שומרת את המיקום המרחבי של ציוני דרך, שימור מידע גיאומטרי של איסוף נתונים באמצעות ניתוח להדמיה ^5. ניתוח סדום כללי (GPA) יכול להיות מיושם כדי להסיר וריאצית מיקום, סולם, וסיבוב של ציונים דרך לייצר יישור בין דגימות מinimizes ההבדלים בריבוע שלהם - מה שנותר הוא שוני בצורה ^7.

מושג חשוב של כל ניתוח morphometric הוא הומולוגיה, או את הרעיון כי אחד מהימן יכול לזהות את האתרים המייצגים תכונות משמעות ביולוגית ודיסקרטיות המתאימים בין דגימות או מבנים. לדוגמא, יש גולגלות אדם תהליכים הומולוגיים, foramina, תפרים, ותעלות שיכולים לאפשר morphometric מנתח. למרבה הצער, את זיהוי של ציוני דרך מקבילים קשה על פני רבי מבנים ביולוגיים, במיוחד אלה עם משטחים חלקים או עקומות ^{8, 9, 10.}

אנחנו מתקרבים בעיה זו מתחת שימוש בגיאומטריה חישובית. זרימת העבודה הכללית היא ליצור סריקה תלת ממדים של האובייקט שניתן לייצג כענן של נקודות, ולאחר מכן לסובב ולהפוך כי ענן נקודה כך שכל זהpecimens מכוון על מערכת קואורדינטות משותפת. אז אנחנו מתמטיים להגדיר-ציונים חצי מאזורים ספציפיים של האובייקט. חצי ציוני דרך דיסקרטית דגש על אזורים כאלה הן ביולוגיים שרירותיות ^11. ניצוח GPA ניתוחים סטטיסטיים רצף יכול לייצר חפצים לא רצויים ^{8, 12} משום ציונים דרך להציב באופן שרירותי לא יכול להיות ביולוגי הומולוגי. לכן, אנו נאפשר-ציונים חצי אלה מתמטיים "להחליק". הליך זה מצמצם את הפרש הפוטנציאלים בין מבנים. כפי שטען במקום אחר האלגוריתם זז משמש כאן ראוי לכמת אזורי אנטומיים דומים חסרי זיהה בקלות מקבילה ציוני דרך ^{3, 6, 8, 10, 11, 12.} שיטות אלה יש li שלהםmitations ^13, אבל צריך להיות בעל יכולת הסתגלות לאובייקטים של גודל וצורה שונים.

כאן, אנו מדגימים כיצד שיטה זו יושמה במחקר שנערך לאחרונה של baculum העכבר ^14, עצם הפין כי כבר צבר ואבד מספר פעמים עצמאיות במהלך האבולוציה של יונקי ^15. אנחנו דנים לנתיחה והכנת עצם ספציפי, baculum (פרוטוקול 1), הדור של תמונות microCT (פרוטוקול 2), ואת המרה של תמונות אלה לתבנית המאפשרת לכל בגיאומטריה חישובית במורד הזרם (פרוטוקולים 3 ו -4). אחרי השלבים הבאים, כל דגימה מיוצגת על ידי ~ 100K XYZ קואורדינטות. לאחר מכן, אנו עוברים דרך סדרה של טרנספורמציות כי ביעילות ליישר את כל הדגימות לתוך אורינטציה משותפת (הפרוטוקול 5), ואז להגדיר-ציוני חצי דגימות מיושרות (פרוטוקול 6). פרוטוקולים 1-4 צריכים להיות דומים ללא קשר של האובייקט להיות מנותח. 5 פרוטוקול ופרוטוקול 6 הם SPEcifically מיועד baculum, אך תקוותנו היא כי באמצעות פירוט הפעולות הבאים, חוקרים יכולים לדמיין שינויים זה יהיה רלוונטי עבור מושא העניין שלהם. לדוגמה, שינויים בשיטות אלה יושמו ללמוד עצמות לווייתנים האגן ועצמות הצלע ^16.

Protocol

כל הנהלים ואנשי אושרו על ידי אוניברסיטת מכון דרום קליפורניה טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש (IACUC), פרוטוקול # 11,394.

1. Baculum Dissection והכנה

1. להרדים עכבר זכר בוגר מינית באמצעות פחמן דו חמצני חשיפת יתר, על פי פרוטוקולים שנקבעו על ידי הוועדה לטיפול המוסדית בעלי החיים והשימוש הרלוונטי (IACUC).
2. הנח את החיה במצב שכיבה, ו מתארך הפין על ידי הפעלת לחץ בעזרת אגודלים לרוחב פתח preputial.
3. לאחר הפין הוא ממושך, להאריך את הרקמה דרך העורלה ככל האפשר.
4. עם מספריים, לחתוך את הפרוקסימלי גוף הפין אל העטרה שבו baculum מתגורר.
5. מעביר את הפין הגזור לצינור מיליליטר 1.7 ולהוסיף 200 μL מי ברז. ודא כי הפין הוא שקוע לחלוטין בתוך הנוזל.
6. דגירת הרקמות במים ב ~ 50 מעלות צלזיוס במשך 3-5 ימים.
7. לאחר דגירה כראוי, יש להסיר את הרקמה שמסביב מן baculum, באמצעות מלקחיים תחת מיקרוסקופ לנתיחה. בעדינות להשפריץ 70% אתנול להתנדף הנותרים רקמות ולנקות את העצם.
8. מניח את baculum גזור לתוך צינור microcentrifuge חדש עם הכובע פתוח. השאר מכסה פתוח O / N להתייבש עצם.

2. סריקת microCT

1. לחץ בעל סריקה גלילי microCT לתוך לבנים של קצף פרחים ליצור גליל קצף פרחים.
2. חלץ את גליל קצף הפרחים לחתוך פרוסות ~ 2-5 ס"מ עובי.
3. Push היבש bacula לתוך קצף הפרחים, סביב בפריפריה של פרוסה בודדת כדי למזער הפרעה במהלך סריקה. האורינטציה המדויקת של עצמות חובה לציין המאפשר זיהוי נכון של דגימות בודדות בפרוטוקול 4.
4. בעדינות במקום פרוסה עם העצמות מוטבעות לתוך מחזיק microCT.
5. רוכשת סריקות microCT. במקרה של העכבר bacula ¹⁴ השתמשנו סורק uCT50 (AG רפואי Scanco, ברוטיסלן, שוויץ) במרכז הדמיה מולקולרית USC תחת ההגדרות הבאות: 90 KVP, 155 מיקרו-אמפר, 0.5 מ"מ מסנן אל, 750 תחזיות לכל 180 (360 כיסוי), זמן החשיפה של 500 ms, וגודל voxel של 15.5 מ"מ.

3. עיבוד microCT: המרת .DCM סטאק לקובץ .xyz יחיד

הערה: כל סריקת microCT מייצרת ערימה של .DCM, או "DICOM", קבצים מייצגים פרוסות תמונה נלקח דרך האובייקט. כל בגיאומטריה חישובית במורד דורשת קבצי .xyz שטוחים, אשר היא פשוט קובץ טקסט המכיל ארבעה עמודים - x, y, ו Z קואורדינטות של כל פיקסל, ואת עוצמת פיקסל, החל -5000 (שחור) עד 5000 (לבן). סף פיקסל מעל 3,000 בדרך כלל עובד גם סף להגדרת עצמות.

1. התקן פייתון (www.python.org) ואת המודולים "פייתון" פקודות, DICOM, PYLAB, SYS, ו numpy.
2. 01_pr פתח "ocess_dicom.py "{Figshare} עם כל עורך טקסט. על פי סעיף משתנים, נתיב השינוי, ספי פיקסל, ושמות הספרייה לפי הצורך.
3. הפעל "פיתון 01_process_dicom.py". התקדמות תודפס למסך. בתוך כל תיקייה בשם בשלב 3.2, קובץ חדש מובא בשם; למשל, directory_name.PT3000.xyz, שבו PT3000 מציין את סף פיקסל שצוין בשלב 3.2.

4. עיבוד microCT: פילוח-אאוט פרט דגימת .xyz קבצים

1. התקן R (https://www.r-project.org/) עם RGL הספרייה.
2. פתחו את הקובץ '02_segment_dicoms.r' {Figshare} עם כל עורך טקסט. על פי הסעיף משתנה, לשנות את שם הנתיב להצביע על קובץ .xyz נוצר בפרוטוקול 3 לעיל.
3. מתוך R, הפעל את הפקודה "המקור (" 02_segment_dicoms.r ') "(ללא מרכאות).
4. לאחר שלושת ממדי התמונה של הקובץ .xyz נוצר בפרוטוקול 3 מופיע, הזן את number של דגימות בקובץ .xyz הכולל. עליו מדבקה ובחר את נקודות מכל הדגימה באמצעות פונקציות גלילה וזום.
   הערה: ברקע, קבצי .xyz נפרדים ייעשו עבור כל דגימה. אלו מופיעות ספרייה בשם, למשל, XYZ_FILES_PT3000, שבו PT3000 מציין את סף פיקסל בשימוש.

5. "יישור" הדגימה .xyz קבצים לקואורדינטות נפוצות.

1. פתח את סקריפט פייתון "03_transform.py" {Figshare}, המחייב את mattdean_modules.py מודול נוסף {Figshare}, וכן שני יישומים עומד עצמית: "rotate_translate_cylindrical" (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) ו "qconvex" (www.qhull.org/html/qconvex.htm) המשמשים התסריט הזה.
2. על פי הסעיף משתנה, לזהות את שמות נתיב המלאים mattdean_modules.py, rotate_path ו qconvex_dir. בנוסף, לזהות את הנתיב המלא אל הספרייה המכילה את .xy הפרטקבצי z שנוצרו בשלב 4.
3. 03_transform.py לרוץ, אשר יוצר קובץ חדש לכל דגימה עם הסיומת .TRANSFORMED.xyz.

6. דגימה "חיתוך" מיושרת .xyz קבצים לזהות-ציונית חצי.

1. להרחיב ולהפעיל את סקריפט פייתון "04_identify_landmarks.py" {Figshare}. במקטע משתנה, לזהות שמות מלאי נתיב לספרייה המכילה את קבצי .TRANSFORMED.xyz. סקריפט זה מזהה 802-ציוני למחצה, שניתן להשתמש בהם כדי לכמת הגודל והצורה של המבנה.

תוצאות

קואורדינטות xyz של האתרים ההסטוריים חצי יוצר הפרוטוקול 6 ניתן לייבא ישירות לתוך כל ניתוח morphometrics הגיאומטרי מבוסס ציון ^17. הצינור חישובית מעל יושם ללמוד עכבר bacula ^14, כמו גם אגן לווייתן עצמות צלעות ^16. פרטים נוספים על ...

Discussion

השלבים הקריטיים בפרוטוקול לעיל הם 1) לנתח את bacula, 2) איסוף תמונות microCT, 3) המרת פלט microCT לקובץ שטוח של XYZ קואורדינטות, 4) פילוח מתוך כל ענן הנקודה של דגימה, 5) הפיכה כל דגימה סטנדרטי מערכת קואורדינטות, ו -6) הגדרה-ציוני למחצה. כל הצעדים הללו היא לשנות בקלות כדי להתאים חפצים שוני...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting scissors	VWR	470106-338	Most sizes should work
Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved	VWR	82027-406
1.7 mL microcentrifuge tube	VWR	87003-294
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	CAS 64-17-5	To be diluted to 70% for dissections
Floral Foam	Wholesale Floral	6002-48-07
uCT50 scanner	Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland