Dissecação, digitalização MicroCT e morfométricas Análises do Baculum

Resumo

Muitas estruturas biológicas falta marcos facilmente definíveis, o que torna difícil a aplicação de métodos morfométricos modernos. Aqui, ilustramos métodos para estudar o báculo rato (um osso do pénis), incluindo dissecção e digitalização microCT, seguido por métodos computacionais para definir semi-chave que são utilizadas para quantificar a forma e tamanho variação.

Resumo

morfometria modernos fornece métodos poderosos para quantificar o tamanho e forma variação. Um requisito básico é uma lista de coordenadas que definem marcos; no entanto, tais coordenadas devem representar estruturas homólogas em toda espécimes. Enquanto muitos objetos biológicos consistem de marcos facilmente identificadas para satisfazer a hipótese de homologia, muitos não têm tais estruturas. Uma possível solução é matematicamente lugar semi-marcos em um objeto que representam a mesma região morfológica através de espécimes. Aqui, nós ilustrar um gasoduto recentemente desenvolvido para definir matematicamente semi-marcos do rato baculum (osso do pênis). Os nossos métodos deve ser aplicável a uma vasta gama de objectos.

Introdução

O campo de morfometria inclui uma diversidade de métodos para quantificar o tamanho e a forma da forma biológica, uma etapa fundamental na investigação científica ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Tradicionalmente, a análise estatística de tamanho e forma começa pela identificação de pontos de referência em uma estrutura biológica, e depois medir distâncias lineares, ângulos e proporções, que podem ser analisadas num quadro multivariada. -Marco com base geométrica Morfometria é uma abordagem que mantém a posição espacial de pontos, preservando informações geométricas de coleta de dados por meio de análise e visualização ^5. Análise Procrustes Generalizada (GPA) pode ser aplicada para remover a variação na localização, dimensão e rotação dos pontos de referência para produzir um alinhamento entre amostras que a Minimizes suas diferenças ao quadrado - o que resta é a forma dissimilaridade ^7.

Um conceito importante de qualquer análise morfométrica é homologia, ou a ideia de que se pode identificar com segurança marcos representando características biologicamente significativas e discretas que correspondem entre amostras ou estruturas. Por exemplo, crânios humanos têm processos homólogos, forame, suturas, e dutos que podem permitir análises morfométricas. Infelizmente, a identificação de pontos de referência correspondente é difícil em muitas estruturas biológicas, especialmente aqueles com superfícies lisas ou curvas ^{8, 9, 10.}

Nós abordar este problema a seguir utilizando geometria computacional. O fluxo geral é para gerar uma análise tridimensional do objecto que pode ser representada como uma nuvem de pontos, e em seguida rodar e que transformar nuvem de pontos de modo a que todos specimens são orientados em um sistema de coordenadas comum. Então nós definimos matematicamente semi-marcos de regiões específicas do objeto. Discretas semi pontos de referência colocadas em tais regiões são biologicamente arbitrário ^11. Realização GPA e as análises estatísticas subsequentes podem produzir artefatos indesejáveis ^{8, 12,} porque os marcos colocados arbitrariamente pode não ser biologicamente homóloga. Portanto, permitimos que estas meias-marcos para matematicamente "slides". Este procedimento minimiza a diferença de potencial entre as estruturas. Como argumentei o algoritmo de correr aqui utilizada é apropriada para quantificar regiões anatômicas semelhantes faltam facilmente identificados marcos ^{3, 6, 8, 10, 11, 12} correspondente. Esses métodos têm o seu limitations ^13, mas deve ser adaptável para objectos de tamanho e forma diferentes.

Aqui, nós ilustrar como este método foi aplicado em um estudo recente da baculum rato ^14, um osso no pênis que tem sido ganhou e perdeu várias vezes independentes durante a evolução dos mamíferos ^15. Discute-se a dissecção e preparação de um osso específico, o báculo (Protocolo 1), a geração de imagens microCT (protocolo 2), ea conversão destas imagens para um formato que permite que toda a geometria computacional jusante (Protocolos 3 e 4). Após estas etapas, cada amostra é representado por ~ 100K xyz coordenadas. Em seguida, a pé através de uma série de transformações que efetivamente alinhar todas as amostras em uma orientação comum (Protocolo 5), em seguida, definir semi-marcos de espécimes alinhados (Protocolo 6). Protocolos 1-4 deve ser semelhante, independentemente do objeto analisado. O protocolo nº 5 e Protocolo 6 são specamente projetado para um báculo, mas é nossa esperança que, detalhando estes passos, os investigadores podem imaginar modificações que seriam relevantes para o seu objeto de interesse. Por exemplo, foram aplicadas modificações destes métodos para estudar ossos pélvicos baleia e costelas ^16.

Protocolo

Todos os procedimentos e pessoal foram aprovados pela universidade do instituto do sul da Califórnia para Animal Care e do Comitê Use (IACUC), protocolo nº 11394.

1. Baculum Dissecção e Preparação

1. Euthanize um rato macho sexualmente maduros através de dióxido de carbono sobre-exposição, de acordo com protocolos estabelecidos pelo Comité pertinente Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC).
2. Coloque o animal em decúbito dorsal, e prolongar o pénis através da aplicação de pressão com os polegares lateralmente à abertura do prepúcio.
3. Uma vez que o pénis é prolongada, alargar o tecido através do prepúcio, tanto quanto possível.
4. Com uma tesoura, corte o proximal do corpo do pénis à glande do pénis onde o baculum reside.
5. Transfira os pénis dissecados para um tubo de 1,7 ml e adicionar 200 mL de água da torneira. Certifique-se de que o pênis está totalmente submersa no líquido.
6. Incubar o tecido em água a ~ 50 ° C durante 3-5 dias.
7. Após incubação adequada, remova o tecido circundante do báculo, usando uma pinça sob um microscópio de dissecação. Gentilmente esguichar 70% de etanol para empurrar restante tecido e limpar o osso.
8. Colocar o báculo dissecados para um novo tubo de microcentrifugação com a tampa aberta. Deixe tampão aberto O / N a secar óssea.

Digitalização 2. MicroCT

1. Pressione um suporte cilíndrico digitalização microCT em um tijolo de espuma de florista para criar um cilindro de espuma de florista.
2. Extraia o cilindro de espuma de florista e cortar fatias ~ 2-5 cm de espessura.
3. Empurrar bacula seca na espuma florista, em torno da periferia de uma fatia individual a minimizar a interferência durante a verificação. A orientação precisa dos ossos deve ser comentou permitindo a identificação adequada das amostras individuais no Protocolo 4.
4. Delicadamente, coloque a fatia com os ossos incorporados no suporte para microCT.
5. Adquirir scans microCT. No caso de bacula rato ¹⁴ , Foi utilizado um scanner uCT50 (Scanco Medical AG, Bruttisellen, Suíça) na USC Molecular Imaging Center sob as seguintes configurações: 90 kVp, 155 mA, 0,5 filtro mm Al, 750 projecções por 180 (cobertura de 360), tempo de exposição de 500 ms e tamanho voxel de 15,5 mm.

3. Processamento MicroCT: Convertendo um Stack .dcm para um arquivo .xyz Individual

NOTA: Cada varredura microCT produz uma pilha de .dcm, ou "DICOM", arquivos que representam fatias de imagem obtidos através do objeto. Toda a geometria computacional jusante requer arquivos .xyz planas, que é simplesmente um arquivo de texto que contém quatro colunas - X, Y e Z coordenadas de cada pixel, e a intensidade do pixel, que vão desde -5000 (preto) para 5000 (branco). Um limiar do pixel acima de 3.000 geralmente funciona bem como um limiar para a definição de ossos.

1. Instalar Python (www.python.org) e os módulos Python COMANDOS, DICOM, Pylab, SYS e Numpy.
2. Open "01_process_dicom.py "{} Figshare com qualquer editor de texto. Na seção Variáveis, caminho de mudança, limites de pixels, e nomes de diretórios, conforme necessário.
3. Execute "01_process_dicom.py python". Progress será impresso para a tela. Dentro de cada diretório nomeado na etapa 3.2, um novo arquivo é chamado; por exemplo, directory_name.PT3000.xyz, onde PT3000 indica o limiar do pixel indicado no passo 3.2.

4. Processamento MicroCT: Segmentando-out individual Specimen .xyz Arquivos

1. Instale R (https://www.r-project.org/) com o RGL biblioteca.
2. Abra o arquivo '02_segment_dicoms.r' {} Figshare com qualquer editor de texto. Na seção Variáveis, mudar o nome do caminho para apontar para o arquivo .xyz criado no Protocolo n.º 3 acima.
3. De dentro R, execute a "fonte ( '02_segment_dicoms.r')" comando (sem as aspas).
4. Após a imagem tridimensional do .xyz criado no Protocolo n.º 3 aparecer, digite o number de espécimes no arquivo geral .xyz. Em seguida, rotular e selecionar os pontos de cada amostra, utilizando as funções de rolagem e zoom.
   NOTA: No fundo, arquivos .xyz separadas será feita para cada espécime. Estes aparecem em um diretório chamado, por exemplo, XYZ_FILES_PT3000, onde PT3000 indica o limite de pixel usado.

5. "Alinhar" Specimen .xyz arquivos para Coordenadas Comum.

1. Abra o script "03_transform.py" Python {Figshare}, que exige a mattdean_modules.py adicional módulo {Figshare}, bem como duas aplicações autónomas: "rotate_translate_cylindrical" (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) e "qconvex" (www.qhull.org/html/qconvex.htm) que são usados ​​por este script.
2. Na seção Variáveis, identificar os nomes caminho completo para mattdean_modules.py, rotate_path e qconvex_dir. Além disso, identificar o caminho completo para o diretório que contém o .xy indivíduoarquivos z criou na etapa 4.
3. 03_transform.py executado, o que cria um novo arquivo por espécime com o sufixo .TRANSFORMED.xyz.

6. "fatiamento" Specimen Alinhados .xyz Arquivos identificar Semi-marcos.

1. Abrir e executar o script Python "04_identify_landmarks.py" {} Figshare. Na seção Variáveis, identificar nomes de caminho completo para o diretório que contém os arquivos .TRANSFORMED.xyz. Este script identifica 802 semi pontos de referência que pode ser usado para quantificar o tamanho e forma da estrutura.

Resultados

As coordenadas xyz das meias-marcos produzidos no Protocolo 6 pode ser diretamente importado para qualquer morfometria geométrica análise baseada no marco ^17. O oleoduto computacional supra foi aplicado para estudar bacula rato ^14, bem como pélvica baleia e as costelas ^16. Mais detalhes sobre a definição computacional de semi-marcos são apresentados aqui, em uma tentativa de ajudar os pesquisadores a visualizar...

Discussão

As etapas críticas do protocolo acima são: 1) dissecar o bacula, 2) coleta as imagens microCT, 3) converter a saída microCT para um arquivo plano de coordenadas XYZ, 4) segmentar a nuvem de pontos de cada espécime, 5) transformar cada amostra para um padronizado sistema de coordenadas, e 6) que define semi-marcos. Estes passos são facilmente modificado para acomodar diferentes objectos.

Estes métodos podem provavelmente ser aplicado a qualquer objecto que, pelo menos, não é, essencia...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting scissors	VWR	470106-338	Most sizes should work
Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved	VWR	82027-406
1.7 mL microcentrifuge tube	VWR	87003-294
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	CAS 64-17-5	To be diluted to 70% for dissections
Floral Foam	Wholesale Floral	6002-48-07
uCT50 scanner	Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland