Dissezione, microCT scansione e morfometriche analisi del Baculum

Riepilogo

Molte strutture biologiche mancano punti di riferimento facilmente definibili, il che rende difficile applicare moderni metodi morfometrici. Qui illustriamo metodi per studiare la baculum mouse (un osso nel pene), compresa la dissezione e la scansione microCT, seguita da metodi computazionali per definire semirimorchi punti di riferimento che sono usati per quantificare dimensione e forma variazione.

Abstract

morfometria moderni fornisce potenti metodi per quantificare dimensioni e la forma di variazione. Un requisito fondamentale è un elenco di coordinate che definiscono punti di riferimento; tuttavia tali coordinate devono rappresentare strutture omologhe tra i campioni. Mentre molti oggetti biologici costituiti da punti di riferimento facilmente identificabili per soddisfare l'ipotesi di omologia, in molti casi mancano tali strutture. Una possibile soluzione è quella di Matematicamente luogo semi-punti di riferimento su un oggetto che rappresentano la stessa regione morfologica tra i campioni. Qui, illustriamo una pipeline recentemente sviluppato per definire matematicamente semi-punti di riferimento dal mouse baculum (osso del pene). I nostri metodi dovrebbero essere applicabile ad una vasta gamma di oggetti.

Introduzione

Il campo di morfometria include una varietà di metodi per quantificare le dimensioni e la forma della forma biologica, un passo fondamentale nella ricerca scientifica ^{1, 2, 3, 4, 5, 6.} Tradizionalmente, l'analisi statistica di forma e dimensioni comincia identificando punti di riferimento su una struttura biologica, e poi misurando distanze lineari, angoli e rapporti, che possono essere analizzati in un quadro multivariata. Landmark a base geometrica Morfometria è un approccio che mantiene la posizione spaziale dei punti di riferimento, conservando le informazioni geometriche dalla raccolta dei dati attraverso l'analisi e la visualizzazione ^5. Generalized Analisi Procrustes (AAP) può essere applicato per rimuovere variazione di posizione, scala e rotazione dei punti di riferimento per produrre un allineamento tra esemplari minimizes le loro differenze squadrate - ciò che rimane è la forma dissomiglianza ^7.

Un concetto importante di qualsiasi analisi morfometrica è omologia, o l'idea che si possa identificare in modo affidabile punti di riferimento che rappresentano le caratteristiche biologicamente significativi e discreti che corrispondono tra i campioni o strutture. Ad esempio, teschi umani hanno processi omologhi, forami, suture, e condotti che possono consentire le analisi morfometriche. Purtroppo, l'individuazione dei punti di riferimento corrispondenti è difficile in molte strutture biologiche, in particolare quelli con superfici lisce o curve ^{8, 9, 10.}

Ci avviciniamo a questo problema di seguito utilizzando la geometria computazionale. Il flusso generale è quello di generare tre scansione tridimensionale dell'oggetto che può essere rappresentato come una nuvola di punti, e quindi ruotare e trasformare questa nuvola di punti in modo che tutti specimens sono orientati su un sistema di coordinate comune. Poi abbiamo matematicamente definiamo semi-punti di riferimento provenienti da regioni specifiche dell'oggetto. Discrete semi-punti di riferimento posti su tali regioni sono biologicamente arbitraria ^11. Condurre GPA e successive analisi statistiche in grado di produrre artefatti indesiderabili ^{8, 12} perché monumenti arbitrariamente collocati non possono essere biologicamente omologa. Pertanto, lasciamo che questi semi-punti di riferimento matematicamente "slide". Questa procedura riduce al minimo la differenza di potenziale tra le strutture. Come sostenuto altrove l'algoritmo scorrevole usato qui è opportuno quantificare regioni anatomiche simili, privi facilmente identificati punti di riferimento ^{3, 6, 8, 10, 11, 12} corrispondente. Questi metodi hanno loro limitations ^13, ma dovrebbe essere adattabile ad oggetti di dimensione e forma diversa.

Qui, illustriamo come questo metodo è stato applicato in un recente studio del baculum del mouse ^14, un osso nel pene che è stato guadagnato e perso più volte indipendenti nel corso dell'evoluzione dei mammiferi ^15. Discutiamo la dissezione e la preparazione di un osso specifico, il baculum (protocollo 1), la generazione di immagini microCT (Protocol 2), e la conversione di queste immagini in un formato che consente a tutti geometria computazionale valle (protocolli 3 e 4). Dopo questi passaggi, ogni esemplare è rappresentato da coordinate ~ 100K xyz. Abbiamo poi a piedi attraverso una serie di trasformazioni che si allineano in modo efficace tutti i campioni in un orientamento comune (Protocollo 5), quindi definire semi-punti di riferimento da campioni allineati (Protocollo 6). I protocolli 1-4 dovrebbero essere simili a prescindere dell'oggetto analizzato. Protocollo 5 e il protocollo 6 sono specifically progettato per un baculum, ma è la nostra speranza che, in dettaglio questi passaggi, gli investigatori possono immaginare le modifiche che potrebbero essere rilevanti per il loro oggetto di interesse. Ad esempio, sono state applicate modifiche di questi metodi per studiare balena ossa del bacino e le costole ^16.

Protocollo

Tutte le procedure e il personale sono stati approvati dalla University of Southern California Institute per la cura degli animali e del Comitato uso (IACUC), il protocollo # 11394.

1. Baculum dissezione e preparazione

1. Euthanize un topo maschio sessualmente maturo via anidride carbonica sovraesposizione, secondo i protocolli stabiliti dal comitato competente Istituzionale Animal Care e Usa (IACUC).
2. Posare l'animale in posizione supina, e protrarre le pene facendo pressione con i pollici lateralmente alla apertura del prepuzio.
3. Una volta che il pene è protratto, estendere il tessuto attraverso prepuzio quanto possibile.
4. Con le forbici, tagliare il corpo prossimale del pene di glande in cui risiede il baculum.
5. Trasferire le pene sezionato in una provetta da 1,7 ml e aggiungere acqua di rubinetto 200 l. Assicurarsi che il pene è completamente sommerso nel liquido.
6. Incubare il tessuto in acqua a ~ 50 ° C per 3-5 giorni.
7. Dopo l'incubazione corretto, rimuovere il tessuto circostante dal baculum, utilizzando una pinza al microscopio dissezione. schizzare delicatamente il 70% di etanolo per spingere fuori il tessuto rimanente e pulire l'osso.
8. Posizionare il baculum sezionato in una nuova provetta con il tappo aperto. Lasciare Cappa di apertura / N per asciugare l'osso.

2. microCT Scansione

1. Premere un supporto cilindrico scansione microCT in un mattone di schiuma fiorista per creare un cilindro di schiuma fioraio.
2. Estrarre il cilindro di schiuma fioraio e tagliare fette ~ spessore di 2-5 cm.
3. Premere bacula essiccati nella schiuma fioraio, intorno alla periferia di una singola porzione di minimizzare le interferenze durante la scansione. L'orientamento preciso delle ossa deve essere osservato che permette per una corretta identificazione dei singoli esemplari nel protocollo 4.
4. Posizionare delicatamente la fetta con le ossa incorporato nel supporto microCT.
5. Acquisire scansioni microCT. Nel caso di topo Bacula ¹⁴ , Abbiamo utilizzato uno scanner uCT50 (Scanco Medical AG, Bruttisellen, Svizzera) presso la USC Molecular Imaging Center con le seguenti impostazioni: 90 kVp, 155 μA, 0.5 mm Al filtro, 750 proiezioni per 180 (360 di copertura), il tempo di esposizione di 500 ms, e le dimensioni voxel di 15,5 mm.

3. Il trattamento microCT: Conversione di un .dcm Pila a un file xyz singolo

NOTA: Ogni scansione microCT produce una pila di .dcm, o "DICOM", file che rappresentano fette di immagini scattate attraverso l'oggetto. Tutta la geometria computazionale a valle richiede file xyz piatte, che è semplicemente un file di testo contenente quattro colonne - i x, y, z e coordinate di ogni pixel, e l'intensità del pixel, che vanno da -5.000 (nero) a 5000 (bianca). Una soglia di pixel superiore a 3.000 generalmente funziona bene come soglia per la definizione delle ossa.

1. Installare Python (www.python.org) ei moduli Python COMANDI, DICOM, PYLAB, SYS, e numpy.
2. Aperto 01_pr "ocess_dicom.py "{} Figshare con qualsiasi editor di testo. Nella sezione Variabili, percorso cambiamento, le soglie di pixel, e nomi di directory, se necessario.
3. Eseguire "python 01_process_dicom.py". Il progresso verrà stampato a schermo. All'interno di ogni directory chiamata al punto 3.2, un nuovo file è reso nominato; per esempio, directory_name.PT3000.xyz, dove PT3000 indica la soglia di pixel indicato nel passaggio 3.2.

4. elaborazione microCT: Segmentazione-out singolo provino xyz Files

1. Installare R (https://www.r-project.org/) con la RGL biblioteca.
2. Aprire il file '02_segment_dicoms.r' {} Figshare con qualsiasi editor di testo. Nella sezione Variabili, cambiare il nome del percorso per puntare al file xyz creato nel precedente protocollo 3.
3. Dall'interno R, eseguire la "fonte ( '02_segment_dicoms.r')" di comando (senza le virgolette).
4. Dopo l'immagine tridimensionale del file xyz creato nel protocollo 3 appare, inserire il numbeR di esemplari nel file generale xyz. Poi etichettare e selezionare i punti da ogni campione utilizzando le funzioni di scorrimento e di zoom.
   NOTA: Sullo sfondo, saranno effettuati i file xyz separati per ogni campione. Questi appaiono in una directory chiamata, ad esempio, XYZ_FILES_PT3000, dove PT3000 indica la soglia di pixel utilizzato.

5. "Allineamento" Specimen xyz File da comuni coordinate.

1. Aprire lo script "03_transform.py" Python {} Figshare, che richiede la mattdean_modules.py modulo aggiuntivo {} Figshare, così come due applicazioni a sé stanti: "rotate_translate_cylindrical" (https://github.com/timydaley/dean_cylindrical_tranform) e "qconvex" (www.qhull.org/html/qconvex.htm) che sono utilizzati da questo script.
2. Nella sezione Variabili, identificare i nomi di percorso completo per mattdean_modules.py, rotate_path e qconvex_dir. Inoltre, identificare il percorso completo della directory contenente il .xy individualefile z creato nel passaggio 4.
3. 03_transform.py Run, che crea un nuovo file per ogni campione con il suffisso .TRANSFORMED.xyz.

6. "affettare" campioni Allineati xyz File da identificare Semi-punti di riferimento.

1. Aprire ed eseguire lo script Python "04_identify_landmarks.py" {} Figshare. Nella sezione Variabili, identificare i nomi percorso completo per la directory contenente i file .TRANSFORMED.xyz. Questo script identifica 802 semirimorchi punti di riferimento che possono essere utilizzati per quantificare dimensioni e forma della struttura.

Risultati

Le coordinate XYZ dei semi-punti di riferimento prodotte nel protocollo 6 possono essere importati direttamente in qualsiasi morfometria geometrica analisi punto di riferimento basata su ^17. La conduttura di calcolo di cui sopra è stato applicato per studiare topo bacula ^14, nonché pelvico balena e costole ^16. Maggiori dettagli sulla definizione di calcolo di semi-punti di riferimento sono presentati qui, nel tenta...

Discussione

Le fasi critiche nel protocollo di cui sopra sono: 1) la dissezione del Bacula, 2) la raccolta delle immagini microCT, 3) convertire l'uscita microCT di un file flat di coordinate XYZ, 4) la segmentazione fuori nuvola di punti per ogni campione, 5) trasformando ogni campione per un standardizzato sistema di coordinate, e 6) che definisce semi-punti di riferimento. Questi passaggi possono essere facilmente modificati per accogliere oggetti diversi.

Questi metodi possono probabilmente esse...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dissecting scissors	VWR	470106-338	Most sizes should work
Dissecting Forceps, Fine Tip, Curved	VWR	82027-406
1.7 mL microcentrifuge tube	VWR	87003-294
Absolute Ethanol	Fisher Scientific	CAS 64-17-5	To be diluted to 70% for dissections
Floral Foam	Wholesale Floral	6002-48-07
uCT50 scanner	Scanco Medical AG, Bruttisellen, Switzerland