כינון של נוקלאוזום עם דיפרנציאלי איזוטופ שכותרתו היסטונים אחות

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הכינון מחדש של נוקלאוזום המכיל היסטונים אחות איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי. במקביל, סימטרית שלאחר translationally נוקלאוזום שונה יכול להיווצר לאחר שימוש בעותק היסטון premodified. תכשירים אלה יכולים לשמש בקלות ללמוד מנגנוני crosstalk השינוי, בו זמנית משני ההיסטונים אחותו, באמצעות ספקטרוסקופיית NMR ברזולוציה גבוהה.

Abstract

נוקלאוזום שונה סימטרית מכילים שני עותקים של היסטון (היסטונים אחות) מעוטר סדרות שונות של שלאחר translational שינויים (PTMs). הם לא מכבר מזוהה מינים באמצעים לא ידועים של קמת השלכות תפקודיות. שיטות אנליטיות נוכחיות אינן מספיקות כדי לזהות את המופע ספציפי העותק של PTMs על ההיסטונים אחות nucleosomal. פרוטוקול זה מציג שיטה ביוכימיים בריאורגניזציה במבחנה של נוקלאוזום המכיל היסטונים אחות איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי. הקומפלקס שנוצר יכול להיות גם סימטרית שונה, אחרי כולל בריכת היסטון premodified במהלך refolding של subcomplexes היסטון. הכנות הנוקלאוזום הסימטריות אלה יכולים להיות הגיבו בקלות עם אנזימי שינוי היסטון ללמוד מנגנוני שינוי צולב לדבר שטיל PTM מראש שולב הסימטרי באמצעות תהודה מגנטית גרעינית ספקטרוסקופיה (NMR). במיוחד, תגובות השינוי בניתן למפות בזמן אמת באופן עצמאי על שני היסטונים אחותו על ידי ביצוע סוגים שונים של ניסויי קורלציה NMR, המותאמים לסוג איזוטופ בהתאמה. מתודולוגיה זו מספקת את האמצעים כדי לחקור מנגנוני crosstalk שתורמים להיווצרות ההתפשטות של דפוסי PTM סימטריים על מתחמי nucleosomal.

Introduction

DNA איקריוטיים ארוז היטב בתוך גרעין התא אל הכרומטין. אבן הבניין הבסיסית של הכרומטין הוא חלקיק הליבה הנוקלאוזום המכיל ~ 147 נ"ב של DNA עטוף סביב תסביך octameric מורכב משני עותקים כל אחד מארבעת ההיסטונים הליבה (H3, H4, H2A, H2B). חלבוני היסטון נמל שפע של שלאחר translational שינויים (PTMs). החלפות קוולנטיים אלה לגרום שינויים במבנה הכרומטין, הוא באופן ישיר על ידי המשפיע על הכימיה הפיסיקלית של המערכת ובעקיפין על ידי גיוס פעילויות שיפוץ-הכרומטין ^{1, 2, 3.} באמצעות אלה, PTMs היסטון לשלוט נגישות הכרומטין, ומכאן, להסדיר את כל הפונקציות הסלולר מבוססי DNA ^4.

PTMs מותקנים על ידי מערכות אנזימים שינוי היסטון בעיקר על ערוצי N-terminal לא מובנה (זנבות) של histo הליבה-משולב הנוקלאוזוםנוס. בשל באתרי השינוי הרבים על הרצף קצר יחסית זנבות היסטון, PTMs להשפיע אחד על השני על ידי גרימה או חסימת תגובות מפני עריכה, תופעה הידועה בשם ⁵ הצטלבות שינוי. בגלל הארכיטקטורה הסימטרית הכוללת של הנוקלאוזום, תגובות שינוי ומנגנוני crosstalk נחשבו להתרחש באופן דומה על שני העותקים של כל היסטון nucleosomal (היסטונים אחות). מושג זה היה לערער לאחרונה ובהמשך להפרכה. במיוחד, במבחנת מבחני האנזימטית על פפטידים זנב H3 חינם היסטון ועל נוקלאוזום הוכיחו כי קבוצה של קינאזות H3 הציגה זירחון בתוך סימטרי באופן ^6. בנוסף, זיקת טיהור מבוססת LC-MS / MS ניתוח חשף את קיומם של סימטרית נוקלאוזום-מפוגל H3 בכמה סוגים של תאים איקריוטיים ^7. לפיכך, סימטרי נוקלאוזום שונה מהווה מיני רומן,כלים נדרשים לחשוף את המנגנונים השולטים היווצרותם ולנתח את ההשפעות crosstalk שחוסר סימטריה זה עלול להפעיל.

בדרך כלל, המערבי סופג (WB) ו ספקטרומטריית מסה (MS) ניתוח שימשו כדי לזהות PTMs היסטון. למרות היישום הקל שלה, WB סובל סגוליים / בעיות תגובתיות צולבות. נוסף על כך, זה אינו מסוגל לבצע ניתוח רב-PTM סימולטני וכימות ישירה של תגובות השינוי ^8. מצד השני, ניתוח MS מעסיק מכשור מתוחכם הדורש הכשרה ברמה גבוהה, אך מספק סגולי גבוהות כמו גם מיפוי סימולטני וכימות של מספר ⁹ PTMs.   עם זאת, שתי השיטות הן משבשות מתחמי nucleosomal הם ניתקו לפני הניתוח, והולידו תערובת של ההיסטונים ו / או פפטידים שמקורם היסטון. מניפולציה זו מסירה את היכולת להבחין עצמאיתגובות שינוי המתרחשות על כל אחד משני ההיסטונים אחותו לדווח על מצב שינוי ספציפי העותק של ההיסטונים nucleosomal.

תהודה מגנטית גרעינית (NMR) ספקטרוסקופיה התפתחה כמו שיטה חלופית כדי למפות תגובות PTM. התמ"ג הוא הפרעה ובכך מאפשרת ניטור של אירועים PTM באופן בזמן אמת בתערובות מחדש, ואפילו תאים שלמים ^{10, 11.} הפיתוח שגר לרכישת נתונים מהירה וכן למיפוי ברזולוציה גבוהה המבוסס על 2D שיטות קורלציה הטרו-הגרעיני של שכותרתו איזוטופ ⁽¹⁵ N ו / או ¹³ ג) דגימות ¹² אפשרו המיפוי סימולטני של סוגים שונים של PTMs, כגון כמו סרין / תראונין / זירחון טירוזין, acetylation ליזין / מתילציה, ו ארגינין מתילציה ^13. בהתאם PTM תחת חקירה, ¹⁵ N- או ¹³ יח"צ C-תיוגיכול להיות מועסק otocols לסמן את הקבוצה פונקציונלי חלבון המשמש ככתב שינוי. כתוצאה מכך, מיפוי PTM יכול להתבצע על ידי ביצוע עקירת המשמרת כימית מאפיינת את הקבוצה הפונקציונלית המתאימה "חישה" השינוי על הסביבה הכימית. ברוב המקרים, הוא NH וקבוצות כימיות CH ניתן המשמשים לצורכי דיווח על האבולוציה של PTM של עניין.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הדור של נוקלאוזום המכיל היסטונים אחות איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי. הוא משלב את הגמישות של ספקטרוסקופיה NMR למפה PTMs הן באמצעות ספקטרום קורלציה ¹ H- ¹⁵ N ו- ¹ H- ¹³ C עם ניצול של תגי קרבה חלבון שונים לטיהור של מתחמי היסטון מחדש שנבחרו. יש לציין, כי הפרוטוקול מעסיק שתי ברכות שונות של היסטון בפרט עבור כינון מחדש הנוקלאוזום. בריכות אלו הן איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי (אחד עם ^{15 N, השני עם 13 C), והם התמזגו polyhistidine ותג זיקה streptavidin, בהתאמה. ערכת טיהור זיקה טנדם עם Ni-נ.ת.ע כרומטוגרפיה מבוסס streptavidin בתחילה שמוצגת וויגט et al. 7 מועסק לטהר מינים סימטריים מעמיתיהם סימטריים (איור 1 א). Octamers היסטון אסימטרית משמש לאחר מכן כדי לשקם מתחמי nucleosomal שווים ערך (איור 1B), בשיטת דיאליזת המלח הרגיל 14. בנוסף, דרך אותו ההליך ועל ידי שיש אחת הבריכות היסטון מראש שונה, PTM ניתן לשלב סימטרי על נוקלאוזום שהתקבל. התגובה של אלה מצעים עם אנזימי שינוי היסטון ו- NMR-המיפוי הבא של אירועי שינוי לאפשר אפיון מנגנוני crosstalk הוא-cis (עותק היסטון premodified) וב-טרנס (unmodifiעותק היסטון ed) (תרשים 1C).}

Protocol

כינון 1. נוקלאוזום עם דיפרנציאלי איזוטופ שכותרתו (ו סימטרי השתנה) היסטונים אחות

הערה: הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הכינון מחדש של נוקלאוזום עם H3 היסטון איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי. לשם כך, שתי בריכות של היסטון H3 שימשו; אחד היה ¹⁵ N שכותרתו והכיל-תג 6xHis בבית הסופית- N והשני היה ¹³ C שהכותרת והכיל הפפטיד סטרפטוקוקוס (WSHPQFEK) התמזג על N- סופי. שני התגים הופרדו רצף H3 הילידים עם וירוס Etch טבק (TEV) אתר הכרה פרוטאז. כדי להכין נוקלאוזום נוסף סימטרי שונה, אחת משתי הבריכות H3 כלול צורת premodified. Premodification של בריכת היסטון יכול להתבצע על ידי מגיבים היסטון שכותרתו איזוטופ עניינים עם האנזים בהתאמה שינוי היסטון בנוכחות של צורך עבור כל סוג של קו-פקטורים התגובה / תורמים PTM ¹6. המיקום היעיל של PTM בהתאמה ניתן להעריך על ידי ספקטרוסקופיה NMR או ספקטרומטריית מסה. סכומי היסטונים / DNA משמשים הנה המלצות מחוספסות להשיג הכנת הנוקלאוזום עם ריכוז משוער של 10 מיקרומטר (כפי שנמדד ריכוז ה- DNA ב 260 ננומטר) התשואה הסופית .זהו מספיק להקליט ספקטרום NMR באיכות טובה עם פעמי רכישה קצרות יחסית.

1. כינון של octamer היסטון עם שכותרתו איזוטופ דיפרנציאלי (ו סימטרי שונה) היסטון H3
   הערה: חלבוני היסטון רקומביננטי יכולים להיות מיוצרים בכמויות מ"ג BL21 (DE3) plysS תאי ^14. כדי להשיג היסטונים שכותרתו איזוטופ, פרוטוקול ביטוי / טיהור אותה אחריו למעט באמצעות התפתחות חיידקים מדיום מינימלי המכיל ¹⁵ NH ₄ Cl ו / או ¹³ C-גלוקוז כמקורות חנקן ופחמן, במשך ¹⁵ N- או ¹³ C-תיוג respectively. היסטונים מטוהרים הם dialyzed באופן גורף כלפי 5 מ"מ β-mercaptoethanol ומאוחסנים lyophilized לפני השימוש.
   1. ממיסים aliquots היסטון lyophilized, המכיל ~ 5 מ"ג של כל היסטון ב 1 מ"ל של התגלגלות חיץ (7 M guanidinium HCl, 20 מ"מ טריס pH 7.5, 10 mM DTT). להכיל את שני סוגי היסטון H3. מערבבים על ידי pipetting לא מערבולת. שמור את הצינורות על קרח למשך 30 דקות, כדי לאפשר להשלים התגלגלות.
   2. קבע את הריכוז המדויק של כל היסטון על ידי מדידת הספיגה ב 280 ננומטר נגד התגלגלות חיץ ושימוש במקדמי הכחדה מחושבים עם כלי ProtParam של פורטל ExPASy. ¹⁵
   3. מערבבים את ההיסטונים הליבה יחסי equimolar, תוך התחשבות לכלול 50% כל אחת הבריכות H3 שתי היסטון. התחל על ידי שימוש התוכן כולו של היסטון פחות מרוכז ולהוסיף את כל האחרים בהתאם.
   4. התאם ריכוז החלבון הסופי כ 1 מ"ג / מ"ל ​​באמצעות התגלגלות חיץ.
   5. Transfer את התערובת אל קרום דיאליזה 6 kDa-גזורים dialyze נגד 1-2 ליטר של חיץ refolding מצונן (10 מ"מ טריס pH 7.5, 2 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 מ"מ DTT) בשעה 4 מעלות צלזיוס. שנה את החיץ לפחות פעם אחת אחרי הדיאליזה התקדמה למשך התקופה מינימאלית של 3 שעות. בצע O דיאליזה סופי / N ב 4 ° C.
   6. אסוף חומר dialyzed וסר משקע על ידי צנטריפוגה בתוך microfuge במשך 5 דקות ב 4 ° C על מהירות מרבית (בדרך כלל לא ממטרים יש לשים לב). קביעת ריכוז octamer על ידי מדידת הספיגה ב 280 ננומטר. בחישובים, השתמש מקדמי הכחדה המוסף של היסטונים, תוך התחשבות ללחוץ פעמיים כל ערך.
   7. תתרכז לנפח סופי של ~ 2 מ"ל באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי 10 kDa-החיתוך. חישוב מחדש אובדן ריכוז אומדן octamer. בשלב זה, ריכוז octamer בין 50 - 100 מיקרומטר יש לקבל.
   8. חבר את העמודה סינון ג'ל (כאמור בטבלה של חומרים) למערכת FPLC לאזן עם 2 כרכים עמודה (CV) של 0.22 מיקרומטר-מסוננים degassed refolding חיץ בקצב זרימה של 1 מ"ל / דקה גבול הלחץ של 0.5 מגפ"ס.
      הערה: ריצת סינון ג'ל צריכה להתבצע בחדר הקר או בתוך ארון קר.
   9. להזריק חומר מרוכז באמצעות קצב הזרימה של 1 מ"ל / דקה לאסוף 1.0 - 1.5 שברים מ"ל.
   10. בצע את פרופיל chromatographic ולבחון elution היסטון octamer ב ~ 65 - 68 מ"ל.
       הערה: כתף קטנה של שיא elution ואת לשיא ב ~ 80 מיליליטר, מלמדת על קיומו של tetramers H3-H4 בחינם הדימרים H2A-H2B, בהתאמה.
   11. הפעל 20 μL של כל חלק שנאספו ג'ל 18% SDS-PAGE.
       הערה: לדלל את דגימות בפקטור של 2 לפחות עם מים לפני טעינתם על ג'ל כדי להפחית את ריכוז מלח גבוה ובכך, למנוע עיוותים. הדבר נכון גם עבור ניתוחי SDS-PAGE הבאות של דגימות refolding חיץ.
   12. בריכת FRA רלוונטיctions המכיל octamers טהור להשפט על ידי חלוקה שווה של 4 ההיסטונים על הג'ל מוכתם ולקבוע ריכוז כמו קודם (שלב 1.1.7).
   13. חבר טור מ"ל Ni-נ.ת.ע 1 (לוח של חומרים) למערכת FPLC לאזן עם 10 CV של 0.22 מיקרומטר-מסוננים degassed refolding חיץ בקצב זרימה של 1 מ"ל / דקה.
       הערה: כרומטוגרפיה Ni-נ.ת.ע צריכה להתבצע בחדר הקר או בתוך ארון קר.
   14. לעבור octamer מטוהרים באמצעות Ni-נ.ת.ע באמצעות קצב הזרימה של 1 מ"ל / דקה.
   15. אסוף זרימה דרך לשמור דגימות לבדיקת SDS-PAGE / WB (20 μL ו -4 μL, בהתאמה). בהמשך, לשטוף טור עם 10 CV של refolding חיץ או עד אות הבסיס הוא הגיע.
   16. Elute עם 10 CV של refolding מאגר המכיל 250 imidazole מ"מ באמצעות קצב הזרימה של 1 מ"ל / דקה. שמור דגימות לבדיקת SDS-PAGE / WB (20 μL ו -4 μL, בהתאמה).
   17. לאזן עמודת זיקת מיליליטר 1 של acstreptavidin ommercial (לוח של חומרים) עם 10 CV חיץ refolding המכיל 250 imidazole מ"מ באמצעות הגדרת זרימת אצווה / הכבידה.
       הערה: שלב chromatographic זה צריכה להתבצע בחדר הקר.
   18. לעבור elution Ni-נ.ת.ע דרך עמודת הזיקה המסחרית streptavidin.
   19. אסוף הזרימה דרך ולשמור דגימות לבדיקה SDS-PAGE / WB (20 μL ו -4 μL, בהתאמה). בהמשך, לשטוף עם 10 CV של refolding חיץ.
   20. Elute עם 10 CV של refolding מאגר המכיל 2.5 מ"מ desthiobiotin. שמור דגימות לבדיקת SDS-PAGE / WB (20 ו -4 μL בהתאמה).
   21. מדוד ריכוז octamer, להוסיף 10 פעמים פחות פרוטאז TEV ולתת התגובה להמשיך לילה ב 4 מעלות צלזיוס צינור צנטריפוגות פלסטיק רגיל.
       הערה: את הסכום הדרוש של TEV להשיג עיכול מלא (הסרת תגי הקרבה) תלויה המוצא (לבנות) ועל הפעילות (טרי, TEV רקומביננטי יותרפעיל לעומת אחד מאוחסן לפרקי זמן ממושכים בבית - 80 מעלות צלזיוס). נסה תחילה הוספת 10 פעמים פחות TEV לעומת octamer (שנאמד ריכוזי חלבון) ולהתאים בהתאם.
   22. בדוק לעיכול יעיל על ידי הפעלת 20 μL של התערובת לפני ואחרי בנוסף TEV על ג'ל 18% SDS-PAGE. אם העיכול אינו שלם, להוסיף עוד פרוטאז TEV ולהמשיך דגירה של 3-4 אחר h.
   23. Dialyze מדגם נגד refolding חיץ באמצעות קרום דיאליזה 50 kDa-הפסיק להסיר פרוטאז TEV ולהתאים רכב חיץ.
   24. לרכז את octamer הסימטרית מטוהר באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי 10 kDa-חיתוך (באותה יחידת מסנן משלב 1.1.7 יכול לשמש גם) בהיקף של 1.0-2.0 מיליליטר. מדדו את הריכוז הסופי. או להשתמש מיד לאחר הכינון מחדש הנוקלאוזום או להסתגל 50% (v / v) גליצרול לאחסן ב -20 ° C לפרקי זמן ארוכים יותר. בשלב זה, מצפה לפחות הפסד 70% במהלך השלבים הקודמים, הריכוז דואר octamer צריך להיות בטווח של 20 - 50 מיקרומטר.
2. כינון מחדש הנוקלאוזום
   1. אם octamer אוחסן גליצרול 50%, dialyze הלילה ב 4 ° C נגד refolding חיץ לפני שתמשיך עם כינון מחדש הנוקלאוזום.
   2. התאם DNA (המכיל הנוקלאוזום מיצוב רצף) ריכוז מלח 2 M NaCl באמצעות פתרון המניה 5 M NaCl.
      הערה: ה- DNA מטוהר אם בנפרד לאחר הטיהור של פלסמיד המכיל מספר עותקים של הרצף הרצוי או מסונתז על ידי הגברת PCR יש לאחסן מרוכז ~ 50 מיקרומטר במים או חיץ טריס-EDTA סטנדרטי.
   3. מערבבים octamer ו- DNA באמצעות היחס האופטימלי נקבע מתוך ניסיון בקנה מידה קטן. השתמש חיץ refolding להתאים את נפח סופי ~ 3.0 מ"ל. תמיד להוסיף את octamer האחרון כדי למנוע כל אפשרות של ערבוב octamer והדנ"א ב <2 M ריכוזי מלח.
      1. בצע קטן sc הראשוניreconstitutions אייל לקבוע את octamer: יחס ה- DNA שמוביל תשואות הנוקלאוזום אופטימלית. לשם כך, להרכיב שלוש תגובות של 0.9: 1.0, 1.0: 1.0, ו -1.1: 1.0 DNA: octamer יחסים בנפח בין 50-100 μL. בדרך כלל, להשתמש בריכוז של DNA 5 מיקרומטר.
      2. המשך עם כינון מחדש כמתואר להלן (שלבים 1.2.4-1.2.8) ובסוף, להעריך את כמות הנוקלאוזום מחדש איכות מסיסים טוב על ידי מדידת ריכוז ה- DNA ב 260 ננומטר באמצעות הרצת ג'ל DNA 6% ילידים-עמוד , מוכתם ברומיד ethidium, בהתאמה (איור 5 א).
   4. מעבירים את תערובת אל קרום דיאליזה 6 kDa-גזורים dialyze נגד 1 ליטר של refolding חיץ לילה ב 4 מעלות צלזיוס.
   5. מנמיכים את ריכוז מלח של חיץ דיאליזה באופן צעד חכם מן 2, 0.85, 0.64, ו 0.2 M NaCl בהתאמה. שמור מדגם בכל חיץ עבור שעות לפחות 3. לפעמים משקע נוצר לאחר המעבר האחרון. ב- C במקרה זהontinue דיאליזה כמתוכנן ולהסיר המשקע על ידי צנטריפוגה microfuge בסוף לשלב הבא.
   6. העברה קרום דיאליזה בכוס עם 1 ליטר של חיץ assay (25 מ"מ לאא ₂ PO ₄ / Na ₂ HPO ₄ pH 6.8, 25 mM NaCl, 2 מ"מ DTT) ולהמשיך דיאליזה O / N ב 4 ° C.
   7. אסוף מדגם, להסיר כל המשקע שנוצר בשלב 1.2.5 על ידי צנטריפוגה בתוך microfuge במשך 5 דקות ב 4 ° C על המהירות המרבית ולהתרכז באמצעות יחידת מסנן צנטריפוגלי 30 kDa-הפסקת לנפח סופי של ~ 300 μL.
   8. מדוד ריכוז ה- DNA ב 260 ננומטר, לרוץ ג'ל חלבון 18% SDS-PAGE (4 μL של המדגם) ו ג'ל DNA 6% ילידי-עמוד (0.2 μL של המדגם) מדגם ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס במשך כמה שבועות. הריכוז הסופי צריך להיות בטווח של 10-20 מיקרומטר.

2. ניתוח התמ"ג של תגובות שינוי על שני ההיסטונים אחות

הערה: המחאה2D ¹ H- ¹⁵ N מתאם ספקטרום של זנבות היסטון nucleosomal ניתן למצוא בכתובת אזכור ^{16, 17, 18.} בנוסף, הקצאות של CH _x קבוצות של lysines, serines ו threonines על 2D ¹ H- ¹³ C ספקטרום המתאם ניתן למצוא בכתובת התייחסות ^16.

1. התקנת NMR והקלטה של ספקטרה ההתייחסות
   הערה: מבחני אנזימתי בוצעו באמצעות 140 μL של מדגם הנוקלאוזום חיץ assay לתוך צינור NMR 3 מ"מ ב 300 צינורות NMR שונים ק עם כרכי מדגם אחרים יכולה לשמש גם. הטמפרטורה הנ"ל ראויה להשיג באיכות טובה ¹ H- ¹⁵ ספקטרה מתאם N של זנבות היסטון nucleosomal ופעילויות אנזימטיות טובות. 2D-SOFAST-HMQC ¹ H- ¹⁵ N ו- 2D-HSQC ¹ H- ¹³ ספקטרום C נרשמו בהתאמה עם חולצת ההתקנהכובע מקנה פעמי רכישה דומות. פרמטרי רכישה אופייניים הם 128 ארעיים עם 1.024 ⁽¹ H) x 128 ⁽¹⁵ N) נקודות מורכבות ו -32 הארעיים עם 1.024 ⁽¹ H) x 64 ⁽¹³ C) מורכב נקודות עבור שני הסוגים השונים של ספקטרום קורלציה. עבור שני ספקטרום 2D, בפעם הרכישה היה ~ 30 דקות.
   1. גדר 300 K כמו הטמפרטורה מדגם ב ספקטרומטר. הוסף 10% D ₂ O (v / v) מדגם לשמש את המנעול התדיר ספקטרומטר.
   2. הנח את הדוגמה ספקטרומטר ולבצע פעולות בסיסיות (נעילה, כוונון, shimming). בנוסף, לקבוע אורכי דופק אופטימלית פרמטרי רכישה בכלל.
   3. שיא 1D ו 2 ד ¹ H- ¹⁵ N ו- ¹ H- ¹³ ספקטרום C התייחסות.
   4. תהליך ספקטרה ההתייחסות ולהבטיח כי האותות לשמש למיפוי תגובות השינוי נפתרת היטב ויש להם עוצמות טובות.
   5. שחזור מדגם ולהעביר it לצינור microfuge.
2. ההתקנה של התגובה האנזימטית, ניטור NMR וניתוח כמותי
   1. העתק להסדיר שורה של 2D משולבים ¹ H- ¹⁵ N ו- ¹ H- ¹³ ספקטרום C. כוון זמן רכישה כולל של מספר שעות ולהתאים בהתאם בריצה חדשה המבוססת על שיעורי אנזימטיות המתקבל התגובה הראשונה.
   2. הוסף המדגם קו-פקטורים הדרושים בהתאמה לסוג של התגובה שינוי (1 מ"מ ATP / 2 מ"מ MgCl ₂ עבור זירחון, 1 מ"מ אצטיל-CoA עבור acetylation, 1 מ"מ SAM עבור מתילציה, וכו.).
   3. מוסיפים את האנזים של עניין, ומערבבים על ידי pipetting, להעביר את דוגמת לראש בצינור NMR וכפועל יוצא מזה ספקטרומטר (לבצע פעולות אלה במהירות).
      הערה: אם אין נתונים על הפעילות האנזימטית הצפויה, להתאים את המצע אל אנזים יחס טוחן עד 10: 1. בצע ניסוי ראשון ולהתאים בהתאם עבורבטווח האמיתי.
   4. בצע shimming אוטומטי מהיר ולהשתמש בשאר הפרמטרים של ספקטרה התייחסות.
   5. ליזום הסדרה של 2D משולבים ¹ H- ¹⁵ N ספקטרה ¹ H- ¹³ C.
   6. בצע את ההתקדמות של התגובה בזמן אמת ולהפסיק רכישה כאשר התגובה מגיעה השלמה או לרמה רצויה.
   7. תהליך ספקטרה כמו קודם עם אותם פרמטרים בדיוק.
   8. חזור בטווח כולו באמצעות צו רכישה שונה עבור שני סוגי ספקטרום קורלציה. אם בניסוי הראשון קורלציה ¹ H- ¹⁵ N היה הראשון בסדרה, להתחיל עכשיו עם מתאם C ¹ H- ^13. לפי זה ויש להם באותו זמן רכישה הוא הספקטרום, אפשר לתכנן ולהשוות תגובות PTM משני ההיסטונים איזוטופ שכותרתו דיפרנציאלי על אותה סקאלה הזמן. בנוסף, ניתן לחשב ממוצעים וברי שגיאת עלילה.
      הערה: thorougתיאור h של מתודולוגיות לניתוח אותות תמ"ג וכימות הבאות של תגובות אנזימטיות ניתן למצוא כאן ^19.
   9. בחר אותות תמ"ג מכל ספקטרום NMR זמן כמובן המדווחים על התקדמות התגובה ולחשב עוצמות האות יחסיות באמצעות תוכנה ויזואליזציה וניתוח עבור ספקטרום NMR. בצע פעולה זו עבור אותות המדווחים על ללא שינוי, כמו גם את המדינה השונה. חלץ רמות שינוי.
   10. עלילת הערכים המחושבים של רמות שינוי כנגד זמן התגובה.

תוצאות

כראוי וקפלו מיני octameric מבודדים אחרי ריצה של תערובת הכינון מחדש דרך עמודת סינון ג'ל (איור 2). הבריכה מחדש octameric המכיל את שלושת הסוגים השונים של octamers הוא נתון את ערכת טיהור זיקה טנדם. דוגמאות נאספות מכל המדרגות ונותחו על ידי SDS-PAGE, ובהמשך WB. אימ?...

Discussion

עבור הכינון מחדש הנוקלאוזום, הפרוטוקול הנוכחי מנצל תבנית ה- DNA ארוכה 165 נ"ב המכיל את רצף מיצוב הנוקלאוזום 601-Widom ^20, אבל ביצועים דומים צפוי באמצעות באורכים שונים של תבניות DNA. הפרוטוקול נועד והעסיק באמצעות סוגים סימטריים של היסטון H3. עם אותו העיקרון, השיטה ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Unfolding Buffer	7M guanidinium HCl
	20mM Tris pH7.5
	10mM DTT
Refolding Buffer	10mM Tris pH7.5
	2M NaCl
	1mM EDTA
	2mM DTT
Assay Buffer	25mM NaxHxPO4 pH6.8
	25mM NaCl
	2mM DTT
Guanidinium HCl	Applichem	A14199	Use high quality Gu-HCl
Tris	Roth	4855.2
DTT	Applichem	A1101
NaCl	VWR chemicals	27810.364
EDTA	Roth	8043.2
Na2HPO4	Applichem	A1046
NaH2PO4	Applichem	A3902
Imidazole	Applichem	A1073
d-Desthiobiotin	Sigma	D1411
Ni-NTA Superflow	Qiagen	1034557
Strep-Tactin Superflow	IBA	2-1207-001
His-probe antibody	Santa Cruz	sc-8036
Strep-tactin conjugated HRP	IBA	2-1502-001
Hi-Load 16/600 Superdex 200pg	GE Healthcare	28-9893-35
6-8kDa dialysis membrane	Spectrumlabs	spectra/por 1, 132650
50kDa dialysis membrane	Spectrumlabs	spectra/por 7, 132129
10kDa centrigugal filter unit	Merck Millipore	UFC901024
30kDa centrigugal filter unit	Merck Millipore	UFC903024
Solution-state NMR spectrometer			at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe