Rekonstitution von Nukleosomen mit differentiell isotopenmarkierten Schwester Histone

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Rekonstitution von Nukleosomen unterschiedlich isotopenmarkierten Schwester Histone enthält. Zur gleichen Zeit, asymmetrisch posttranslational modifiziert Nukleosomen kann nach der Verwendung eines Histon vormodifiziert Kopie erzeugt werden. Diese Präparate können leicht zu untersuchen Modifikationsübersprechmechanismen verwendet werden, gleichzeitig auf beiden Schwester Histone, durch hochauflösende NMR-Spektroskopie.

Zusammenfassung

Asymmetrisch modifizierte Nukleosomen enthalten die beiden Kopien eines Histon (Schwester Histone) dekoriert mit unterschiedlichen Mengen von Post-translationale Modifikationen (PTM). Sie sind neu Spezies mit unbekannten Mitteln Niederlassungs- und funktionelle Auswirkungen identifiziert. Aktuelle analytische Methoden sind unzureichend, um die Kopie spezifische Auftreten von PTM auf die nukleosomalen Schwester Histone zu erkennen. Dieses Protokoll stellt ein biochemisches Verfahren zur in vitro Rekonstitution von Nukleosomen differentiell isotopenmarkierten Schwester Histone enthält. Der erzeugte Komplex kann auch asymmetrisch modifiziert werden, nachdem ein vormodifizierter Histon-Pool auch während der Histon Subkomplexe Neufaltung. Diese asymmetrischen Nukleosom Zubereitungen können leicht umgesetzt werden, mit Histon-modifizierende Enzyme Modifikation Übersprechens Mechanismen durch die asymmetrisch vorge eingebaut PTM unter Verwendung der kernmagnetischen Resonanz (NMR) -Spektroskopie auferlegt zu studieren. Insbesondere sind die Modifizierungsreaktionen inEchtzeit kann durch die Durchführung verschiedener Arten von NMR-Korrelationsexperimente, zugeschnitten für das jeweilige Isotop Typ unabhängig von den beiden Schwester Histone abgebildet werden. Diese Methode liefert die Mittel Übersprechmechanismen zu untersuchen, die zur Bildung und Ausbreitung von asymmetrischen PTM Muster auf nukleosomalen Komplexe beitragen.

Einleitung

Eukaryotische DNA ist eng in die Zellkerne in Chromatin verpackt. Der grundlegende Baustein des Chromatins ist die Nukleosomen Kernteilchen, die ~ 147 bp DNA um einen oktameren Komplex, bestehend aus zwei Kopien jeder der vier Core-Histone (H3, H4, H2A, H2B) gewickelt enthält. Histon-Proteine ​​beherbergen eine Vielzahl von Post-translationale Modifikationen (PTM). Diese kovalente Substitutionen induzieren Veränderungen in der Chromatinstruktur, sowohl direkt durch die physikalische Chemie des Systems zu beeinflussen und indirekt durch die Einstellung von Chromatin-Remodeling - Aktivitäten ^{1, 2, 3.} Durch diese Mittel steuern Histon PTMs Chromatin Zugänglichkeit und damit regeln alle DNA-basierten zellulären Funktionen ^4.

PTM werden von Histon-modifizierenden Enzymsysteme vor allem auf die unstrukturierte N-terminalen Segmente (Schwänze) von Nukleosomen-Kern integriert histo installiertang. Aufgrund der vielen Modifikationsstellen auf der relativ kurzen Sequenz von Histon - tails beeinflussen PTMs einander durch Induzieren oder nachfolgenden Modifikationsreaktionen zu blockieren, eine Wirkung als Modifikationsübersprechens ⁵ bekannt. Aufgrund der insgesamt symmetrischen Architektur der Nukleosomen, Modifikationsreaktionen und Übersprechmechanismen wurden gedacht, um in ähnlicher Weise auf die zwei Kopien von jedem nukleosomalen Histon (Schwester Histone) auftreten. Dieses Konzept wurde vor kurzem in Frage gestellt und später widerlegt. Insbesondere zeigten in vitro enzymatische Tests auf freien Histon H3 Schwanz Peptide und auf Nukleosomen , dass eine Reihe von H3 - Kinasen ⁶ - Phosphorylierung in asymmetrischer Weise eingeführt. Zusätzlich Affinitätsreinigung basierten LC-MS / MS - Analyse zeigte das Vorhandensein von unsymmetrisch H3-methylierten Nukleosomen in verschiedene Arten von eukaryotischen Zellen ^7. Somit bilden asymmetrisch modifizierten Nukleosomen neuartige Arten undWerkzeuge nötig sind, um die Mechanismen aufzudecken, die ihre Bildung steuern und die Übersprecheffekte zu analysieren, dass diese Asymmetrie ausüben könnten.

Üblicherweise wurden Western Blot (WB) und Massenspektrometrie (MS) -Analyse verwendet Histon PTMs zu detektieren. Trotz seiner einfachen Anwendung, leidet WB aus Spezifität / Kreuzreaktivität Probleme. Hinzu kommt, dass ist es nicht in der Lage ⁸ simultane Multi-PTM Analyse und direkte Quantifizierung der Modifikationsreaktionen durchzuführen. Auf der anderen Seite beschäftigt MS - Analyse ausgefeilte Instrumentierung , die Ausbildung auf hohem Niveau erfordert, bietet aber eine hohe Spezifität sowie gleichzeitige Kartierung und Quantifizierung von mehreren PTM ^9.   Jedoch sind beide Verfahren disruptive und die nukleosomalen Komplexe vor der Analyse dissoziiert, zu einer Mischung von Histonen und / oder Histon abgeleiteten Peptiden führt. Diese Manipulation entfernt die Möglichkeit, unabhängig zu unterscheidenModifikationsreaktionen, die auf jeder der beiden Schwester Histone auftreten und die Kopie spezifischen Modifikation Status der nukleosomalen Histone zu melden.

Kernspinresonanz (NMR) Spektroskopie als alternative Methode entwickelt PTM Reaktionen zuzuordnen. NMR ist eine unterbrechungsfreie und ermöglicht so die Kontrolle der PTM Ereignisse in einer Echtzeit - Weise in rekonstituierten Mischungen und sogar in intakten Zellen ^{10, 11.} Die Entwicklung von Routinen zur schnellen Datenerfassung sowie für hochauflösende Abbildung basierend auf 2D heteronuklearen Korrelationsverfahren von isotopenmarkierten ⁽¹⁵ N und / oder ¹³ C) Proben ¹² erlaubt die gleichzeitige Abbildung von verschiedenen Arten von PTMs, beispiels als Serin / Threonin / Tyrosin - Phosphorylierung, Acetylierung Lysin / Methylierung und Arginin Methylierungs ^13. In Abhängigkeit von der PTM untersuchten ¹⁵ N- oder ¹³ C-Kennzeichnung protocols kann das Protein funktionelle Gruppe zu markieren, die verwendet werden als eine Modifikation Reporter dient. Folglich kann PTM-Mapping durch Befolgen der charakteristischen chemischen Verschiebung Verschiebung der entsprechenden funktionellen Gruppe durchgeführt werden "Erfassen", um die Änderung in der chemischen Umgebung. In den meisten Fällen sowohl NH und CH chemischen Gruppen können die Entwicklung des PTM von Interesse zu berichten, verwendet werden.

Das aktuelle Protokoll beschreibt die Erzeugung von Nukleosomen unterschiedlich isotopenmarkierten Schwester Histone enthält. Es kombiniert die Flexibilität der NMR - Spektroskopie PTM zur Karte sowohl ¹ H- ¹⁵ N und ¹ H- ¹³ C - Korrelationsspektren mit der Nutzung von verschiedenen Protein - Affinität - Tags für die Reinigung der rekonstituierten ausgewählten Histon - Komplexen. Bemerkenswert ist, verwendet das Protokoll, das zwei verschiedene Pools eines bestimmten Histon für Nukleosomen Rekonstitution. Diese Pools sind unterschiedlich isotopenmarkierten (eins mit ^{15 N, die andere mit 13 C), und sie sind mit einem Polyhistidin fusionierte und einem Streptavidin Affinitätstag, respectively. Ein Tandem - Affinitätsreinigung Schema mit Ni-NTA und Streptavidin-basierte Chromatographie zunächst von Voigt et al. 7 verwendet wird , aus symmetrischen Pendants (1A) asymmetrische Spezies zu reinigen. Asymmetrische Histon Octamere werden anschließend zu rekonstituieren äquivalente nukleosomalen Komplexe (1B), unter Verwendung des Standardsalzdialyseverfahren 14 verwendet. Zusätzlich wird durch das gleiche Verfahren und durch eine der Histon-pools vormodifizierten aufweist, kann eine PTM asymmetrisch auf die resultierende Nukleosomen eingearbeitet werden. Die Umsetzung dieser Substrate mit Histon-modifizierende Enzyme und anschließender NMR-mapping Modifikations Ereignisse ermöglichen die Charakterisierung von Übersprechmechanismen sowohl in-cis (vormodifiziert Histon - copy) und in-trans (unmodified Histon - Kopie) (Abbildung 1C).}

Protokoll

1. Rekonstitution von Nukleosomen mit differentiell isotopenmarkierten (und Asymmetrisch Modified) Schwester Histone

Hinweis: Das aktuelle Protokoll beschreibt die Rekonstitution von Nukleosomen mit unterschiedlich isotopenmarkierten Histon H3. Zu diesem Zweck wurden zwei Pools von Histon H3 verwendet wird; war ¹⁵ N-markierte und enthielt einen 6xHis-Tag am N-Terminus und die zweite war ¹³ C-markiertem und enthielt die Strep - Peptid (WSHPQFEK) am N-Terminus fusioniert ist . Beide Tags wurden von der nativen H3-Sequenz mit einer Tabakätzvirus (TEV) Protease-Erkennungsstelle getrennt. Zur Herstellung von Nukleosomen zusätzliche asymmetrisch geändert, einer der beiden H3-Pools in einem vormodifizierter Form enthalten. Premodification eines Histon - Pool kann durch die Umsetzung des isotopenmarkierten Histon von Interesse mit dem jeweiligen histonmodifizierende Enzym in Gegenwart der notwendigen für jede Art von Reaktions Cofaktoren / PTM Spender ¹ durchgeführt werden ,6. Die effiziente Platzierung des jeweiligen PTM kann durch NMR-Spektroskopie oder Massenspektroskopie beurteilt werden. Die Mengen an Histone / DNA hier verwendet, sind grobe Empfehlungen eine Nukleosomen-Präparation mit einer ungefähren Konzentration von 10 uM zu erhalten (gemessen als DNA-Konzentration bei 260 nm) .Diese Endausbeute ist ausreichend, um gute Qualität NMR-Spektren mit relativ kurzen Erfassungszeiten aufzeichnen.

1. Rekonstitution eines Histonoktamer mit unterschiedlich isotopenmarkierten (und asymmetrisch modifiziert) Histon H3
   HINWEIS: Recombinant Histon - Proteine können in mg - Mengen in BL21 (DE3) pLysS - Zellen ¹⁴ hergestellt werden. An isotopenmarkierten Histonen, der gleiche Ausdruck / Reinigungsprotokoll wird gefolgt mit der Ausnahme , daß für das Bakterienwachstum einem Minimalmedium , das ¹⁵ NH ₄ Cl und / oder ¹³ C-Glucose als Stickstoff- und Kohlenstoffquellen, beispiels ¹⁵ N- oder ¹³ erhalten C-Kennzeichnung respectively. Gereinigtes Histone sind gegen 5 mM β-Mercaptoethanol dialysiert und vor der Verwendung lyophilisiert gelagert.
   1. Auflösen lyophilisierten Histon Aliquots, enthaltend ~ 5 mg jedes Histon in 1 ml Entfalten Puffer (7 M Guanidinium-HCl, 20 mM Tris pH 7,5, 10 mM DTT). Fügen Sie beide Arten von Histon H3. Mischen durch Pipettieren und nicht vortexen. Halten Sie die Röhrchen auf Eis für 30 min zu ermöglichen vollständige Entfaltung.
   2. Bestimmen die genaue Konzentration jedes Histon durch die Absorption bei 280 nm gemessen wurde gegen Puffer Entfalten und Verwenden Extinktionskoeffizienten berechnet mit dem ProtParam Werkzeug des ExPASy-Portal. ¹⁵
   3. Mischen Sie die Core-Histone zu äquimolaren Verhältnissen, unter Berücksichtigung von 50% jeder der beiden Histon H3-Pools gehören. Beginnen Sie mit den ganzen Inhalt der weniger konzentrierten Histon verwenden und dementsprechend alle anderen hinzuzufügen.
   4. Einstellen endgültige Proteinkonzentration auf ungefähr 1 mg / ml unter Verwendung von Puffer Entfalten.
   5. transfer die Mischung auf eine 6 kDa-Cutoff-Dialysemembran und dialysiert gegen 1-2 L gekühlter Rückfaltungspuffer (10 mM Tris pH 7,5, 2 M NaCl, 1 mM EDTA, 2 mM DTT) bei 4 ° C. Ändern des Puffers mindestens einmal nach der Dialyse für mindestens 3 h fortgeschritten ist. Führen Sie eine abschließende Dialyse O / N bei 4 ° C.
   6. Sammeln Sie dialysierte Material und entfernen Sie alle Niederschläge durch Zentrifugation in einer Mikrofuge für 5 min bei 4 ° C auf maximale Geschwindigkeit (in der Regel sollte kein Niederschlag beobachtet werden). Bestimmen Octamer Konzentration durch die Extinktion bei 280 nm gemessen wird. In den Berechnungen verwenden die zusätzlichen Extinktionskoeffizienten von Histonen, unter Berücksichtigung der doppelten jeden Wert.
   7. Konzentrat zu einem Endvolumen von ~ 2 ml einer 10 kDa-Cutoff-Zentrifugalfilter Einheit. Neu berechnen Oktamers Konzentration und Schätzung Verlust. An diesem Punkt wird ein Octamer Konzentration zwischen 50 bis 100 & mgr; M erhalten werden sollte.
   8. Schließen Sie das Gelfiltrationssäule (angegeben in der Tabelle der Materialien) zu einemFPLC-System und ins Gleichgewicht mit 2 Säulenvolumina (CV) von 0,22 um filtriert und entgast bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min und einem Druck von 0,5 MPa Grenze Rückfaltungspuffer.
      HINWEIS: Die Gelfiltrationslauf sollte im Kühlraum oder in einem kalten Schrank durchgeführt werden.
   9. Spritzen Sie konzentrierte Material eine Durchflussrate von 1 ml / min und 1,0 sammeln - 1,5-ml-Fraktionen.
   10. Folgen Sie das chromatographische Profil und beobachten Histonoktamer Elution bei ~ 65-68 ml.
       HINWEIS: Eine kleine Schulter des Elutionspeak und ein Peak bei ~ 80 ml weist auf die Existenz von freien H3-H4 - Tetramere und H2A-H2B Dimere sind.
   11. Laufen 20 ul jeder gesammelten Fraktion in einer 18% SDS-PAGE-Gel.
       HINWEIS: Verdünnen Sie die Proben mit einem Faktor von mindestens 2 mit Wasser , bevor sie auf das Gel laden die hohe Salzkonzentration und damit Vermeidung von Wettbewerbsverzerrungen zu verringern. Gleiches gilt für die anschließende SDS-PAGE Analysen von Proben in Puffer Neufaltung.
   12. Pool relevant fractions mit reinem Octamere durch die gleichmäßige Verteilung der 4 Histone auf dem gefärbten Gel beurteilt und bestimmen Konzentration nach wie vor (Schritt 1.1.7).
   13. Verbinden einer 1 - ml - Ni-NTA - Säule (Table of Materials) mit einem FPLC - System und Äquilibrieren mit 10 CV von 0,22 um filtriert und entgast Puffer Neufaltung bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml / min.
       HINWEIS: Die Ni-NTA - Chromatographie sollte im Kühlraum oder in einem kalten Schrank durchgeführt werden.
   14. Passieren gereinigter Octamer durch die Ni-NTA eine Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml / min verwendet wird.
   15. Sammeln Sie Flow-Through und halten Proben für SDS-PAGE / WB-Analyse (20 & mgr; l und 4 & mgr; l, beziehungsweise). Anschließend waschen Säule mit 10 CV eines Basissignals erreicht wird, Puffer oder bis Neufaltung.
   16. Eluieren mit 10 CV von Rückfaltungspuffer, enthaltend 250 mM Imidazol eine Strömungsgeschwindigkeit von 1 ml / min verwendet wird. Halten Proben für SDS-PAGE / WB-Analyse (20 & mgr; l und 4 & mgr; l, jeweils).
   17. Äquilibrieren eine 1 ml-Affinitätssäule von acommercial Streptavidin (Table of Materials) mit 10 CV Umfaltungspufferkomponenten 250 mM Imidazol enthält eine Charge / Schwerkraftfluss Setup.
       HINWEIS: Diese chromatographischen Schritt sollte im Kühlraum durchgeführt werden.
   18. Pass Ni-NTA Elution durch die kommerzielle Streptavidin-Affinitätssäule.
   19. Sammeln Sie Fluss durch und halten Proben für SDS-PAGE / WB-Analyse (20 & mgr; l und 4 & mgr; l, beziehungsweise). Anschließend waschen mit 10 CV von Puffer Neufaltung.
   20. Eluieren mit 10 CV von Umfaltungspufferkomponenten 2,5 mM Desthiobiotin enthält. Halten Sie Proben für die SDS-PAGE / WB-Analyse (20 und 4 & mgr; l jeweils).
   21. Messen Sie Oktamers Konzentration, mit 10-mal weniger TEV-Protease und lassen Reaktion gehen über Nacht bei 4 ° C in einer Standard-Kunststoff-Zentrifugenröhrchen.
       HINWEIS: Die notwendige Menge an TEV zu erhalten vollständigen Verdau (Entfernung der Affinitätstags) abhängig von der Herkunft (Konstrukt) und der Aktivität (frisch hergestellt wird rekombinantes TEV mehraktiv im Vergleich zu dem für längere Zeiträume bei gespeichert - 80 ° C). Versuchen Sie zunächst die Zugabe von 10-mal weniger TEV zum Oktamers verglichen (geschätzt als Proteinkonzentrationen) und entsprechend anpassen.
   22. Check für den effizienten Verdau von 20 & mgr; l des Gemisches ausgeführt wird vor und nach der Zugabe TEV auf einem 18% SDS-PAGE-Gel. Wenn die Verdauung nicht vollständig ist, mehr TEV-Protease hinzufügen und weiter Inkubation für eine weitere 3-4 h.
   23. Dialysiere Probe gegen Puffer Neufaltung eine 50 kDa-Cutoff-Dialysemembran mit TEV-Protease zu entfernen und Pufferzusammensetzung anzupassen.
   24. Konzentriere das gereinigte asymmetrische Octamer eine 10 kDa-Cutoff Zentrifugalfiltereinheit verwendet (dieselbe Filtereinheit aus Schritt 1.1.7 können auch verwendet werden) auf ein Volumen von 1,0-2,0 ml. Messen Sie die Endkonzentration. Verwenden Sie entweder kurz nach der für Nukleosomen Rekonstitution oder anpassen, um 50% (v / v) Glycerin für einen längeren Zeitraum bei -20 ° C zu lagern. An dieser Stelle und mindestens 70% Verlust in den vorangegangenen Schritten erwartet, th50 uM - e Octamer-Konzentration im Bereich von 20 sein sollte.
2. Nucleosome Rekonstitution
   1. Wenn Octamer in 50% Glycerin gelagert wurde, dialysiert über Nacht bei 4 ° C gegen Puffer Neufaltung bevor mit Nukleosomen Rekonstitution fortfahren.
   2. Passen DNA Salzkonzentration auf 2 M NaCl unter Verwendung einer 5 M NaCl-Stammlösung (eine Nukleosomen-Positionierung Sequenz enthält).
      HINWEIS: Die gereinigte DNA entweder isoliert nach Reinigung eines Plasmids , das mehrere Kopien der gewünschten Sequenz synthetisiert oder durch PCR - Amplifizierung enthält konzentriert werden sollte speichernden ~ 50 & mgr; M in Wasser oder in einem Standard - Tris-EDTA - Puffer.
   3. Mischungs Octamer und DNA unter Verwendung des optimalen Verhältnisses bestimmt von einem kleinen Test. Verwenden Rückfaltungspuffer das Endvolumen auf ~ 3,0 ml einzustellen. Fügen Sie immer die Oktamers letzte jede Möglichkeit zu verhindern, dass von der Octamer und die DNA bei <2 M Salzkonzentrationen zu mischen.
      1. Mit den ersten kleinen scDNA-Verhältnis, das zu einer optimalen Nukleosomen Ausbeuten führt: ale Rekonstitutionen die Oktamers zu bestimmen. Dazu montieren drei Reaktionen von 0,9: 1,0, 1,0: 1,0 und 1,1: 1,0 DNA: Oktamers Verhältnisse in einem Volumen zwischen 50 bis 100 & mgr; l. Typischerweise wird eine Konzentration von 5 & mgr; M DNA verwenden.
      2. Fahren Sie mit der Rekonstitution wie unten (Schritte 1.2.4-1.2.8) beschrieben und am Ende, schätzen die Menge an löslichen und gute Qualität wiederhergestellt Nukleosomen durch die DNA-Konzentration bei 260 nm gemessen und durch eine 6% nativer PAGE DNA Gel läuft , mit Ethidiumbromid gefärbt, bzw. (5A).
   4. Übertragen Sie die Mischung auf eine 6 kDa-Cutoff-Dialysemembran und dialysiert gegen 1 l Puffer über Nacht bei 4 ° C Neufaltung.
   5. Reduzieren die Salzkonzentration des Dialysepuffers in einem stufenweise von 2 auf 0,85, 0,64 und 0,2 M NaCl auf. Halten Probe in jedem Puffer für mindestens 3 h. Manchmal Niederschlag wird nach dem letzten Übergang gebildet. In diesem Fall continue Dialyse wie geplant und zu entfernen Präzipitat durch Zentrifugation Mikrofuge am Ende des nächsten Schritts.
   6. Transfer Dialysemembran in einem Becherglas mit 1 l Assaypuffer (25 mM NaH ₂ PO ₄ / Na ₂ HPO ₄ pH 6,8, 25 mM NaCl, 2 mM DTT) und Dialyse O / N bei 4 ° C fortgesetzt.
   7. Sammeln Probe, entfernen Sie alle Niederschlag bei Schritt 1.2.5 durch Zentrifugation in einer Mikrofuge für 5 min bei 4 ° C auf maximale Geschwindigkeit gebildet und konzentriert unter Verwendung eines 30 kDa-Cutoff-Zentrifugalfiltereinheit zu einem endgültigen Volumen von ~ 300 & mgr; l.
   8. Messen Sie DNA-Konzentration bei 260 nm, führen Sie eine 18% SDS-PAGE-Protein-Gel (4 ul der Probe) und einer 6% nativer PAGE DNA-Gel (0,2 ul der Probe) und speichern Probe bei 4 ° C für mehrere Wochen. Die Endkonzentration im Bereich von 10-20 & mgr; M sein sollte.

2. NMR-Analyse der Modifikationsreaktionen auf die beiden Schwester Histone

HINWEIS: Zuordnung2D - ¹ H- ¹⁵ N - Korrelationsspektren von nukleosomalen Histonschwänze können Referenzen ^{16, 17, 18} zu finden. Zusätzlich Zuweisungen von CH - Gruppen von Lysine _x, Serine und Threonine auf 2D - ¹ H- ¹³ C - Korrelationsspektren können bei Referenz ¹⁶ zu finden.

1. NMR - Einrichtung und Aufzeichnung von Referenzspektren
   HINWEIS: Enzymatische Assays wurden durchgeführt unter Verwendung von 140 & mgr; l der Probe in Nucleosomen Assaypuffer in ein 3-mm - NMR - Röhrchen bei 300 K. Verschiedene NMR - Röhrchen mit anderen Probenvolumina verwendet werden können. Die oben erwähnte Temperatur ist angemessen guter Qualität zu erhalten ¹ H- ¹⁵ N - Korrelationsspektren von nukleosomalen Histonschwänze und gute enzymatischen Aktivitäten. 2D-SOFAST-HMQC ¹ H- ¹⁵ N und 2D-HSQC ¹ H- ¹³ C - Spektren wurden jeweils mit einem Setup - tHut verleiht ähnliche Erfassungszeiten. Typische Aufnahmeparameter sind 128 Transienten mit 1,024 ⁽¹ H) x 128 ⁽¹⁵ N) Komplexpunkten und 32 Transienten mit 1,024 ⁽¹ H) x 64 ⁽¹³ C) komplexe Punkte für die beiden verschiedenen Typen von Korrelationsspektren. Für beide 2D-Spektren war die Akquisitionszeit ~ 30 min.
   1. Auf 300 K als die Probentemperatur in dem Spektrometer. Fügen Sie 10% D ₂ O (v / v) auf die Probe für das Spektrometer Frequenzverriegelung verwendet werden.
   2. Legen Sie die Probe in das Spektrometer und führen Sie die Grundoperationen (Verriegelung, Tuning, Shim). Darüber hinaus bestimmen die optimale Pulslängen und allgemeine Erfassungsparameter.
   3. Nehmen Sie 1D- und 2D - ¹ H- ¹⁵ N und ¹ H- ¹³ C - Referenzspektren.
   4. Prozessreferenzspektren und sicherzustellen, daß die Signale zum Abbilden der Modifizierungsreaktionen verwendet werden, werden gut aufgelöst und haben gute Intensitäten.
   5. Recover Probe und gibt it zu einem Mikrozentrifugenröhrchen.
2. Aufbau der enzymatischen Reaktion, NMR - Kontrolle und quantitative Analyse
   1. Kopieren und vereinbaren Sie eine Reihe von verschachtelten 2D - ¹ H- ¹⁵ N und ¹ H- ¹³ C - Spektren. Ziel für eine Gesamterfassungszeit von mehreren Stunden und entsprechend anpassen, in einem neuen Durchlauf auf der Basis der enzymatischen Raten aus der ersten Reaktion erhalten.
   2. In der Probe , die notwendigen Cofaktoren für die jeweilige Art der Modifizierungsreaktion (1 mM ATP / 2 mM MgCl ₂ für die Phosphorylierung, 1 mM Acetyl-CoA für die Acetylierung, 1 mM SAM für Methylierung, etc.).
   3. Fügen Sie das Enzym von Interesse, mischen durch Pipettieren, übertragen Sie die Probe wieder in das NMR-Röhrchen und anschließend in das Spektrometer (führen diese Operationen schnell).
      HINWEIS: Wenn es keine Daten über die zu erwartende Enzymaktivität ist, passen die Substrat-zu-Enzym - Molverhältnis 10: 1. Führen Sie eine erste Probelauf und entsprechend anpassen, fürder eigentliche Lauf.
   4. Führen Sie eine schnelle automatische Shim und den Rest von Parametern aus den Referenzspektren verwendet werden.
   5. Starten Sie die Serie der verschachtelten 2D - ¹ H- ¹⁵ N und ¹ H- ¹³ C - Spektren.
   6. Folgen Sie dem Verlauf der Reaktion in Echtzeit und der Erwerb stoppen, wenn die Beendigung der Reaktion oder eine gewünschte Niveau erreicht.
   7. Verfahren Spektren wie zuvor mit genau denselben Parametern.
   8. Wiederholen Sie den gesamten Lauf eine andere Erfassungsreihenfolge für die beiden Arten von Korrelationsspektren. Wenn im ersten Versuch ein ¹ H- ¹⁵ N Korrelation erste in der Reihe war, beginnen jetzt mit einem ¹ H- ¹³ C - Korrelation. Durch diese und für beide Spektren gleiche Erfassungszeit ist, ist es möglich, PTM Reaktionen auf beiden unterschiedlich isotopenmarkierten Histonen auf der gleichen Zeitskala zu planen und zu vergleichen. Darüber hinaus ist es möglich, Mittelwerte und Plot Fehlerbalken zu berechnen.
      HINWEIS: Ein thorough Beschreibung der Methoden für die NMR - Signalanalyse und anschließende Quantifizierung der enzymatischen Reaktionen können hier ¹⁹ zu finden.
   9. Wählen NMR Signale von jedem der Zeitverlauf-NMR-Spektrum, die das Fortschreiten der Reaktion berichten und berechnen ihre relativen Signalintensitäten eine Visualisierung und Analyse-Software für die NMR-Spektren verwendet wird. Tun Sie dies für Signale, die die unmodifizierte sowie den modifizierten Zustand melden. Extrahieren Sie Modifikationsstufen.
   10. Zeichnen Sie die berechneten Werte der Modifikationsstufen gegen die Reaktionszeit.

Ergebnisse

Richtig rückgefaltetem oktamere Arten werden nach einem Durchlauf der Rekonstitution Mischung durch eine Gelfiltrationssäule (Abbildung 2) isoliert. Die gebrauchsfertige oktameren Pool die drei verschiedenen Arten von Octamere enthält, wird auf dem Tandem-Affinitätsreinigung Schema unterworfen. Proben werden aus allen Schritten und durch SDS-PAGE und anschließend WB gesammelt. Überprüfung der korrekten Ausführung des Protokolls , das bei der Isolierung von asymme...

Diskussion

Für Nukleosomen Rekonstitution verwendet das aktuelle Protokoll , um eine 165 bp lange DNA - Vorlage , um die 601-Widom Nukleosomen Positioniersequenz ^20, aber eine ähnliche Leistung wird erwartet , dass mit verschiedenen Längen von DNA - Matrizen enthalten. Das Protokoll wurde entworfen und verwendet unter Verwendung asymmetrischer Arten von Histon H3. Mit dem gleichen Prinzip kann das Verfahren auch für die anderen Core-Histone angewendet werden und zusätzlich verwendet werden können Komp...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Unfolding Buffer	7M guanidinium HCl
	20mM Tris pH7.5
	10mM DTT
Refolding Buffer	10mM Tris pH7.5
	2M NaCl
	1mM EDTA
	2mM DTT
Assay Buffer	25mM NaxHxPO4 pH6.8
	25mM NaCl
	2mM DTT
Guanidinium HCl	Applichem	A14199	Use high quality Gu-HCl
Tris	Roth	4855.2
DTT	Applichem	A1101
NaCl	VWR chemicals	27810.364
EDTA	Roth	8043.2
Na2HPO4	Applichem	A1046
NaH2PO4	Applichem	A3902
Imidazole	Applichem	A1073
d-Desthiobiotin	Sigma	D1411
Ni-NTA Superflow	Qiagen	1034557
Strep-Tactin Superflow	IBA	2-1207-001
His-probe antibody	Santa Cruz	sc-8036
Strep-tactin conjugated HRP	IBA	2-1502-001
Hi-Load 16/600 Superdex 200pg	GE Healthcare	28-9893-35
6-8kDa dialysis membrane	Spectrumlabs	spectra/por 1, 132650
50kDa dialysis membrane	Spectrumlabs	spectra/por 7, 132129
10kDa centrigugal filter unit	Merck Millipore	UFC901024
30kDa centrigugal filter unit	Merck Millipore	UFC903024
Solution-state NMR spectrometer			at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe