АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает воссоздание нуклеосом, содержащих дифференцированно меченого изотопом сестра гистоны. В то же время, асимметрично посттрансляционно модифицированные нуклеосом могут быть получены после того, как с помощью premodified гистонов копии. Эти препараты могут быть легко использованы для изучения механизмов изменения перекрестных помех, одновременно на обеих сестринских гистонов, с помощью высокого разрешения ЯМР-спектроскопии.

Аннотация

Асимметрично модифицированные нуклеосомы содержат две копии гистонов (сестра гистонов), украшенные различными наборами посттрансляционных модификаций (PTMs). Они вновь выявленных видов с неизвестными средствами создания и функциональных последствий. Современные аналитические методы являются недостаточными для обнаружения копий конкретных появление PTMs на нуклеосомной сестра гистонов. Этот протокол представляет собой биохимический метод для восстановления в пробирке нуклеосом , содержащих дифференциально меченого изотопом сестра гистоны. Сформированный комплекс может быть также асимметрично изменен, после включения premodified гистонов бассейн во рефолдинга гистонов подкомплексах. Эти асимметричные нуклеосом препараты могут быть легко реагирует с гистонов модифицирующих ферментов для изучения механизмов Наводки модификации, налагаемых асимметрично предварительно включенного PTM с использованием ядерного магнитного резонанса (ЯМР). В частности, реакции модификации вв режиме реального времени могут быть отображены независимо друг от друга на двух сестринских гистонов, выполняя различные типы корреляции ЯМР-экспериментов, адаптированной для соответствующего типа изотопов. Эта методика обеспечивает средства для изучения переходных помех механизмы, которые способствуют образованию и распространению асимметричных моделей PTM на нуклеосомных комплексов.

Введение

Эукариотической ДНК плотно упакована в ядрах клеток в хроматин. Фундаментальным строительным блоком хроматина является нуклеосомная ядро ​​частицы, которая содержит ~ 147 п.н. ДНК, обернутой вокруг октамерной комплекса, состоящего из двух экземплярах, каждый из четырех основных гистонов (Н3, Н4, H2A, H2B). Гистонов белки питают множество посттрансляционных модификаций (PTMs). Эти ковалентные замены вызывают изменения в структуре хроматина, как непосредственно влияет на физическую химию системы , так и косвенно за счет привлечения хроматина ремоделирования деятельности 1, 2, 3. К этим средствам, гистонов PTMs контролировать доступность хроматина и, следовательно, регулировать все ДНК на основе клеточных функций 4.

PTMs устанавливаются гистонов модифицирующие ферментных систем в основном на неструктурированных N-концевых сегментов (хвостов) нуклеосом внедренной основной гистоуказанные в другом месте. Из - за многих модификаций участков на относительно короткой последовательности гистонов, PTMs влияют друг на друга за счет индукции или блокирования последующих реакций в модификации, эффект , известный как модификация перекрестных помех 5. Из-за общей симметричной архитектуры нуклеосомой, были мысли модификации реакции и механизмы перекрестных помех происходит аналогичным образом на двух копий каждого нуклеосомной гистона (сестра гистонов). Эта концепция была недавно оспорена и впоследствии опровергнуты. В частности, в пробирке ферментативные анализы на свободный гистонов H3 хвостовых пептидов и на нуклеосом показали , что множество Н3 киназ введена фосфорилирования в асимметричной форме 6. Кроме того, аффинно очистки на основе анализа ЖХ-МС / МС показали существование асимметрично H3-метилированных нуклеосом в нескольких типах эукариотических клеток 7. Таким образом, асимметрично модифицированные нуклеосом образуют новые виды, иинструменты необходимы, чтобы раскрыть механизмы, которые контролируют их формирование и анализ эффектов перекрестных помех, что эта асимметрия может оказывающие.

Как правило, вестерн-блоттинга (ВБ) и масс-спектрометрического анализа (МС), были использованы для обнаружения гистонов PTMs. Несмотря на легкое применение, ВБ страдает от проблем специфичности / перекрестной реактивности. Кроме того, он не способен выполнять одновременный анализ нескольких PTM и прямой количественной оценки реакций модификации 8. С другой стороны, анализ MS использует сложное оборудование , которое требует обучения на высоком уровне, но и обеспечивает высокую специфичность, а также одновременное отображение и количественной оценки множественных PTMs 9.   Тем не менее, оба метода разрушительный и нуклеосомной комплексы диссоциируют перед проведением анализа, что приводит к смеси гистонов и / или гистонов производных пептидов. Эта манипуляция устраняет способность различать независимыйРеакции модификации, которые происходят на каждой из двух сестринских гистонов и сообщить о копии конкретного статус модификации нуклеосомной гистонов.

Ядерный магнитный резонанс (ЯМР) эволюционировали в качестве альтернативного метода для сопоставления реакций PTM. ЯМР без нарушения и таким образом позволяет осуществлять мониторинг событий PTM в режиме реального времени способом , в разведенной смеси, и даже в интактных клетках 10, 11. Разработка процедур для быстрого сбора данных, а также для отображения с высокой разрешающей способностью на основе на 2D гетероолигомере ядерные методы корреляции меченого изотопом (15 Н и / или 13 С) образцов 12 позволило одновременное отображение различных типов PTMs, такие как серин / треонин / фосфорилирования тирозина, лизина ацетилирование / метилирования и аргинина метилирования 13. В зависимости от ПТМ под следствием, 15 N- или 13 C-мечение прotocols могут быть использованы, чтобы отметить функциональную группу белка, который служит в качестве модифицирующей репортера. Следовательно, отображение ПТМ может быть выполнена следующим характеристическую химического сдвига смещения соответствующей функциональной группы 'воспринимая' Чередование на химическую среду. В большинстве случаев, как NH и CH химические группы могут быть использованы, чтобы сообщить эволюцию PTM интереса.

Текущий протокол описывает генерацию нуклеосом, содержащих дифференцированно меченого изотопом сестра гистоны. Она сочетает в себе гибкость ЯМР - спектроскопии для отображения PTMs , используя как 1 Н- 15 N и 1 Н- 13 корреляции спектров C с использованием различных тегов сродства белка для очистки выбранных реконструированных гистонов комплексов. Следует отметить, что протокол использует два различных пулов определенного гистона для нуклеосомнои восстановления. Эти бассейны дифференцированно меченого изотопом (один с 15 Н, а другой с 13 С), и они слиты с полигистидиновая и стрептавидин аффинной метки, соответственно. Тандем сродства схема очистки с Ni-NTA и стрептавидин на основе хроматографии первоначально использовалась Voigt и др. 7 используется для очистки асимметричный вид от симметричных аналогов (Рис . 1А) Асимметричные гистонов октамеры используются в дальнейшем для восстановления эквивалентных нуклеосомной комплексов (рис 1b), с использованием стандартной солевой метод 14 диализный. Кроме того, с помощью той же процедуры, и при наличии одного из пулов гистонов предшествующих тем редактированию, ПТМ, могут быть включены асимметрично на полученную нуклеосом. Взаимодействие этих субстратов с гистонов модифицирующих ферментов и последующего ЯМР-картирования модификации событий позволяют охарактеризовать механизмы перекрестных помех как в-цис (premodified гистонов копия) и транс (unmodifiред гистонов копия) (рис 1C).

протокол

1. Воссоздание нуклеосом с Дифференциально меченый изотопом (и асимметрично Modified) Сестра Гистоны

ПРИМЕЧАНИЕ: Текущий протокол описывает воссоздание нуклеосом с дифференцированно меченого изотопом гистона H3. С этой целью были использованы два бассейна гистона H3; один был 15 Н-меченых и содержал 6xHis-тег на N-конце , а второй был 13 С-меченого и содержал пептид Strep (WSHPQFEK) , слитый на N-концевом участке . Обе метки были отделены от нативной последовательности Н3 с сайтом распознавания протеазы табачный Etch Вирус (ТРВ). Для того, чтобы подготовить дополнительные асимметрично модифицированных нуклеосом, один из двух Н3 бассейнов входит в premodified форме. Premodification пула гистонов может быть осуществлено путем реакции меченного изотопом гистонов интерес с соответствующим гистона-модифицирующего фермента в присутствии необходимого для каждого типа кофакторов реакции / доноров PTM 16. Эффективное размещение соответствующего ПТМ может быть оценена с помощью ЯМР-спектроскопии или масс-спектрометрии. Количества гистоны / ДНК, используемые здесь, являются приближенными рекомендации, чтобы получить нуклеосом препарат с приблизительной концентрации 10 мкМ (измеренный как концентрации ДНК при 260 нм) .Этот конечный выход достаточна для записи спектров ЯМР хорошего качества с относительно коротким временем приобретения.

  1. Воссоздание гистонового октамером с дифференцированно меченого изотопом (и асимметрично модифицированный) гистона H3
    Примечание: рекомбинантные белки гистона могут быть получены в количествах , в мг BL21 (DE3) plysS клеток 14. Для получения меченого изотопом гистоны, тот же протокол , выражение / очистка повторена за исключением использования для роста бактерий в минимальной среде , содержащей 15 NH 4 Cl и / или 13 С-глюкозой в качестве азота и углерода источников, в течение 15 или 13 N- C-маркировка respectiVely. Очищенные гистоны экстенсивно подвергали диализу против 5 мМ бета-меркаптоэтанола и хранили лиофилизировали перед использованием.
    1. Растворить лиофилизированные гистонов аликвот, содержащий ~ 5 мг каждого гистона в 1 мл буфера разворачивания (7 М гуанидин-HCl, 20 мМ Трис рН 7,5, 10 мМ ДТТ). Включите оба типа гистона H3. Смешайте с помощью пипетки и не вихрь. Хранить трубы на льду в течение 30 мин, чтобы позволить полное раскрытие.
    2. Определить точную концентрацию каждого гистона путем измерения оптической плотности при 280 нм против разворачивания буфера и с использованием коэффициентов экстинкции, вычисленных с помощью инструмента ProtParam портала ExPASy. 15
    3. Смешайте основные гистонов в эквимолярных соотношениях, имея в виду, чтобы включать в себя 50% каждого из двух бассейнов гистона H3. Начните с использованием всего содержимого менее концентрированного гистона и добавить все остальные соответственно.
    4. Регулировка конечной концентрации белка до приблизительно 1 мг / мл с использованием разворачивания буфера.
    5. TransfeR смесь диализу мембрану 6 кДа-среза и диализ против 1-2 л охлажденного рефолдинга буфера (10 мМ Трис, рН 7,5, 2 М NaCl, 1 мМ ЭДТА, 2 мМ DTT) при 4 ° С. Изменение буфера, по меньшей мере один раз после того, как диализ проводили в течение минимум 3 часов. Выполните окончательную диализ O / N при 4 ° С.
    6. Сбор диализовали материала и удалить любые преципитаты центрифугированием в микроцентрифуге в течение 5 мин при 4 ° C на максимальной скорости (обычно осадков не должно соблюдаться). Определить концентрацию октамером путем измерения оптической плотности при 280 нм. В расчетах используются добавлены коэффициенты экстинкции гистонов, имея в виду, чтобы удвоить каждого значения.
    7. Концентрат до конечного объема ~ 2 мл с использованием 10 кДа-среза блока центробежного фильтра. Перерасчет октамером концентрации и потерь оценка. На данный момент, концентрацию октамер между 50 - должно быть получено 100 мкМ.
    8. Подключите колонку для гель - фильтрации (указанный в таблице материалов) доСистема FPLC и уравновешивают с 2 объемами колонки (CV) 0,22 мкм фильтровали и дегазировали рефолдинга буфером при скорости потока 1 мл / мин и пределом давлении 0,5 МПа.
      Примечание: Фильтрация запустить гель должен быть выполнен в холодном помещении или в холодном кабинете.
    9. Вводят концентрированного материала с использованием скорости потока 1 мл / мин и собирают 1,0 - 1,5 мл фракции.
    10. Следуйте хроматографический профиль и наблюдать гистонов октамером элюция при ~ 65 - 68 мл.
      Примечание: Небольшое плечо пика элюирования и пик при ~ 80 мл свидетельствует о наличии свободных тетрамеров Н3-Н4 и H2A-H2B димеров, соответственно.
    11. Выполните по 20 мкл каждой фракции, собранной в 18% геле с SDS-PAGE.
      Примечание: Развести образцы с коэффициентом по крайней мере , 2 с водой перед их загрузкой на геле , чтобы уменьшить высокую концентрацию соли , и , таким образом, избежать искажений. То же самое относится и для последующих анализов SDS-PAGE образцов в рефолдинга буфера.
    12. Бассейн отношение Фраctions, содержащие чистые октамеры судимы по равному распределению 4 гистонов на окрашенном геле и определяют концентрацию, как и прежде (этап 1.1.7).
    13. Подключение 1 мл Ni-NTA колонке (таблица материалов) к системе FPLC и уравновешивают с помощью 10 CV 0,22 мкм фильтровали и дегазировали рефолдинга буфером при скорости потока 1 мл / мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ni-NTA хроматографии следует проводить в холодном помещении или в холодном кабинете.
    14. Проход очищенный октамером через Ni-NTA с использованием скорости потока 1 мл / мин.
    15. Собрать проточные и сохранить образцы для SDS-PAGE / ВБ анализа (20 мкл и 4 мкл, соответственно). Затем промойте колонку с 10 CV от рефолдинга не буфера или до тех пор, базовый уровень сигнала будет достигнут.
    16. Элюировать 10 CV от рефолдинга буфера, содержащего 250 мМ имидазола с использованием скорости потока 1 мл / мин. Хранить образцы для SDS-PAGE / ВБ анализа (20 мкл и 4 мкл, соответственно).
    17. Равновесие сродством колонку 1 мл переменного токаommercial стрептавидин (таблица материалов) с 10 CV рефолдинга буфера , содержащего 250 мМ имидазола с использованием установки потока партии / силы тяжести.
      Примечание: Эта хроматографическая стадия должна быть выполнена в холодном помещении.
    18. Pass Ni-NTA элюирование через коммерческий стрептавидин аффинной колонки.
    19. Собирают поток через и сохранить образцы для SDS-PAGE / ВБ анализа (20 мкл и 4 мкл, соответственно). Затем промывают 10 CV из буфера рефолдинга.
    20. Элюировать 10 CV из рефолдинга буфера, содержащего 2,5 мМ desthiobiotin. Хранить образцы для анализа SDS-PAGE / WB (20 и 4 мкл соответственно).
    21. Мера октамером концентрацию, добавьте в 10 раз меньше TEV протеазы и пусть РЕАКЦИЯ в течение ночи при 4 ° C в стандартной пластиковой центрифужной пробирке.
      Примечание: Необходимое количество ТРВ для получения полного переваривания (удаление тегов сродства) зависит от происхождения (построить) и активности (свежеприготовленные, рекомбинантный ТРВ является болееактивным по сравнению с тем, что хранится в течение длительных периодов времени при - 80 ° С). Попробуйте изначально добавляющие в 10 раз меньше TEV по сравнению с октамером (по оценкам, как концентрации белка) и настроить соответствующим образом.
    22. Проверка для эффективного пищеварения, выполнив 20 мкл смеси до и после того, как TEV дополнительно на 18% геле с SDS-PAGE. Если пищеварение не является полным, добавьте больше TEV протеазы и продолжают инкубацию еще на 3-4 часа.
    23. Диализировать образец против рефолдинга буфера с использованием диализной мембраны 50 кДа-обрезания для удаления TEV протеазы и корректировать состав буфера.
    24. Концентрат очищенный асимметричный октамером с использованием 10 кДа-среза центробежного блока фильтров (один и тот же блок фильтра из шага 1.1.7 может быть также использован) до объема 1,0-2,0 мл. Измеряют конечной концентрации. Либо использовать вскоре после того, как для нуклеосом восстановления или отрегулировать до 50% (об / об) глицерина для хранения при -20 ° С в течение более длительных периодов времени. В этот момент и ожидает потери по меньшей мере, 70% в течение предыдущих этапов, йе концентрация октамер должна быть в пределах от 20 - 50 мкМ.
  2. нуклеосом восстановление
    1. Если октамер хранили в 50% глицерине, диализ в течение ночи при 4 ° С против буфера рефолдинга перед продолжением нуклеосом восстановления.
    2. Отрегулировать ДНК (содержащий нуклеосома-позиционирования последовательности) концентрации соли до 2 М NaCl с помощью 5 М NaCl исходного раствора.
      Примечание: Очищенную ДНК либо изолированы после очистки плазмиды, содержащей несколько копий требуемой последовательности или синтезированы с помощью ПЦР - амплификации следует хранить концентрировали до ~ 50 мкм , в воде или стандартный буфер Трис-ЭДТА.
    3. Смешайте октамером и ДНК с использованием оптимального соотношения определяют из теста мелкосерийного. С помощью повторной укладки буфера для регулировки конечный объем до ~ 3,0 мл. Всегда добавляйте октамером последнего, чтобы предотвратить любую возможность смешивания октамером и ДНК в <2 М концентрации соли.
      1. Выполните начальную маленькую-SCЭлевые reconstitutions для определения октамер: соотношение ДНК, что приводит к оптимальной урожайности нуклеосом. Для этого, собрать три реакции 0,9: 1,0, 1,0: 1,0 и 1,1: 1,0: ДНК октамером соотношения в объеме между 50-100 мкл. Как правило, используют в концентрации 5 мкМ ДНК.
      2. Продолжайте восстановлением, как описано ниже (шаги 1.2.4-1.2.8) и в конце, оценить количество растворимого и хорошего качества реконструированной нуклеосомой путем измерения концентрации ДНК при 260 нм и с помощью разделяющий гель ДНК нативной PAGE 6% , окрашивали бромистым этидием, соответственно (рис 5А).
    4. Перенести смесь в диализной мембране 6 кДа-среза и диализ против 1 л рефолдинга буфера в течение ночи при температуре 4 ° С.
    5. Уменьшить концентрацию соли в буфере, диализом в ступенчатым образом от 2, до 0,85, 0,64, и 0,2 М NaCl соответственно. Хранить образец в каждом буфере в течение по крайней мере 3 ч. Иногда образуется осадок после последнего перехода. В этом случае сдиализ, как оказанию в плановых и удаления осадка путем центрифугирования микроцентрифуге в конце следующего шага.
    6. Передача диализной мембраны в химический стакан с 1 л буфера для анализа (25 мМ NaH 2 PO 4 / Na 2 HPO 4 рН 6,8, 25 мМ NaCl, 2 мМ DTT) и продолжают диализ O / N при температуре 4 ° С.
    7. Собирают пробу, удалить любой осадок, синтезированный при шаге 1.2.5 центрифугированием в микроцентрифуге в течение 5 мин при 4 ° С на максимальной скорости и концентрата с использованием 30 кДа-среза блока центробежного фильтра до конечного объема ~ 300 мкл.
    8. Измерение концентрации ДНК при 260 нм, запустить 18% SDS-PAGE гель белка (4 мкл образца) и 6% нативный-PAGE ДНК из геля (0,2 мкл образца) и хранить образца при температуре 4 ° С в течение нескольких недель. Конечная концентрация должна быть в пределах 10-20 мкМ.

2. Результаты анализа методом ЯМР модификации реакций на две сестры гистонов

Примечание: Назначение2D 1 H- 15 N корреляции спектров нуклеосомных гистонов можно найти в ссылках 16, 17, 18. Кроме того, задания СН х групп лизинов, серинам и треонина на 2D спектров корреляции 1 H- 13 C можно найти в ссылке 16.

  1. Установка ЯМР и запись эталонных спектров
    Примечание: Ферментные анализы осуществляли с использованием 140 мкл нуклеосомнои образца в буфере для анализа в ЯМР пробирку 3 мм при 300 К. Различные ЯМР пробирки с другими объемами образца может быть также использован. Вышеупомянутая температура подходит для получения хорошего качества 1 Н- 15 N корреляции спектров нуклеосомных гистонов и хорошей ферментативной активностью. 2D-SOFAST-HMQC 1 Н- 15 N и 2D-HSQC спектров 1 H- 13 C были записаны соответственно с установки тшляпа дает аналогичные времена приобретения. Типичные параметры сбора 128 Переходные процессы с 1,024 (1 H) × 128 (15 N) комплексных точек и 32 переходных процессов с 1,024 (1 Н) х 64 (13 С) комплексные точки для двух различных типов корреляции спектров. Для обоих 2D спектров, время сбора составляла ~ 30 мин.
    1. Набор 300 K в качестве температуры образца в спектрометре. Добавить 10% D 2 O (об / об) к образцу , который будет использоваться для блокировки частоты спектрометра.
    2. Поместите образец в спектрометр и выполнять основные операции (блокировка, настройка, подкладок). Кроме того, определить оптимальные длины импульса и общие параметры сбора данных.
    3. Запись 1D и 2D 1 H- 15 N и 1 H- 13 C эталонных спектров.
    4. Процесс эталонных спектров и гарантировать, что сигналы, которые будут использоваться для отображения реакций модификации хорошо разрешены и имеют хорошие интенсивности.
    5. Восстановление образца и передачи Iт в микроцентрифуге трубки.
  2. Настройка ферментативной реакции, ЯМР мониторинга и количественного анализа
    1. Копирование и организовать серию с чередованием 2D 1 H- 15 N и спектров 1 Н- 13 С. Цель в течение общего времени приобретения нескольких часов и регулировать соответствующим образом в новом выполнения на основе ферментативных ставок, полученных из первой реакции.
    2. Добавить в выборку необходимых кофакторов для соответствующего типа реакции модификации (1 мМ АТФ / 2 мМ MgCl 2 для фосфорилирования, 1 мМ ацетил-КоА для ацетилирования, 1 мМ SAM для метилирования и др.).
    3. Добавьте интерес фермент, перемешать с помощью пипетки, перенести образец обратно в трубке ЯМР, а затем в спектрометре (выполнять эти операции быстро).
      Примечание: Если нет данных об ожидаемой ферментативной активности, регулировать субстрат-энзим молярном соотношении до 10: 1. Выполните первый пробный запуск и настроить соответствующим образом дляреальный пробег.
    4. Выполните быструю автоматическую и использовать прокладок остальные параметры из эталонных спектров.
    5. Инициировать серию перемеженных 2D 1 H- 15 N и спектров 1 Н- 13 С.
    6. Последующие прогрессию реакции в режиме реального времени и остановки регистрации, когда реакция достигает завершения или желаемого уровня.
    7. Спектры процесса, как и раньше с точно такими же параметрами.
    8. Повторите весь прогон использовать другой порядок приобретения для двух типов корреляции спектров. Если в первом эксперименте 1 Н- 15 N корреляция была первой в серии, начните теперь с C корреляции 1 Н- 13. Этим и имеющие одинаковое время приобретения для обоих спектров, можно построить и сравнить реакции PTM на обоих дифференциально меченного изотопом гистонов на том же временном масштабе. Кроме того, можно рассчитать средние значения, а столбец ошибки участок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: thorougОписание ч методологий для анализа ЯМР сигнала и последующего количественного определения ферментативных реакций можно найти здесь 19.
    9. Выберите сигналы ЯМР от каждого спектра ЯМР во времени, конечно, сообщающие прогрессирование реакции и рассчитать их относительные интенсивности сигнала с использованием визуализации и анализа программного обеспечения для спектров ЯМР. Сделайте это для сигналов, которые сообщают о немодифицированного, а также модифицированную состояние. Извлечение уровней модификации.
    10. Plot расчетные значения уровней модификации от времени реакции.

Результаты

Правильно подвергнутые рефолдингу октамерных виды изолированы после пробега восстанавливающей смеси через колонку для гель - фильтрации (рисунок 2). Реконструированный октамерных пул, содержащий три различных типа октамеры подвергают схеме аффинной очистк...

Обсуждение

Для нуклеосомнои восстановления, текущий протокол использует шаблон ДНК длиной 165 пар оснований, содержащий 601-Видомом последовательность 20 нуклеосома позиционирования, но аналогичные показатели , как ожидается , с использованием различных длин ДНК - матриц. Протокол был ?...

Раскрытие информации

The author has nothing to disclose.

Благодарности

Автор благодарит д-р Филипп Selenko (ФСМ-Берлин) для обеспечения влажной лабораторного пространства и инфраструктуры для проведения экспериментов и Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) для финансирования работы через исследовательского гранта (LI 2402 / 2-1).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Unfolding Buffer7M guanidinium HCl
20mM Tris pH7.5
10mM DTT
Refolding Buffer10mM Tris pH7.5
2M NaCl
1mM EDTA
2mM DTT
Assay Buffer25mM NaxHxPO4 pH6.8
25mM NaCl
2mM DTT
Guanidinium HClApplichemA14199Use high quality Gu-HCl
Tris Roth4855.2
DTTApplichemA1101
NaClVWR chemicals27810.364
EDTARoth8043.2
Na2HPO4ApplichemA1046
NaH2PO4ApplichemA3902
ImidazoleApplichemA1073
d-DesthiobiotinSigmaD1411
Ni-NTA SuperflowQiagen1034557
Strep-Tactin SuperflowIBA2-1207-001
His-probe antibodySanta Cruzsc-8036
Strep-tactin conjugated HRPIBA2-1502-001
Hi-Load 16/600 Superdex 200pgGE Healthcare28-9893-35
6-8kDa dialysis membraneSpectrumlabsspectra/por 1, 132650
50kDa dialysis membraneSpectrumlabsspectra/por 7, 132129
10kDa centrigugal filter unitMerck MilliporeUFC901024
30kDa centrigugal filter unitMerck MilliporeUFC903024
Solution-state NMR spectrometer at least 500 MHz operating frequency, equipped with a triple-resonance cryoprobe

Ссылки

  1. Hansen, J. C. Conformational Dynamics of the Chromatin Fiber in Solution: Determinants, Mechanisms, and Functions. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 31, 361-392 (2002).
  2. Clapier, C. R., Cairns, B. R. The Biology of Chromatin Remodeling Complexes. Annu. Rev. Biochem. 78, 273-304 (2009).
  3. Musselman, C. A., Lalonde, M., Cote, J., Kutateladze, T. G. Perceiving the epigenetic landscape through histone readers. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (12), 1218-1227 (2012).
  4. Suganuma, T., Workman, J. L. Signals and Combinatorial Functions of Histone Modifications. Annu. Rev. Biochem. 80, 473-499 (2011).
  5. Lee, J. S., Smith, E., Shilatifard, A. The Language of Histone Crosstalk. Cell. 142 (5), 682-685 (2010).
  6. Liokatis, S., et al. Phosphorylation of histone H3 Ser10 establishes a hierarchy for subsequent intramolecular modification events. Nat. Struct. Mol. Biol. 19 (8), 819-823 (2012).
  7. Voigt, P., et al. Asymmetrically Modified Nucleosomes. Cell. 151 (1), 181-193 (2012).
  8. Egelhofer, T. A., et al. An assessment of histone-modification antibody quality. Nat. Struct. Mol. Biol. 18 (1), 91-93 (2011).
  9. Huang, H., Lin, S., Garcia, B. A., Zhao, Y. Quantitative Proteomic Analysis of Histone Modifications. Chem. Rev. 115 (6), 2376-2418 (2015).
  10. Liokatis, S., Dose, A., Schwarzer, D., Selenko, P. Simultaneous Detection, of Protein Phosphorylation and Acetylation by High-Resolution NMR Spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 132 (42), 14704-14705 (2010).
  11. Binolfi, A., et al. Intracellular repair of oxidation-damaged α-synuclein fails to target C-terminal modification sites. Nat. Commun. 7, 10251 (2016).
  12. Schanda, P., Kupce, E., Brutscher, B. SOFAST-HMQC experiments for recording two-dimensional heteronuclear correlation spectra of proteins within a few seconds. J. Biomol. NMR. 33 (4), 199-211 (2005).
  13. Theillet, F. X., et al. Cell signaling, post-translational protein modifications and NMR spectroscopy. J. Biomol. NMR. 54 (3), 217-236 (2012).
  14. Dyer, P. N., et al. Reconstitution of Nucleosome Core Particles from Recombinant Histones and DNA. Methods Enzymol. 375, 23-43 (2004).
  15. Artimo, P., et al. ExPASy :SIB bioinformatics resource portal. Nucleic Acids Res. 40 (W1), 597-603 (2012).
  16. Liokatis, S., klingberg, R., Tan, S., Schwarzer, D. Differentially Isotope-Labeled Nucleosomes to Study Asymmetric Histone Modification Crosstalk by Time-Resolved NMR Spectroscopy. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (29), 8262-8265 (2016).
  17. Stützer, A., et al. Modulations of DNA Contacts by Linker Histones and Post-translational Modifications Determine the Mobility and Modifiability of Nucleosomal H3 Tails. Mol. Cell. 61 (2), 247-259 (2016).
  18. Zhou, B. R., et al. Histone H4 K16Q Mutation, an Acetylation Mimic, Causes Structural Disorder of Its N-terminal Basic Patch in the Nucleosome. J. Mol. Biol. 421 (1), 30-37 (2012).
  19. Theillet, F. X., et al. Site-specific NMR mapping and time-resolved monitoring of serine and threonine phosphorylation in reconstituted kinase reactions and mammalian cell extracts. Nat. Protoc. 8 (7), 1416-1432 (2013).
  20. Lowary, P. T., Widom, J. New DNA sequence rules for high affinity binding to histone octamer and sequence-directed nucleosome positioning. J. Mol. Biol. 276 (1), 19-42 (1998).
  21. Hackenberger, C. P., Schwarzer, D. Chemoselective ligation and modification strategies for peptides and proteins. Angew. Chem. Int. Ed. 47 (52), 10030-10074 (2008).
  22. Theillet, F. X., et al. Site-specific mapping and time-resolved monitoring of lysine methylation by high-resolution NMR spectroscopy. J. Am. Chem. Soc. 134 (18), 7616-7619 (2012).
  23. Lechner, C. C., Agashe, N. D., Fierz, B. Traceless Synthesis of Asymmetrically Modified Bivalent Nucleosomes. Angew. Chem. Int. Ed. 55 (8), 2903-2906 (2016).
  24. Bernstein, B. E., et al. A bivalent chromatin structure marks key developmental genes in embryonic stem cells. Cell. 125 (2), 315-326 (2006).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

121

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены