JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים גישה מיקרוסקופית אור גיליון לדמיין את הלב CD45 + ליקוציט לחדור במודל Murine של שריר הלב, שריר הלב, אשר נגרמת על ידי טיפול דיפריה intraracheal intrachecheal של עכברים CD11c.DTR.

Abstract

מיקרוסקופ אור פלואורסצנטי (LSFM), בשילוב עם פרוטוקולי ניקוי כימיים, הפך את תקן הזהב לניתוח מבנים שכותרתו fluorescently בדגימות ביולוגיות גדולות, והוא עד רזולוציה הסלולר. בינתיים, חידוד מתמיד של הפרוטוקולים הבסיסיים ואת הזמינות המשופרת של מערכות מסחריות מיוחדות מאפשרים לנו לחקור את המיקרו של איברים העכבר כולו ואף לאפשר את אפיון ההתנהגות הסלולרית גישות שונות לחיות הדמיה תא. כאן, אנו מתארים פרוטוקול הדמיה מרחבית שלמה הר לכימות של האוכלוסייה +45 leukocyte CDI בלבבות עכברים מודלק. השיטה מעסיקה זן עכבר מהונדס (CD11c.DTR), אשר הוכח לאחרונה לשמש מודל חזק, inducible לחקר התפתחות של דלקת שריר הלב הקטינית, מתאבדת על ידי הפרעות בקצב הלב קטלני. פרוטוקול זה כולל אינדוקציה שריר הלב, intravitאל נוגדנים בתיווך מכתים התא, הכנה איברים, ו LSFM עם המחשב הבא בסיוע תמונה שלאחר עיבוד. למרות שהוצג כשיטה מתואמת מאוד עבור השאלה המדעית שלנו, הפרוטוקול מייצג את תכנית אב של מערכת מתכווננת בקלות שיכולה גם למקד מבנים ניאון שונים לחלוטין באיברים אחרים ואפילו מינים אחרים.

Introduction

במהלך האבולוציה של מיקרוסקופ אור, הופיעו צורות מיוחדות רבות, כולם פיתחו כדי למזער מגבלות בתהליך הדמיה עבור דגימות מסוימות. שיטה אחת כזו היא אור גיליון גיליון מיקרוסקופ פלואורסצנטי (LSFM). הראשון שפותח בשנת 1903 על ידי Siedentopf ו Zigigundy 1 ו מציאת יישומים ביולוגיים בסיסיים הראשון שלה בתחילת 1990 2 , LSFM הפך את כלי מיקרוסקופי חזק ביותר עד כה להדמיה של דגימות גדולות, כגון איברים עכבר שלם, עם רזולוציה האות פלואורסצנטי עד לרמה התאית. בגלל היתרונות הללו, בשילוב עם הפוטנציאל שלה לחיות תא הדמיה, שיטות טבע בשם LSFM "השיטה של ​​השנה 2014 3 ".

כפי שהשם מרמז, תאורה המדגם LSFM מתבצע על ידי גיליונות אור, אשר מכווננים בניצב לציר של המטרה המשמש fאו אוסף אור פליטה ויצירת התמונה הבאים. גיליון האור נוצר בדרך כלל על ידי מיקוד קורות לייזר רחבות וקולימטיות עם עדשה גלילית או על ידי תנועה צדדית מהירה של קורות לייזר ממוקדות צרות במישור אופקי אחד או אנכי 4 , 5 . בדרך זו, רק את המטוס המוקד של אופטיקה הדמיה מואר, בדרך כלל עם עובי של 1-4 מיקרומטר. כתוצאה מכך, עבור מדגם פלואורסצנטי להציב את המטוס תאורה, הן את הדור של אור מפוזרים ואת ההשפעות של photobleaching מאזורים מעל או מתחת למישור המוקד מסולקות או מדוכא מאוד 6 , 7 . כמו כל המטוסים מחוץ להתמקד לא מואר, אפקטים photobleaching מושמטים באזורים אלה. בניגוד למיקרוסקופיה קונפוקלית או רב פוטון רגילה, נתיבי האור המואר והנפלט נפרדים זה מזה, כך שהדימוי הסופי של התמונה Ity אינו תלוי במיקוד המושלם של קרן אור עירור דרך מטרות. בהתאם לשאלה הבסיסית, זה אפשרי ולכן ניתן להשתמש ביעדים עם שדה עצום של נוף (FOV), כך השטח הגדול ביותר האפשרי של המטוס מואר ניתן הדמיה ללא כל רכיב חלקים נעים בכיוון xy.

במערכות LSFM מודרניות, תמונה פלואורסצנטית של החלק האופטי שנוצר נלכדת במצלמת מוליכים למחצה (CMOS) משוכללים (CCD), או במצלמות משלימות של מתכת, המספקות את כל שדה הראייה (FOV) ב microseconds. לכן, על ידי הזזת המדגם דרך הסדין האור על ידי רכישת תמונות ב z-שלבים מוגדרים, ניתן לקבל את המידע המלא 3D של דגימה בסכום סביר של זמן 8 , 9 , מה שהופך את הטכניקה הזו תקף עבור תא חי Pid 12 ,התחת = "xref"> 11 , 12 .

עם זאת, למרות LSFM מציעה שיטה מהירה, רגישה, ידידותית פלואורסצנטי, שידור אור דרך הדגימה היא עדיין בעיה גדולה, במיוחד כאשר דגימות ביולוגיות גדולות הן היעד לניתוח 3D. העברת האור משתנה באופן קריטי על ידי היבטים פיזיים של הקליטה ועל ידי פיזור האור על ממשקים של מבנים עם מדדי השבירה שונים 13 . לכן, כאשר דגימות הדמיה כמה מילימטרים בגודל, LSFM הוא בשילוב בעיקר עם פרוטוקולי ניקוי כדי להפוך את דגימות אופטיות שקוף. טכניקות אלה מבוססות על הרעיון של הסרת מים מהרקמה הביולוגית המתאימה והחלפתם עם חומרי טבילה מבוססי מים או אורגניים המבוססים על ממס, אשר נבחרים להתאים באופן צר את מדדי השבירה של מרכיבי רקמת היעד הספציפיים. כתוצאה מכך, פיזור אור לרוחב ממוזער, וכל אורכי גלשל האור יכול לעבור ביעילות רבה יותר דרך הרקמה 13 . במקרים רבים, דגימות ביולוגיות המטופלות בדרך זו מופיעות בצורה צלולה ומאקרוסקופית, המאפשרת LSFM להתנהל גם על איברים של עכבר שלם, תוך שימוש במרחקים ארוכים, מטרות הגדלה נמוכות.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול הכנה עבור הדגימה מדגם גדול במיקרוסקופ אור (ראה טבלה של חומרים), אשר הקמנו לחקור את חדירת הלב הסלולר במודל Murine של שריר הלב 15 . עכברים CD11c.DTR לבטא את קולטן רעלן dymhtheria הפרימטים (DTR) תחת שליטה של ​​promotor CD16c 16 . כתוצאה מכך, תאים בעכברים אלה, אשר מבטאים CD11c יחד עם DTR, רגישים אקזוטיים של Corynebacterium diphtheria (רעלן diphtheria, DTX); את הטיפול המערכתי של בעלי חיים אלה עם תוצאות DTX דלדול של כל CD11c + CELls. CD11c הוא אינטגרין, וכקולטן של תא-תאים למגוון גורמים מסיסים שונים, מעורב בתהליכי הפעלה והתבגרות בעיקר בתאי השושלת המונוציטית. כתוצאה מכך, מודל העכבר CD11c.DTR כבר בשימוש אינטנסיבי ללמוד את התפקיד של תאים דנדריטים ותת מקרופאגים בהקשר של שאלות חיסוניות רבות. עם הזמן, דווח כי עכברים CD11c.DTR מטופלים באופן שיטתי עם DTX יכול לפתח תופעות לוואי שליליות והוא יכול להציג שיעורי תמותה גבוהות מאוד 18 , 19 . לאחרונה, הצלחנו לזהות את הסיבה הבסיסית למוות 15 , המתאר את התפתחותה של שריר הלב הדוקרני לאחר יישום DTX תוך-עיני אצל בעלי חיים אלו. האתגר הרעלני גרם להרס תאי, כולל בחלקים מרכזיים של מערכת התמריצים בלב. זה היה מלווה מסיבי CD45+ ליקוציט לחדור, ולבסוף מוביל הפרעות קצב לב קטלניות. במקרה זה, לא רק הופעתו של אוכלוסיית לויקוציטים חשוב, אלא גם את החלוקה המרחבית שלה בתוך הלב. זו השאלה הניסויית היא אתגר עבור הדמיה מיקרוסקופית המודרנית, אשר יש לנו לפתור על ידי גישה מיקרוסקופית אור גיליון נתמך על ידי מכתים נוגדן intravital ו הממס אורגני מבוסס פרוטוקול ניקוי אופטי.

Protocol

כל הניסויים בבעלי חיים נערכו בהתאם להנחיות האיחוד האירופי ואושרו על ידי הרשויות המקומיות הרלוונטיות באסן (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, גרמניה). החיות שימשו ושוכנו בתנאים ספציפיים ללא פתוגן (SPF).

1. אינדוקציה של שריר הלב על ידי דיפתריה Toxin (DTX)

  1. הכן את הפתרון DTX עבור אינדוקציה של שריר הלב על ידי דילול פתרון המניות DTX עם מלוחים שנאגרו מלוחים (PBS) לפתרון עבודה 1 מיקרוגרם / מ"ל.
  2. החל 100 μL של פתרון זה intratracheally (אותו) לתוך 8 עד 10 שבועות CD11c.DTR עכברים ( כ 5 ng / g bodyweight (bw)), כפי שמוצג על ידי Hasenberg et al. עבור היישום של ההשעיה נבג פטרייתי 20 .
    הערה: היישום intraperitoneal של רעלן עלול לגרום אינדוקציה דומה שלדלקת שריר קטלנית. עם זאת, גישה זו צריך להיות הראשון תוקף.
    1. עבור יישום זה, להרדים את החיות על ידי הזרקת intraperitoneal (IP) של 100 מ"ג / ק"ג bw קטמין ו 10 מ"ג / ק"ג xylazine bw.
    2. לאחר הגעה נרקוזיס עמוק (מבחן קמצוץ הבוהן), אינטובציה החיות באמצעות צנתר ורידי 22 ו indwelt דרך חלל הפה. בדוק את המיקום הנכון של צינור העדשה על ידי איוור החיות עם הנשמה קטן בעל חיים בקצב של 250 נשימות לדקה ואת נפח השאיפה של 250 μL לכל נשימה, גם על ידי Hasenberg et. אל. 20 .
      הערה: כאשר הנכם ממוקמים בצורה נכונה, קצב הנשימה של בעלי החיים ישתנה בהתאם להגדרות האוורור המיושמות.
    3. לנתק את מערכת אוורור לחדור את 100 μL של פתרון DTX או כמות שווה של PBS כבקרה דרך הקטטר לתוך הריאה ולהמשיך לאוורר את החיות עבור 1 דקות נוספות.
  3. בואו החיות להתאושש מהרדמה ולפקח על מצב הבריאות הכללית שינוי משקל הגוף במשך 4 ימים.
    הערה: בהתאם לרקע הגנטי, ללחץ העכבר או למשקל הראשוני, החומרה וההתחלה של שריר הלב הינן שונות, ויש לקבוען תחילה.

2. הכנה לדוגמא עבור מיקרוסקופ אור גיליון

  1. 4 ימים לאחר יישום רעלן, להרדים את העכברים על ידי שטיפה תא אינדוקציה עם תערובת isoflurane 2% vaporized / חמצן. להזריק 15 מיקרוגרם של נוגדנים נגד CD45 שכותרתו ישירות (שיבוט 30-F11, AlexaFluor647 (AF647)) ב 50 μL של PBS תוך ורידי (iv) באמצעות מסלול יישום מסלול רטרו, אשר מבטיח יישום מהיר מאוד מדויק ביותר של כמות נכונה של נוגדן.
    הערה: העומק הרצוי של נרקוזיס הגיע כאשר העכברים הם שכיבה ולא מגיבים בדיקות קמצוץ אצבע.
  2. לאחר 2 שעות של הדגירה, להקריב את העכברים על ידי פריקה צוואר הרחםD perfuse לבבות באתרו עם 5 מ"ל של PBS / EDTA (5 מ"מ).
    1. לחשוף את הלב להזריק את הפתרון זלוף לתוך החדר הימני באמצעות קטטר 21 G. פרפוזה עם לחץ איטי, קבוע ולוודא כי הדם יכול להיות סחוט לאחר חיתוך האבי העורקים.
      הערה: זה זלוף transcardial עלול לגרום מרכיבים הכנה קטין, אשר יכול להפריע להדמיה 3D הסופי של האורגן. לכן, ניסויים בבעלי חיים מתקדמים יכול לבצע את הזלוף דרך הנבוב הווריד נחות, מוריד את אבי העורקים הבטן.
  3. עבור קיבוע כימי, perfuse את הלב דרך ההפסקה אותו עם 5 מ"ל של paraformaldehyde 4% (PFA). שמור את catheter במקום ופשוט לצרף מזרק חדש מלא PFA. פרפוזה בלחץ איטי ומתמיד.
    הערה: Paraformaldehydeis רעיל מאוד; למנוע מגע עם העור, העיניים, רירית אחרים.
    1. בעדינות לתפוס את הלב עם מלקחיים משוננות; Puיהיה מעט כלפי מעלה; וחותכים את כל קשרי הרקמה, כולל העורקים הנכנסים והיוצאים והוורידים. חנות איבר עבור 4 שעות נוספות PFA 4% עבור קיבוע נוסף.
  4. כדי לייבש את האיבר, לדגור את הלב בסדרה אתנול עולה ב 50%, 70%, פעמיים ב 100%, כל 12 שעות, ב 4 ° C בחושך. כאן, להשתמש שחור 5 מ"ל צינורות פוליפרופילן התגובה, ומאפשר להם כל הזמן לסובב ב rotator צינור באמצעות מהירות סיבוב איטי כדי למנוע היווצרות בועות אוויר.
  5. הכנת המדגם השלם על ידי ניקוי כימי. כדי להפוך את הלב שקוף, דגירה אותם dibenzyl אתר 98% (DBE) תוך כל הזמן מסתובבת לילה.
    הערה: DBE מגרה את העיניים, העור ומערכת הנשימה.

3. מיקרוסקופית אור

  1. התנהגות LSFM באמצעות מיקרוסקופ אור גיליון (ראה טבלה של חומרים). מניחים את המדגם על בעל המדגם הסטנדרטי של המיקרוסקופ לתוך CU מלא DBEVette, אשר מתאים דגימות עד 30 מ"מ x 30 מ"מ x 15 מ"מ.
  2. החזק את המדגם בחוזקה במקום במהלך רכישת התמונה באמצעות בלוקים agarose מיובש וניקוי.
    1. כדי להכין את בלוקים agarose, לשפוך 2% agarose מותכת לתוך עובש (15 מ"מ x 15 מ"מ x 5 מ"מ). תן agarose להתקרר עד שהוא מתקשה.
    2. מייבשים אותו בסדרת אתנול עולה (50%, 70%, פעמיים ב 100%). דגירה בלוקים agarose לילה 98% DBE. אחסן את agarose ב DBE עד שהוא משמש.
      הערה: כמו agarose מורכבת בעיקר של מים, פעמים הדגירה עבור כל שלב התייבשות ניתן להרחיב, בהתאם לגודל של הבלוק.
      הערה: DBE מגרה את העיניים, העור ומערכת הנשימה.
    3. בעת הצורך, לחתוך את הבלוק agarose מוכן לצורה הרצויה באמצעות אזמל חדה. בדרך כלל, לחתוך טפסים פריזמה או בצורת טריז למקום בקצה של מתאם מדגם.
      הערה: כמו בלוקים agarose הם אלסטיים,המדגם נשאר במקום כאשר דחף עם כוח קטן.
  3. זיהוי אותות הקרינה של עניין (כאן, autofluorescence אנטי CD45 נוגדן מכתים) עם עירור המתאים פליטה מסנן הגדרות.
    1. עבור זיהוי של אותות החיבור autocluorescence הנגזרת של רקמת חיבור, השתמש 525/50 nm מסנן bandpass באורך גל עירור של 488 ננומטר (OPSL: 50 mW); מכתים CD45 עם נוגדנים AF647 מצמידים מזוהה ב 668 ננומטר (מסנן bandpass: 680/30 ננומטר) ו באורך גל עירור של 647 ננומטר (לייזר דיודה: 50 mW).
    2. בחר 4 מיקרומטר כמרחק בין שני מטוסים בודדים.

4. תמונה שלאחר עיבוד

הערה: נתוני התמונה הדיגיטלית שנרכשו היו מעובדים עוד יותר עם מעבד מדעי 3D / 4D עיבוד ועיבוד תוכנה (ראה טבלה של חומרים).

  1. פתיחה והתאמה מראש של קובצי הנתונים.
    1. לאחר הפעלת תוכנת הניתוח, בחר את כפתור "Surpass" בפינה השמאלית העליונה. כדי לפתוח את ערימות התמונות, בחר "קובץ", "פתח" ובחר תיקייה המכילה את הנתונים מהערוץ הראשון שנרכש. בחר "ערוך" ו"הוסף ערוצים "כדי להוסיף ערוצים שנרכשו.
      הערה: בהתאם לגודל הנתונים ולמערכת המחשב, תהליך זה עשוי להימשך מספר דקות. הפרוטוקול המוצג מדגים את כל השלבים עבור 2 ערוצי הרכישה (autofluorescence ו AF647).
    2. תקן את המאפיינים x, y ו- z voxel על ידי לחיצה על 'ערוך' ובחירת 'מאפייני תמונה'. כאשר החלון החדש נפתח, להתאים את הפרמטרים.
      הערה: שלב זה תלוי במערכת המיקרוסקופ המועסקים ובפורמט הנתונים המסוים. ערכים נכונים של xyz הם קריטיים לגודל הבא ולמידות רחוקות. ברוב המקרים, פרמטרים אלה מאוחסנים כמטא נתונים בקובצי המיקרוגרפיה. עם זאת, אם הקובץRmat לא ניתן לפרש כראוי על ידי תוכנת ניתוח, חשוב להזין ידנית את גודל פיקסל. גודל הפיקסלים במידות x ו- y תלוי בגודל הפיקסלים של המצלמה, binning שיושם באופן פוטנציאלי, ובהגדלת העדשה וההגדלה האובייקטיבית. גודל הפיקסלים ב- z הוא שווה להגדרה עצמית של צעד צעד ( למשל, 4 מיקרומטר).
  2. התאמות ערוץ
    1. ראשית לשנות את האות autofluorescence לגווני אפור על ידי פתיחת "התאמת תצוגה" ("ערוך" ו "הצג הצג התאמת"). חלון חדש יציג את כל הערוצים שנפתחו ואת הגדרות התצוגה עבור כולם; כדי לשנות את צבע ברירת המחדל שלה, בחר את ערוץ autofluorescence ולבחור את "לבן" סגנון התצוגה. לחץ על "אישור" כדי להחיל.
    2. עבור התאמת רמת השחור, חזור אל "כוונון תצוגה" והתאם את ערך השחור כדי לא לכלול אותות רקע לא רצויים שאינם מייצגים מבנה מדגםS.
      1. לשם כך, השתמש במשולש השמאלי העליון בשורת הערוץ וגרור אותו משמאל לימין.
        הערה: השינויים יחושפו מיידית. הקפד רק לדכא אותות שאינם נובעים המדגם. ערכים מינימליים ברקע לא צריך להיות "0", כדי למנוע פיקסלים שחור שחור המגרש, כמו אותות רעש עשוי להיות נחוץ עבור חישובים נוספים. ודא שכל השינויים ברמת השחור מבוצעים לאחר רכישת התמונה. אחרת, מידע מדגם יקר עלול ללכת לאיבוד. ההתאמה ברמת השחור משמשת רק למטרות ייצוגיות. כדי להשתמש באותן הגדרות תצוגה על דגימות שונות, ניתן להזין ערכים מדויקים בשדה המספרי "min" מתחת לרשימת הערוצים. זה מאוד מועיל עבור ניתוחים כמותיים.
    3. בצע כוונון אינטנסיביות, אם באמצעות המשולש הימני העליון כדי להתאים את עוצמת הערוץ בהתאמה או על ידי הזנת ערכים מדויקים לשדה המספרי "המקסימלי" מתחת לקצהרשימה.
    4. בצע כוונון ניגודיות על ידי גרירת המשולש התחתון באמצע סרגל הערוץ כדי להגדיל או להקטין את ערך גמא או על ידי הזנת הערכים המדויקים.
    5. התאם את הערוץ AF647 על פי ערוץ autofluorescence. כהבדל, להגדיר את הדמיה של האות AF647 כדי צבע חום המפה מבט שולחן. לעשות זאת על ידי בחירת מצב ערוץ "אש" בגישה דומה לזה בשלב 4.2.1.
      הערה: כמו עוצמת האות הכוללת נמוכים משמעותית לעומת ערוץ autofluorescence, את רמות שחור מתואמים בדרך כלל לערכים נמוכים בהרבה. באשר ערוץ autofluorescence, את הבהירות של הערוץ הזה הוא גדל בדרך כלל.
    6. בחר את "מצב למזג" לדמיין מבנים רקמות בפירוט. לנתח את כל הדגימות מסדרה אחת עם ערכי פרמטר אותו.
  3. קליטה וירטואלית
    1. כדי כמעט לחתוך את האיבר לפני expo סצינה 3DRt, להחיל מטוס חיתוך על אובייקט 3D שניתנו.
      1. לחץ על "קליפ מטוס" סמל (מספריים) ברשימת אובייקטים. בתצוגת התמונה, יופיעו מסגרת צהובה ומניפולטור (ציר לבן). סובב את ציר על קצה דק יותר עם העכבר, ובכך לשנות את הכיוון של מטוס חיתוך, ולהזיז את החלק האמצעי העבה של ציר כדי לבחור את העומק הרצוי של גזיר.
      2. הסתר את המסגרת ואת מניפולטור ידי ביטול הסימון תיבות הסימון בהתאמה מתחת לרשימת אובייקטים וליצור את התמונות הרצוי.

תוצאות

הגישה המוצגת LSFM מנתחת את התפלגות הליקוציטים ואת כמות הלב של Murine עם אינדוקציה של שריר הלב. איור 1 א מסביר את פרוטוקול טרום טיפול עבור עכברים CD11c.DTR מהונדס עבור אינדוקציה שריר הלב. צעד זה מייצג את הגורם הדרוש לגיוס של לויקוציטים לשריר הלב. לאחר ?...

Discussion

במדעי החיים המודרניים, הדמיון המיקרוסקופי של תהליכים ביולוגיים ממלא תפקיד חשוב יותר ויותר. בהקשר זה, התפתחויות רבות הושגו במהלך שתי המאות האחרונות המסייעות לענות על שאלות שאינן ניתנות להתייחסות עד לנקודה זו. ראשית, יש נטייה ברורה להגדיל באופן משמעותי את יכולת ההחלט?...

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

המחקר במעבדה Gunzer נתמך על ידי משרד החינוך הגרמני הפדרלי לחקר ומחקר (מס '0315590 AD) ועל ידי קרן המחקר הגרמנית (מענק מס' GU769 / 4-1, GU769 / 4-2). אנו מודים עוד IMCES עבור תמיכה טכנית Sebastian Kubat לעזרה עם מודלים 3D Cartoon.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
diphtheria toxinSigma AldrichD0564
phosphate buffered salineBiochromL182-10
ketamine [50 mg/mL]InresaPZN 4089014
xylazine [2 %]Ceva
syringeBraunREF 9161502Braun Omincan F 
indwelt venous catheter Becton DickinsonREF 381923BD Insyte Autoguard
small animal respiratorHarvard Apparatus73-0044MiniVent
anit-CD45 antibody (AF647)BioLegend103124
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrateCarl Roth8043.2
catheter (21 G)BD BiosciencesREF 387455BD valu-set
paraformaldehydeSigma AldrichP6148
PE tube (5 mL)Carl RothEKY9.1Rotilabo
ethanolCarl Roth9065.4
dibenzyl etherSigma-Aldrich108014
tube rotatorMiltenyi Biotec130-090-753MACSmix
agarose (low gelling)Sigma AldrichA4018
mold (15 x 15 x 5 mm)Tissue Tek4566Cryomold 
light sheet microscope systemLaVision BiotecUltramicroscope 
microscope bodyOlympusMVX10 
objectiveOlympus0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm 
sCMOS camera 5.5MPAndor Technology
488 nm OPSL (50mW) laserCoherent
647 nm  diode laser (50mW)Coherent
3D image processing & analysis softwareBitplaneIMARIS Ver. 8.3
transgenic mouse strainSteffen Jung et al.CD11c.DTR
wt mouse strainEnvigoBalb/c Ola Hsd J
Laser ModuleLaVision Biotec
MVPLAPO 2XC Objective Lens

References

  1. Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Annalen der Physik. 315 (1), 1-39 (1902).
  2. Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).
  3. Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3). eNeuro. 2 (3), (2015).
  4. Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78 (2), 023705 (2007).
  5. Keller, P. J., Stelzer, E. H. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (5), (2010).
  6. Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
  7. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  8. Taormina, M. J., et al. Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy. Biol. Bull. 223 (1), 7-20 (2012).
  9. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. J. Am. Soc. Nephrol. , (2016).
  10. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat. Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
  11. Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 2207 (2013).
  12. Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nat. Methods. 8 (12), 1047-1049 (2011).
  13. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  14. Maruyama, A., et al. Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser. Biomed Opt Express. 5 (10), 3311-3325 (2014).
  15. Mann, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. 46 (8), 2028-2042 (2016).
  16. Jung, S., et al. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17 (2), 211-220 (2002).
  17. Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation. Leuk. Lymphoma. 25 (5-6), 415-425 (1997).
  18. Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 175 (10), 6428-6435 (2005).
  19. Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection. Immunity. 22 (5), 561-570 (2005).
  20. Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy. J. Vis. Exp. (52), (2011).
  21. Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation. Nature. 366 (6450), 44-48 (1993).
  22. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (Pt 2), 82-87 (2000).
  23. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
  24. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  25. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  26. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  27. Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9 (1), 413-418 (1873).
  28. Göppert-Mayer, M. Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Annalen der Physik. 401 (3), 273-294 (1931).
  29. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  30. Männ, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. , (2016).
  31. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  32. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  33. Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. Refractive index of tissue measured with confocal microscopy. J Biomed Opt. 10 (4), 44014 (2005).
  34. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  35. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat. Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  36. Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10 (5), e0124650 (2015).
  37. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  38. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  39. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  40. Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy. Indian J. Dent. Res. 11 (3), 89-94 (2000).
  41. Karreman, M. A., et al. Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy. J. Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).
  42. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

123CD11c DTR

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved