Visualisation quantitative de l'infiltration de leucocytes dans un modèle murin de myocardite fulminante par microscopie à feuilles lumineuses

Résumé

Ici, nous décrivons une approche de microscopie de feuille lumineuse pour visualiser l'infiltration de leucocytes CD45 ⁺ cardiaque dans un modèle murin de myocardite fulminante aseptique, qui est induite par le traitement intratrachéal de la toxine diphtérique des souris CD11c.DTR.

Résumé

La microscopie de fluorescence à lumière légère (LSFM), combinée à des protocoles de compensation chimique, est devenue l'étalon-or pour l'analyse de structures marquées par fluorescence dans de grands échantillons biologiques et se résume à la résolution cellulaire. Pendant ce temps, le raffinement constant des protocoles sous-jacents et la disponibilité accrue de systèmes commerciaux spécialisés nous permettent d'étudier la microstructure des organes de souris entiers et permettent même de caractériser le comportement cellulaire dans diverses approches d'imagerie des cellules vivantes. Ici, nous décrivons un protocole pour la visualisation spatiale et la quantification intégrale de la population de leucocytes CD45 ⁺ chez des cœurs de souris enflammés. La méthode utilise une souche de souris transgénique (CD11c.DTR) qui a récemment été démontrée comme un modèle robuste et inducible pour l'étude du développement d'une myocardite fatale fulminante caractérisée par des arythmies cardiaques létales. Ce protocole comprend l'induction de la myocardite, intravitLa coloration cellulaire à médiation par anticorps, la préparation d'organe et la LSFM avec un post-traitement ultérieur assisté par ordinateur. Bien que présentée comme une méthode hautement adaptée pour notre question scientifique particulière, le protocole représente le plan d'un système facilement ajustable qui peut également cibler des structures fluorescentes complètement différentes dans d'autres organes et même dans d'autres espèces.

Introduction

Au cours de l'évolution du microscope optique, de nombreuses formes spécialisées sont apparues, toutes développées pour minimiser les limitations dans le processus de visualisation des spécimens particuliers. Une telle méthode est la microscopie à fluorescence légère (LSFM). Développé en 1903 par Siedentopf et Zsigmondy ¹ et pour trouver ses premières applications biologiques fondamentales au début des années 1990 ² , LSFM est devenu l'outil microscopique le plus puissant à ce jour pour la visualisation de grands spécimens, tels que des organes de souris intacts, avec une résolution de signal de fluorescence Jusqu'au niveau cellulaire. En raison de ces avantages, en combinaison avec son potentiel pour l'imagerie des cellules vivantes, Nature Methods a appelé LSFM la "Méthode de l'année 2014 ³ ".

Comme son nom l'indique, l'illumination de l'échantillon dans un LSFM est menée par des feuilles légères orientées perpendiculairement à l'axe de l'objectif utilisé fOu la collecte de lumière d'émission et la formation d'image ultérieure. La feuille de lumière est généralement générée soit en focalisant des faisceaux laser collimés et larges avec une lentille cylindrique, soit par le mouvement rapide des flancs laser étroits et focalisés dans un seul plan horizontal ou vertical ^{4 , 5} . De cette façon, seul le plan focal de l'optique d'imagerie est éclairé, généralement avec une épaisseur de 1 à 4 μm. Par conséquent, pour un échantillon fluorescent placé dans le plan d'illumination, la génération de lumière dispersée et les effets du photoblanchage des régions situées au-dessus ou en dessous du plan focal sont éliminés ou fortement supprimés ^{6 , 7} . Comme tous les avions hors-focus ne sont pas éclairés, les effets de photoblanchage sont omises dans ces domaines. Contrairement à la microscopie confocale ou à photométrie standard, les chemins de lumière éclairée et émis sont séparés l'un de l'autre, de sorte que l'image finale qualit Cela ne dépend pas de la focalisation parfaite du faisceau lumineux d'excitation à travers les objectifs. En fonction de la question sous-jacente, il est donc possible d'utiliser des objectifs avec un énorme champ de vision (FOV) afin que la plus grande surface possible du plan lumineux puisse être imagée sans que des composants ne se déplacent dans la direction xy.

Dans les systèmes LSFM modernes, une image fluorescente de la section optique générée est capturée sur un appareil à couplage de charge très sensible (CCD) ou des caméras semi-conductrices d'oxyde métallique complémentaires (CMOS) capables d'acquérir tout le champ de vision (FOV) En microsecondes. Par conséquent, en déplaçant l'échantillon à travers la feuille de lumière et en acquérant des images à des étapes z définies, il est possible d'obtenir l'information 3D complète d'un spécimen dans un délai raisonnable ^{8 , 9} , ce qui rend cette technique applicable aux cellules vivantes Études ^{10 ,}Ass = "xref"> 11 ^{, 12} .

Néanmoins, bien que LSFM offre une méthode rapide, sensible et compatible avec la fluorescence, la transmission de la lumière à travers l'échantillon est encore un problème majeur, surtout lorsque de grands échantillons biologiques sont la cible d'une analyse en 3D. La transmission de la lumière est modifiée de manière critique par des aspects physiques de l'absorption et par la diffusion de la lumière aux interfaces de structures avec différents indices de réfraction ¹³ . Par conséquent, lorsque l'imagerie échantillonne plusieurs millimètres de taille, le LSFM est principalement combiné avec des protocoles de nettoyage pour rendre les échantillons optiquement transparents. Ces techniques sont basées sur l'idée d'éliminer l'eau du tissu biologique respectif et de l'échanger avec des milieux d'immersion à base de solvant à base d'eau ou organiques, qui sont choisis pour associer étroitement les indices de réfraction des composants tissulaires cibles particuliers. En conséquence, la diffusion latérale de la lumière est minimisée et toutes les longueurs d'ondesDe la lumière peut passer beaucoup plus efficacement à travers le tissu ¹³ . Dans de nombreux cas, les spécimens biologiques traités de cette manière apparaissent macroscopiquement limpides, ce qui permet de conduire le LSFM, même sur des organes entiers de souris, en utilisant des objectifs de longue distance de travail et de faible grossissement.

Ici, nous présentons un protocole de préparation pour l'imagerie à grand échantillon dans un microscope à feuilles lumineuses (voir le tableau des matériaux), que nous avons établi pour étudier l'infiltration cardiaque cellulaire dans un modèle murin de myocardite ¹⁵ . Les souris CD11c.DTR expriment le récepteur de la toxine diphtérique des primates (DTR) sous le contrôle du promoteur CD11c ¹⁶ . En conséquence, les cellules de ces souris, qui expriment CD11c avec la DTR, sont rendues sensibles à l' exotoxine de Corynebacterium diphtheria (diphtheria toxin, DTX); Le traitement systémique de ces animaux avec DTX entraîne une épuisement de tous les CD11c ⁺ ceLls. CD11c est une intégrine et, en tant que récepteur de surface cellulaire pour une variété de différents facteurs solubles, est impliqué dans les processus d'activation et de maturation principalement dans les cellules de la lignée monocytaire ¹⁷ . Par conséquent, le modèle de souris CD11c.DTR a été intensément utilisé pour étudier le rôle des cellules dendritiques et des sous-groupes de macrophages dans le contexte de nombreuses questions immunologiques différentes. Au fil du temps, il a été rapporté que les souris CD11c.DTR traitées systémiquement avec DTX peuvent développer des effets secondaires indésirables et peuvent afficher des taux de mortalité fortement élevés ^{18 , 19} . Récemment, nous avons pu identifier la cause sous-jacente de la mort ¹⁵ , décrivant le développement de la myocardite fulminante après l'application intratrachéale DTX chez ces animaux. Le défi de la toxine a causé la destruction cellulaire, y compris dans les parties centrales du système de transmission du stimulus dans le cœur. Cela a été accompagné d'un CD45 massif+ Infiltration de leucocytes, entraînant finalement des arythmies cardiaques létales. Dans ce cas, non seulement l'apparition de la population de leucocytes était importante, mais aussi sa répartition spatiale à l'intérieur du cœur. Cette question expérimentale est un défi pour l'imagerie microscopique moderne, que nous avons résolue par une approche de microscopie à la lumière qui est soutenue par la coloration d'anticorps intravital et un protocole de nettoyage optique à base de solvants organiques.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément aux directives de l'UE et ont été approuvées par les autorités locales concernées à Essen (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Allemagne). Les animaux ont été utilisés et logés sous des conditions spécifiques de pathogène (SPF).

1. Induction de la myocardite par la toxine diphtérique (DTX)

1. Préparer la solution DTX pour l'induction de la myocardite en diluant la solution mère DTX avec une solution salée tamponnée au phosphate (PBS) à une solution de travail de 1 μg / mL.
2. Appliquer 100 μL de cette solution par voie intratrachéale (elle) dans des souris CD11c.DTR de 8 à 10 semaines ( environ 5 ng / g de poids corporel (bw)), comme l'ont montré Hasenberg et al. Pour l'application d'une suspension de spores fongiques ²⁰ .
   NOTE: L'application intrapéritonéale de la toxine peut entraîner une induction similaire deMyocardite fatale. Cependant, cette approche devrait d'abord être validée.
   1. Pour cette application, anesthésier les animaux par une injection intrapéritonéale (ip) de 100 mg / kg de kwtamétine et 10 mg / kg pc de xylazine.
   2. Après avoir atteint une narcose profonde (test de pincement), entourez les animaux en utilisant un cathéter veineux indenté 22 G à travers la cavité buccale. Vérifiez le positionnement correct du tube de l'objectif en ventilant les animaux avec un respirateur à petit animal à une vitesse de 250 respirations par minute et un volume d'inhalation de 250 μL par souffle, également montré par Hasenberg et al. Al. ²⁰ .
      REMARQUE: Lorsqu'il est positionné correctement, le taux d'inhalation des animaux changera en fonction des paramètres de ventilation appliqués.
   3. Débranchez le système de ventilation et insérez les 100 μL de solution de DTX ou une quantité égale de PBS comme un contrôle à travers le cathéter dans le poumon et continuez à ventiler les animaux pendant 1 minute supplémentaire.
3. Laissez les animaux se remettre de l'anesthésie et surveillez l'état de santé général et le changement de poids corporel pendant 4 jours.
   NOTE: Selon le fond génétique, la souche de souris ou le poids initial, la gravité et le début de la myocardite peuvent varier et devraient être déterminés en premier.

2. Préparation de l'échantillon pour la microscopie à la lumière

1. 4 jours après l'application de la toxine, anesthésier les souris en rinçant une chambre d'induction avec un mélange vaporisé à 2% d'isoflurane / oxygène. Injecter 15 μg d'un anticorps anti-CD45 marqué directement (clone 30-F11, AlexaFluor647 (AF647)) dans 50 μL de PBS par voie intraveineuse (iv) en utilisant la voie d'application rétro-orbitale, ce qui assure une application très rapide et très précise de la Quantité correcte d'anticorps.
   REMARQUE: La profondeur souhaitée de narcose a été atteinte lorsque les souris sont en position couchée et ne réagissent pas aux tests de pincement.
2. Après 2 h d'incubation, sacrifiez les souris par dislocation cervicale etD perfuse les cœurs in situ avec 5 ml de PBS / EDTA (5 mM).
   1. Exposer le cœur et injecter la solution de perfusion dans le ventricule droit à l'aide d'un cathéter 21 G. Perfuser avec une pression lente et constante et s'assurer que le sang peut être vidangé après avoir ouvert l'aorte.
      REMARQUE: Cette perfusion transcardiale pourrait entraîner des artefacts de préparation mineurs, ce qui pourrait perturber la visualisation 3D finale de l'organe. Par conséquent, les expérimentateurs animaux avancés pourraient effectuer la perfusion à travers la veine cave inférieure, en excitant l'aorte abdominale.
3. Pour la fixation chimique, perfuser le cœur par le même creux avec 5 mL de paraformaldéhyde à 4% (PFA). Gardez le cathéter en place et attachez simplement une nouvelle seringue remplie de PFA. Perfuser avec une pression lente et constante.
   REMARQUE: les paraformaldéhyde sont hautement toxiques; Éviter tout contact avec la peau, les yeux et autres muqueuses.
   1. Saisissez doucement le cœur avec des pinces dentées; PuLl légèrement vers le haut; Et couper toutes les connexions tissulaires, y compris les artères et veines entrantes et sortantes. Rangez l'organe pendant 4 h supplémentaires en PFA 4% pour une fixation supplémentaire.
4. Pour déshydrater l'organe, incuber le cœur dans une série ascendante d'éthanol à 50%, 70% et deux fois à 100%, chacun pendant 12 h, à 4 ° C dans l'obscurité. Ici, utilisez des tubes de réaction de polypropylène noir de 5 ml, ce qui leur permet de tourner de manière constante dans un rotor à tube avec une vitesse de rotation lente pour empêcher la formation de bulle d'air.
5. Préparation complète des échantillons par détartrage chimique. Pour rendre les coeurs transparents, les incuber dans 98% d'éther de dibenzyle (DBE) tout en faisant tourner en permanence pendant la nuit.
   REMARQUE: DBE est irritant pour les yeux, la peau et les voies respiratoires.

3. Microscopie à feuilles lumineuses

1. Conduire LSFM à l'aide du microscope à lumière (voir la table des matériaux). Placez l'échantillon sur le porte-échantillons standard du microscope dans la tête remplie de DBEVette, qui convient aux spécimens jusqu'à 30 mm x 30 mm x 15 mm.
2. Tenir l'échantillon solidement en place pendant l'acquisition de l'image en utilisant des blocs d'agarose déshydratés et effacés.
   1. Pour préparer les blocs d'agarose, versez 2% d'agarose fondu dans un moule (15 mm x 15 mm x 5 mm). Laissez refroidir l'agarose jusqu'à ce qu'elle se solidifie.
   2. Déshydratez-le dans une série d'éthanol ascendant (50%, 70% et deux fois à 100%). Incuber les blocs d'agarose pendant une nuit dans 98% de DBE. Conservez l'agarose dans DBE jusqu'à ce qu'il soit utilisé.
      REMARQUE: Comme l'agarose est principalement composé d'eau, les temps d'incubation pour chaque étape de déshydratation peuvent être prolongés, selon la taille du bloc.
      REMARQUE: DBE est irritant pour les yeux, la peau et les voies respiratoires.
   3. Au besoin, couper le bloc d'agarose préparé à la forme souhaitée en utilisant un scalpel pointu. Typiquement, découpez des formes prisme ou en forme de coin pour placer sur les bords de l'adaptateur d'échantillon.
      NOTE: Comme les blocs d'agarose sont élastiques,L'échantillon reste en place lorsqu'il est poussé avec peu de force.
3. Détecter les signaux de fluorescence d'intérêt (ici, autofluorescence et coloration anticorps anti-CD45) avec les paramètres appropriés d'un filtre d'émission et d'excitation.
   1. Pour la détection du signal d'autofluorescence dérivé du tissu conjonctif, utiliser un filtre passe-bande de 525/50 nm à une longueur d'onde d'excitation de 488 nm (OPSL: 50 mW); La coloration CD45 avec un anticorps couplé AF647 est détectée à 668 nm (filtre passe-bande: 680/30 nm) et à une longueur d'onde d'excitation de 647 nm (laser à diode: 50 mW).
   2. Choisissez 4 μm comme distance entre les deux plans z individuels.

4. Post-traitement d'image

REMARQUE: les données d'image numérique acquises ont été traitées avec un logiciel scientifique de traitement et d'analyse d'image 3D / 4D (voir la table des matières).

1. Ouverture et pré-ajustement des fichiers de données.
   1. Après avoir démarré le logiciel d'analyse, sélectionnez le bouton "Surpass" dans le coin supérieur gauche. Pour ouvrir les piles d'images, choisissez "Fichier", "Ouvrir", et sélectionnez un dossier contenant les données de la première voie acquise. Choisissez "Modifier" et "Ajouter des canaux" pour ajouter d'autres canaux acquis.
      REMARQUE: en fonction de la taille des données et du système informatique, ce processus peut prendre plusieurs minutes. Le protocole présenté démontre toutes les étapes pour 2 canaux d'acquisition (autofluorescence et AF647).
   2. Corrigez les dimensions du voxel x, y et z en cliquant sur "Modifier" et en sélectionnant "Propriétés de l'image". Lorsque la nouvelle fenêtre s'ouvre, ajustez les paramètres.
      REMARQUE: Cette étape dépend du système de microscope utilisé et du format de données particulier. Les valeurs correctes de xyz sont essentielles pour la taille et les mesures à distance ultérieures. Dans la plupart des cas, ces paramètres sont stockés sous forme de métadonnées dans les fichiers micrographiques. Toutefois, si le fichier foRmat ne peut pas être interprété correctement par le logiciel d'analyse, il est important d'entrer manuellement la taille du pixel. La taille des pixels dans les dimensions x et y dépend de la taille du pixel de la caméra, de la tranche appliquée potentiellement et de l'objectif et du grossissement de l'objectif. La taille de pixel en z est équivalente à la taille auto-définie en z-étape ( par exemple, 4 μm).
2. Réglages des canaux
   1. Transformez d'abord le signal d'autofluorescence en niveaux de gris en ouvrant le "Réglage de l'affichage" ("Modifier" et "Afficher le réglage de l'affichage"). Une nouvelle fenêtre répertorie tous les canaux ouverts et les paramètres d'affichage pour chacun d'eux; Pour changer sa couleur par défaut, sélectionnez le canal d'autofluorescence et choisissez le style d'affichage "blanc". Cliquez sur "ok" pour postuler.
   2. Pour le réglage du niveau du noir, revenez à "Réglage de l'affichage" et réglez la valeur du niveau du noir pour exclure les signaux de fond indésirables qui ne représentent pas la structure de l'échantillonS.
      1. Pour ce faire, utilisez le triangle supérieur gauche sur la barre de canal et faites-le glisser de gauche à droite.
         REMARQUE: les modifications seront visualisées immédiatement. Veillez à supprimer uniquement les signaux qui ne dérivent pas de l'échantillon. Les valeurs minimales en arrière-plan ne doivent jamais être "0" pour éviter les pixels noir, car les signaux de bruit peuvent être nécessaires pour des calculs supplémentaires. Assurez-vous que tous les changements de niveau de noir sont effectués après l'acquisition de l'image. Sinon, des informations précieuses sur l'échantillon peuvent être perdues. Le réglage du niveau noir sert à des fins représentatives. Pour utiliser les mêmes paramètres d'affichage sur différents échantillons, des valeurs précises peuvent être entrées dans le champ numérique "min" sous la liste des chaînes. Ceci est très utile pour les analyses quantitatives.
   3. Effectuez le réglage de l'intensité, soit en utilisant le triangle supérieur droit pour ajuster l'intensité du canal respectif, soit en entrant des valeurs précises dans le champ numérique "max" sous la canalisationL liste.
   4. Effectuez un réglage du contraste en faisant glisser le triangle inférieur au milieu de la barre de canal pour augmenter ou diminuer la valeur gamma ou en saisissant les valeurs précises.
   5. Réglez le canal AF647 selon le canal d'autofluorescence. En tant que différence, définissez la visualisation du signal AF647 dans une table de recherche de couleurs de la carte de chaleur. Pour ce faire, choisissez le mode "feu" dans une approche similaire à celle de l'étape 4.2.1.
      REMARQUE: Comme les intensités globales du signal sont nettement inférieures par rapport au canal d'autofluorescence, les niveaux de noir sont habituellement ajustés à des valeurs beaucoup plus faibles. En ce qui concerne le canal d'autofluorescence, la luminosité de ce canal augmente habituellement.
   6. Sélectionnez le "mode mélange" pour visualiser les structures tissulaires en détail. Analyser tous les échantillons d'une série avec les mêmes valeurs de paramètres.
3. Découpe virtuelle
   1. Pour ouvrir pratiquement l'organe avant l'expo de scène 3DRt, appliquez un plan d'écrêtage sur l'objet 3D rendu.
      1. Cliquez sur l'icône "Clipping Plane" (ciseaux) dans la liste des objets. À l'intérieur de la vue d'image, un cadre jaune et un manipulateur (broche blanche) apparaîtront. Tournez la broche à l'extrémité plus mince avec la souris, changeant ainsi l'orientation du plan d'écrêtage et déplacez la partie médiane plus épaisse de la broche pour sélectionner la profondeur de coupe souhaitée.
      2. Cachez le cadre et le manipulateur en décochant les cases correspondantes sous la liste des objets et créez les instantanés souhaités.

Résultats

L'approche LSFM présentée analyse la répartition des leucocytes et la quantité de cœur murin lors de l'induction d'une myocardite sévère. La figure 1A explique le protocole de prétraitement pour les souris CD11c.DTR transgéniques pour l'induction de la myocardite. Cette étape représente le déclencheur nécessaire pour le recrutement de leucocytes dans le myocarde. Après une application DTX réussie, les animaux développent des symptômes gra...

Discussion

Dans la science de la vie moderne, la visualisation microscopique des processus biologiques joue un rôle de plus en plus important. Dans ce contexte, de nombreux développements ont été réalisés au cours des deux derniers siècles qui aident à répondre à des questions non adressables jusqu'à ce point. Tout d'abord, il y a eu une nette tendance à augmenter fondamentalement la capacité de résolution des microscopes à lumière. Avec la microscopie d'illumination structurée (SIM) ^...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
diphtheria toxin	Sigma Aldrich	D0564
phosphate buffered saline	Biochrom	L182-10
ketamine [50 mg/mL]	Inresa	PZN 4089014
xylazine [2 %]	Ceva
syringe	Braun	REF 9161502	Braun Omincan F
indwelt venous catheter	Becton Dickinson	REF 381923	BD Insyte Autoguard
small animal respirator	Harvard Apparatus	73-0044	MiniVent
anit-CD45 antibody (AF647)	BioLegend	103124
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrate	Carl Roth	8043.2
catheter (21 G)	BD Biosciences	REF 387455	BD valu-set
paraformaldehyde	Sigma Aldrich	P6148
PE tube (5 mL)	Carl Roth	EKY9.1	Rotilabo
ethanol	Carl Roth	9065.4
dibenzyl ether	Sigma-Aldrich	108014
tube rotator	Miltenyi Biotec	130-090-753	MACSmix
agarose (low gelling)	Sigma Aldrich	A4018
mold (15 x 15 x 5 mm)	Tissue Tek	4566	Cryomold
light sheet microscope system	LaVision Biotec		Ultramicroscope
microscope body	Olympus		MVX10
objective	Olympus		0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm
sCMOS camera 5.5MP	Andor Technology
488 nm OPSL (50mW) laser	Coherent
647 nm  diode laser (50mW)	Coherent
3D image processing & analysis software	Bitplane		IMARIS Ver. 8.3
transgenic mouse strain	Steffen Jung et al.		CD11c.DTR
wt mouse strain	Envigo		Balb/c Ola Hsd J
Laser Module	LaVision Biotec
MVPLAPO 2XC Objective Lens