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要約

ここでは、CD11c.DTRマウスの気管内ジフテリア毒素処理によって誘発される、無菌性劇症性心筋炎のネズミモデルにおける心臓のCD45 +白血球浸潤を視覚化するための薄片顕微鏡法を説明する。

要約

Light-sheet fluorescence microscopy（LSFM）は、化学的クリアリングプロトコールと組み合わせて、大きな生物学的試料中の蛍光標識された構造を分析するためのゴールドスタンダードとなっており、細胞分解能に達しています。その一方で、基礎となるプロトコルの絶え間ない改良と特殊な商用システムの利用性の向上により、マウスの器官全体の微細構造を調べることができ、様々な生存細胞イメージングアプローチにおける細胞の挙動の特徴づけまで可能にしました。ここでは、炎症を起こしたマウスの心臓におけるCD45 +白血球集団の空間的全マウント視覚化および定量化のためのプロトコルを説明する。この方法は、致命的な心臓不整脈を特徴とする致命的な致死性心筋炎の発達の研究のための頑強な誘導性モデルとして機能することが最近示されているトランスジェニックマウス株（CD11c.DTR）を使用する。このプロトコルには、心筋炎の誘導、腹腔内アル抗体媒介性細胞染色、器官調製、およびその後のコンピュータ支援画像後処理を伴うLSFMを含む。我々の特定の科学的な問題に高度に適合した方法として提示されているが、プロトコールは、他の臓器および他の種においても全く異なる蛍光構造を標的とすることができる容易に調節可能なシステムの青写真を表す。

概要

光学顕微鏡の進化の間、多くの特殊な形態が現れ、それらの全てが特定の標本の視覚化プロセスの限界を最小限に抑えるために開発された。このような方法の1つは、薄シート蛍光顕微鏡法（LSFM）である。最初にSiedentopfとZsigmondy 1によって1903年に開発され、1990年代初頭の最初の基本的な生物学的応用を発見した2。LSFMは、蛍光シグナルの分解能を持つ無傷のマウス器官などの大きな標本の視覚化のための最も強力な顕微鏡ツール細胞レベルまで低下する。これらの利点のために、生存細胞イメージングの可能性と組み合わせて、Nature MethodsはLSFMを「2014年の方法」 3と名付けました。

名前が示唆するように、LSFMでのサンプル照明は、使用される対物レンズの軸に垂直に向けられた光シートによって行われますまたは発光光収集およびその後の画像形成を含む。光シートは、通常、シリンドリカルレンズを用いて広いコリメートされたレーザビームを集束することによって、またはただ1つの水平または垂直平面4,5 において狭く集束されたレーザビームの迅速な横方向移動によって生成される。このようにして、結像光学系の焦点面のみが、典型的には1~4μmの厚さで照明される。その結果、照明面に置かれた蛍光試料については、散乱光の生成と、焦点面の上方または下方の領域からの光退色の影響がともに排除または大幅に抑制される6,7 。すべての焦点外れ面が照らされないので、これらの領域では光退色効果は省略される。標準的な共焦点または多光子顕微鏡法とは対照的に、照射された光および放出された光の経路は互いに分離されているので、最終的な画像品質対物レンズを通る励起光ビームの完全な集束には依存しない。基礎となる質問に依存して、膨大な視界（FOV）を有する対物レンズを使用することが可能であり、照明された平面の可能な限り大きな領域を、xy方向に移動する構成部品なしで撮像することができる。

現代のLSFMシステムでは、生成された光学セクションの蛍光画像が、高感度の電荷結合素子（CCD）または相補型金属酸化膜半導体（CMOS）カメラ上に捕捉され、視野全体（FOV）マイクロ秒単位。したがって、光シートを通って試料を移動させ、規定されたzステップで画像を取得することによって、合理的な時間8,9 において試料の完全な3D情報を得ることができ、この技術を生細胞に適用することができる研究10 、ass = "xref"> 11,12。

それにもかかわらず、LSFMは迅速で、感度が高く、蛍光に優しい方法を提供するが、特に大きな生体試料が3D解析の標的である場合、標本を通る光の伝達は依然として大きな問題である。光の透過率は、吸収の物理的な側面と屈折率の異なる構造の界面での光の散乱によって決定的に変化します13 。したがって、数ミリメートルの大きさの試料を撮像する場合、LSFMは、大部分が透明化プロトコルと組み合わされて、試料を光学的に透明にする。これらの技術は、それぞれの生物学的組織から水分を除去し、特定の標的組織成分の屈折率に狭く一致するように選択された水または（有機）溶媒ベースの液浸媒体と交換するという考えに基づいている。その結果、横方向散乱が最小限に抑えられ、すべての波長より効率的に組織13を通過することができる。多くの場合、このように処理された生物学的標本はマクロ的に結晶透明であり、長い作動距離、低倍率の目的を用いてLSFMをマウスの器官全体でさえも導くことができる。

ここでは、心筋炎マウスモデルの細胞心臓浸潤を調べるために確立した薄いシート顕微鏡（材料の表を参照）での大量サンプルイメージングの準備プロトコールを示します。 CD11c.DTRマウスは、CD11cプロモーター16の制御下で霊長類ジフテリア毒素受容体（DTR）を発現する。その結果、DTRとともにCD11cを発現するこれらのマウスの細胞は、 Corynebacterium diphtheria （ジフテリア毒素、DTX）の外毒素に対して感受性になる 。これらの動物をDTXで全身治療すると、すべてのCD11c + ceが枯渇するlls。 CD11cはインテグリンであり、様々な異なる可溶性因子の細胞表面受容体として、主に単球系譜17の細胞において活性化および成熟プロセスに関与する。その結果、CD11c.DTRマウスモデルは、多くの異なる免疫学的質問の文脈における樹状細胞およびマクロファージサブセットの役割を研究するために集中的に使用されている。時間の経過とともに、DTXで全身治療されたCD11c.DTRマウスは有害な副作用を引き起こし、死亡率が著しく上昇することが報告されている18,19。最近、本発明者らは、これらの動物における気管内DTX適用後の劇症性心筋炎の発症を説明する、根本的な死因15を特定することができた。毒素攻撃は、心臓における刺激伝達系の中心部を含む細胞破壊を引き起こした。これには大量のCD45+白血球浸潤、最終的に致命的な心臓不整脈に至る。この場合、白血球集団の出現が重要であるだけでなく、心臓内部の空間分布も重要であった。この実験的問題は、現代の顕微鏡イメージングの課題であり、私たちは、生体内抗体染色および有機溶媒ベースの光学的クリアリングプロトコルによって支持される薄いシート顕微鏡法によって解決した。

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プロトコル

すべての動物実験はEUのガイドラインに従って実施され、エッセン（AZ 84-02.04.2014.A036 - LandesamtfürNatur、Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen、Essen、Germany）の関連する地方当局によって承認された。動物を使用し、特定の病原体不含（SPF）条件下で飼育した。

ジフテリア毒素（DTX）による心筋炎の誘導

  1. リン酸緩衝生理食塩水（PBS）でDTXストック溶液を希釈して1μg/ mLの作業溶液にすることにより、心筋炎の誘導のためのDTX溶液を調製する。
  2. Hasenberg らが示すように、この溶液100μLを8-10週齢のCD11c.DTRマウス（ 約 5 ng / g体重（bw））に気管内投与する。真菌の胞子懸濁液の適用20 。
    注：毒素の腹腔内適用は、致命的な心筋炎。しかし、このアプローチはまず検証されなければならない。
    1. それを適用するために、ケタミン100mg / kgおよびキシラジン10mg / kgの腹腔内（腹腔内）注射によって動物を麻酔する。
    2. 深刻な麻酔（トウピンチ試験）に達した後、22Gの留置静脈カテーテルを口腔に通して動物に挿管する。 Hasenbergらによって示されているように、動物を小型動物呼吸器で毎分250回、息当たり250μLの吸入量で換気することにより、レンズチューブの正しい位置を確認する。 al。 20 。
      注記：正しく配置すると、適用された換気設定に従って動物の呼吸数が変化します。
    3. 換気システムを外し、100μLのDTX溶液または対照と同じ量のPBSをカテーテルを通して肺に注入し、動物をさらに1分間換気し続ける。
  3. 動物を麻酔から回復させ、一般的な健康状態および体重変化を4日間監視する。
    注：遺伝的背景、マウスのひずみ、または最初の体重に応じて、心筋炎の重篤度および発症率が異なり、最初に決定する必要があります。

2.薄いシート顕微鏡の試料調製

  1. 毒素適用の4日後に、気化した2％イソフルラン/酸素混合物で誘導チャンバーをフラッシュすることによってマウスを麻酔する。レトロ軌道の適用経路を使用して50μLのPBS中に15μgの直接標識抗CD45抗体（クローン30-F11、AlexaFluor647（AF647））を静脈内（iv）注入し、非常に迅速かつ高精度の抗体の正しい量。
    注：マウスがリカンベントであり、つまんでピンチテストに反応しない場合、所望の麻酔深度に達している。
  2. 2時間のインキュベーションの後、マウスを頸部脱臼により屠殺し、5mLのPBS / EDTA（5mM） をその場で灌流する。
    1. 心臓を露出させ、21Gカテーテルを用いて右心室に灌流溶液を注入する。ゆっくりと一定の圧力で灌流し、大動脈を切開した後に血液を抜くことができることを確認する。
      注：この心筋灌流は、器官の最終的な3D視覚化を妨げる可能性がある、わずかな準備アーチファクトをもたらすことがある。したがって、高度な動物実験者は、下大静脈を通して腹部大動脈を切除し、腹部大動脈を切除することができた。
  3. 化学的固定のために、5mLの4％パラホルムアルデヒド（PFA）を用いて同じくぼみを通して心臓を灌流する。カテーテルを所定の位置に保持し、PFAで満たされた新しいシリンジを単に取り付ける。ゆっくりと一定の圧力で熟す。
    注：パラホルムアルデヒドは非常に毒性が強い。皮膚、眼、および他の粘膜との接触を避ける。
    1. 穏やかに鋸歯状鉗子で心臓をつかむ。 puそれはやや上向きです。出入りする動脈および静脈を含むすべての組織接続を切断する。さらなる固定のために、器官を4％PFAでさらに4時間保管する。
  4. 臓器を脱水するには、暗所で4℃、50％、70％、100％でそれぞれ12時間、上昇するエタノールシリーズで心臓をインキュベートする。ここでは、黒い5 mLのポリプロピレン製反応管を使用し、気泡の発生を防ぐためにゆっくりとした回転速度を使用して管回転装置で絶えず回転させます。
  5. 化学薬品による完全なサンプル調製。心臓を透明にするために、常に一晩中回転させながら、それらを98％ジベンジルエーテル（DBE）中でインキュベートする。
    注：DBEは眼、皮膚、および呼吸器系を刺激する。

光シート顕微鏡

  1. ライトシート顕微鏡を使用してLSFMを実施します（材料表を参照）。顕微鏡の標準試料ホルダー上の試料をDBE充填Cu30mm×30mm×15mmまでの標本に適したベットである。
  2. 脱水され、クリアされたアガロースブロックを使用して、画像取得の間、試料を適所にしっかりと保持する。
    1. アガロースブロックを調製するために、2％溶融アガロースを金型（15mm×15mm×5mm）に注ぐ。凝固するまでアガロースを冷ます。
    2. 上向きエタノールシリーズ（50％、70％、100％で2回）で脱水する。アガロースブロックを98％DBEで一晩インキュベートする。アガロースを使用するまでDBEに保存する。
      注：アガロースは主に水で構成されているため、各脱水段階のインキュベーション時間は、ブロックのサイズに応じて延長される場合があります。
      注：DBEは眼、皮膚、および呼吸器系に刺激を与えます。
    3. 必要に応じて、準備されたアガロースブロックを鋭利なメスを使用して所望の形状に切断する。典型的には、プリズムまたはくさび形の形状を切断して、サンプルアダプターの端に配置します。
      注：アガロースブロックは弾性であるため、わずかな力で押されたときにサンプルは定位置にとどまります。
  3. 適切な励起および発光フィルター設定で目的の蛍光シグナル（ここでは、自己蛍光および抗CD45抗体染色）を検出する。
    1. 結合組織由来の自己蛍光シグナルを検出するには、励起波長488 nm（OPSL：50 mW）で525/50 nmのバンドパスフィルターを使用します。 AF647結合抗体によるCD45染色は、668nm（バンドパスフィルター：680 / 30nm）および647nmの励起波長（ダイオードレーザー：50mW）で検出される。
    2. 2つの個別のz平面間の距離として4μmを選択します。

4.画像後処理

注：得られたデジタル画像データは、科学的3D / 4D画像処理および分析ソフトウェア（材料の表を参照）でさらに処理した。

  1. データファイルのオープンと事前調整。
    1. 分析ソフトウェアを起動した後、左上隅の "Surpass"ボタンを選択します。画像スタックを開くには、「ファイル」、「開く」を選択し、最初に取得したチャンネルのデータを含むフォルダを選択します。追加のチャンネルを追加するには、[編集]と[チャンネルを追加]を選択します。
      注記：データサイズやコンピュータシステムによっては、この処理に数分かかることがあります。提示されたプロトコールは、2つの獲得チャネル（自己蛍光およびAF647）の全てのステップを示す。
    2. 「編集」をクリックして「画像のプロパティ」を選択して、x、y、zボクセルの寸法を修正します。新しいウィンドウが開いたら、パラメータを調整します。
      注：このステップは、使用される顕微鏡システムおよび特定のデータフォーマットに依存します。正しいxyz値は、後続のサイズおよび遠隔測定には重要です。ほとんどの場合、これらのパラメータは、顕微鏡写真ファイルにメタデータとして保存されます。ただし、ファイルformatは分析ソフトウェアによって正しく解釈されないため、手動でピクセルサイズを入力することが重要です。 xおよびy次元のピクセルサイズは、カメラのピクセルサイズ、適用される可能性のあるビニング、およびレンズと対物レンズの倍率によって異なります。 zのピクセルサイズは、自己定義されたzステップサイズ（ 例えば、 4μm）に等しい。
  2. チャンネルの調整
    1. まず、 "Display adjustment"（ "Edit"と "Show Display Adjustment"）を開いて、自家蛍光信号をグレースケールに変換します。新しいウィンドウには、開いているすべてのチャンネルとそのすべての表示設定が表示されます。デフォルトの色を変更するには、自己蛍光チャンネルを選択し、 "白"表示スタイルを選択します。 「OK」をクリックして適用します。
    2. 黒レベル調整の場合は、「表示調整」に戻って黒レベルの値を調整して、サンプル構造を表さない不要なバックグラウンド信号を除外しますs。
      1. これを行うには、チャンネルバーの左上三角形を左から右にドラッグします。
        注：変更はすぐに視覚化されます。サンプルから派生していない信号のみを抑制するようにしてください。ノイズ信号が追加の計算に必要となる可能性があるため、ピッチ黒画素を避けるために、バックグラウンドの最小値を決して "0"にしないでください。画像取得後にすべての黒レベルの変更が実行されていることを確認してください。そうしないと、貴重なサンプル情報が失われる可能性があります。黒レベルの調整は代表的な目的にすぎません。異なるサンプルで同じディスプレイ設定を使用するには、チャンネルリストの下の「最小」の数値フィールドに正確な値を入力します。これは定量分析に非常に役立ちます。
    3. 右上の三角形を使用してそれぞれのチャンネルの強さを調整するか、またはチャンネルの下の「最大」数値フィールドに正確な値を入力することによって、強度調整を実行しますリスト。
    4. チャンネルバーの中央にある下三角をドラッグしてガンマ値を増減するか、または正確な値を入力して、コントラスト調整を実行します。
    5. 自己蛍光チャンネルに従ってAF647チャンネルを調整します。違いとして、AF647信号の可視化をヒートマップカラールックアップテーブルに設定します。手順4.2.1と同様の方法でチャンネルモード「火」を選択してください。
      注：全体のシグナル強度は自己蛍光チャネルに比べて大幅に低いので、黒レベルは通常より低い値に調整されます。自己蛍光チャネルに関しては、このチャネルの輝度は通常増加する。
    6. 「ブレンドモード」を選択して、組織構造を詳細に視覚化します。 1つのシリーズのすべてのサンプルを同じパラメータ値で分析します。
  3. 仮想クリッピング
    1. 3Dシーンのエキスポの前にオルガンを事実上切り開くにはレンダリングされた3Dオブジェクトにクリッピングプレーンを適用します。
      1. オブジェクトリストの "Clipping Plane"アイコン（はさみ）をクリックします。画像ビュー内で、黄色の枠とマニピュレータ（白いスピンドル）が表示されます。スピンドルを薄い方の端でマウスで回転させると、クリッピング面の向きが変わり、スピンドルの中央部が厚くなり、必要なクリッピングの深さが選択されます。
      2. オブジェクトリストの下のそれぞれのチェックボックスをオフにして、フレームとマニピュレータを非表示にし、目的のスナップショットを作成します。

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結果

提示されたLSFMアプローチは、重篤な心筋炎の誘導時のマウス心臓の白血球分布および量を分析する。 図1Aは、心筋炎誘導のためのトランスジェニックCD11c.DTRマウスの前処理プロトコールを説明する。このステップは、白血球の心筋への動員に必要な引き金を表す。成功したDTX適用の後、動物は、一般的な衰弱、食欲不振、および2〜4日の範囲内の体重減?...

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ディスカッション

現代の生命科学では、生物学的プロセスの顕微鏡視覚化がますます重要な役割を果たしている。この文脈では、この時点までに対処できない質問に答えるために役立つ過去2世紀の間に多くの開発が達成されました。第1に、光学顕微鏡の解像度能力を根本的に増加させる明らかな傾向があった。一度仮定された分解能制限による構造化照明顕微鏡（SIM） 21,22 、誘導?...

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開示事項

著者は何も開示することはない。

謝辞

Gunzer研究所の研究は、ドイツ連邦教育研究省（付与番号0315590 AD）およびドイツ研究財団（付与番号GU769 / 4-1、GU769 / 4-2）の支援を受けていた。テクニカルサポートについてはIMCES、3D漫画モデリングについてはSebastian Kubatに感謝いたします。

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資料

NameCompanyCatalog NumberComments
diphtheria toxinSigma AldrichD0564
phosphate buffered salineBiochromL182-10
ketamine [50 mg/mL]InresaPZN 4089014
xylazine [2 %]Ceva
syringeBraunREF 9161502Braun Omincan F 
indwelt venous catheter Becton DickinsonREF 381923BD Insyte Autoguard
small animal respiratorHarvard Apparatus73-0044MiniVent
anit-CD45 antibody (AF647)BioLegend103124
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrateCarl Roth8043.2
catheter (21 G)BD BiosciencesREF 387455BD valu-set
paraformaldehydeSigma AldrichP6148
PE tube (5 mL)Carl RothEKY9.1Rotilabo
ethanolCarl Roth9065.4
dibenzyl etherSigma-Aldrich108014
tube rotatorMiltenyi Biotec130-090-753MACSmix
agarose (low gelling)Sigma AldrichA4018
mold (15 x 15 x 5 mm)Tissue Tek4566Cryomold 
light sheet microscope systemLaVision BiotecUltramicroscope 
microscope bodyOlympusMVX10 
objectiveOlympus0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm 
sCMOS camera 5.5MPAndor Technology
488 nm OPSL (50mW) laserCoherent
647 nm  diode laser (50mW)Coherent
3D image processing & analysis softwareBitplaneIMARIS Ver. 8.3
transgenic mouse strainSteffen Jung et al.CD11c.DTR
wt mouse strainEnvigoBalb/c Ola Hsd J
Laser ModuleLaVision Biotec
MVPLAPO 2XC Objective Lens

参考文献

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