JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Burada, CD11c.DTR farelerinin intratrakeal difteri toksini tedavisi ile indüklenen, bir aseptik fulminan miyokardit modelinde kardiyak CD45 + lökosit infiltrasyonunu görselleştirmek için bir ışık-tabakalı mikroskopik yaklaşım anlatılmaktadır.

Özet

Kimyasal temizleme protokolleri ile birlikte, ışık saçlı floresans mikroskobu (LSFM), büyük biyolojik örneklerde flüoresan etiketli yapıların analizi için altın standart haline geldi ve hücresel çözünürlüğe indirgendi. Bu arada, temel protokollerin sürekli arıtılması ve uzmanlaşmış ticari sistemlerin artan kullanılabilirliği, tüm fare organlarının mikroyapısını araştırmamızı ve hatta çeşitli canlı hücre görüntüleme yaklaşımlarında hücresel davranışın karakterizasyonuna izin vermemizi sağlıyor. Burada, iltihaplı fare kalplerindeki CD45 + lökosit popülasyonunun mekansal tüm montaj görüntüsü ve miktarının belirlenmesi için bir protokolü açıklıyoruz. Yöntem ölümcül kardiyak aritmilerle karakterize fulminan ölümcül miyokardit gelişimi için son zamanlarda sağlam ve endüklenebilir bir model olarak hizmet ettiği gösterilmiş bir transgenik fare soyunu (CD11c.DTR) kullanmaktadır. Bu protokol miyokardit indüksiyonu, intravitAl antikor aracılı hücre boyaması, organ hazırlığı ve LSFM'den sonra bilgisayar destekli görüntü sonrası işleme tabi tutulur. Belirli bilimsel sorunuz için oldukça uyarlanmış bir yöntem olarak sunulmasına rağmen, protokol, diğer organlarda ve hatta diğer türlerde bile tamamen farklı florasan yapıları hedefleyebilen kolayca ayarlanabilen bir sistemin planını temsil etmektedir.

Giriş

Işık mikroskopisinin gelişimi sırasında, birçoğu özel formlar ortaya çıktı, bunların hepsi belirli örnekler için görselleştirme sürecindeki sınırlamaları en aza indirmek için geliştirildi. Böyle bir yöntem, ışık saçlı floresan mikroskobu (LSFM) 'dir. İlk olarak 1903'te Siedentopf ve Zsigmondy 1 tarafından geliştirilmiş ve 1990'ların başında ilk temel biyolojik uygulamaları bulan 2 , LSFM, flüoresan sinyal çözünürlüğü ile bozulmamış fare organları gibi büyük örneklerin görselleştirilmesi için şimdiye kadarki en güçlü mikroskopik araç haline gelmiştir Hücresel seviyeye iner. Bu avantajlardan dolayı, canlı hücre görüntüleme potansiyeli ile birlikte Nature Methods LSFM "Yılın Metodu 2014 3 " olarak adlandırılmıştır.

Adından da anlaşılacağı üzere, bir LSFM'deki örnek aydınlatma, kullanılan objektifin eksenine dikey olarak yönlendirilmiş ışık saçak levhaları tarafından yürütülür.Veya emisyon ışık toplama ve müteakip görüntü oluşumu. Işık tabakası genellikle silikon lensli geniş, kollektrik lazer ışınlarına odaklanarak veya dar, odaklanmış lazer ışınlarının hızlı yatay hareketiyle sadece bir yatay veya dikey düzlem 4 , 5'de oluşturulur. Böylece görüntüleme optiklerinin sadece odak düzlemi, tipik olarak 1-4 μm kalınlıkta aydınlatılır. Sonuç olarak, aydınlatma düzlemine yerleştirilen bir flüoresan numune için hem dağınık ışık üretimi hem de odak düzleminin üstündeki veya altındaki bölgelerden gelen foto-ağartma etkileri elimine edilir veya büyük ölçüde bastırılır 6 , 7 . Odak dışına çıkan tüm düzlemler aydınlatılamadığından, bu alanlarda fotoblokaj efektleri ihmal edilir. Standart konfokal veya çoklu foton mikroskopisinin aksine, aydınlatılmış ve yayılan ışık yolları birbirinden ayrıdır, bu nedenle son görüntü niteliği Uyarı ışık ışınının hedefler boyunca mükemmel şekilde odaklanmasına bağlı değildir. Bu nedenle, altta yatan soruya bağlı olarak, aydınlatılmış düzlemin mümkün olan en geniş alanı, xy yönünde hareket eden herhangi bir bileşen parçası olmadan görüntülenecek şekilde muazzam bir görüş alanına sahip hedefleri (FOV) kullanmak mümkündür.

Modern LSFM sistemlerinde, üretilen optik bölümün flüoresan görüntüsü, tüm görüş alanını (FOV) elde edebilen oldukça hassas bir şarj kuplajlı cihaz (CCD) veya tamamlayıcı metal oksit yarı iletken (CMOS) kameralar üzerinde yakalanır. Mikrosaniye cinsinden. Bu nedenle, numuneyi ışık tabakası boyunca hareket ettirerek ve tanımlanmış z adımlarında görüntü elde ederek, bu tekniği canlı hücre için geçerli hale getiren makul bir süre 8 , 9 olan bir numunenin tam 3D bilgisini elde etmek mümkündür Çalışmalar 10 ,Ass = "xref"> 11 , 12 .

Bununla birlikte, LSFM hızlı, hassas ve fluoresan dostu bir yöntem sunsa da, özellikle büyük biyolojik numuneler bir 3B analizi için hedef olduğunda, örnek üzerinden ışık iletimi hala önemli bir konudur. Işık iletimi, emilimin fiziksel yönleri ve farklı kırılma indeksleri olan yapıların ara yüzlerindeki ışık saçılımıyla eleştirel olarak modifiye edilmiştir 13 . Bu nedenle, görüntüleme örnekleri birkaç milimetre boyutunda olduğunda LSFM, çoğunlukla örnekleri optik olarak şeffaf hale getirmek için temizleme protokolleriyle birleştirilir. Bu teknikler, suyun ilgili biyolojik dokudan çıkarılması ve belirli hedef doku bileşenlerinin kırılma indekslerine dar bir şekilde uyacak şekilde seçilen su veya organik solvent bazlı daldırma ortamlarıyla değiştirilmesi fikrine dayanmaktadır. Sonuç olarak, yanal ışık saçılımı en aza indirilir ve tüm dalga boylarıIşığın dokudan daha etkin bir şekilde geçebileceğini 13 . Birçok durumda, bu şekilde tedavi edilen biyolojik örnekler makroskopik açıdan berrak görünür ve LSFM'nin tüm fare organlarında bile uzun çalışma mesafesi, düşük büyütme hedefleri kullanılarak gerçekleştirilmesini sağlar.

Burada, miyokardit 15'teki bir fare modelinde hücresel kardiyak infiltratı araştırmak için kurduğumuz ışık saçlı mikroskopta (materyal tablosuna bakınız) geniş örneklem görüntüleme için bir hazırlama protokolü sunulmaktadır. CD11c.DTR fareleri primat difteri toksin reseptörünü (DTR) CD11c promotor 16 kontrolü altında ifade eder. Sonuç olarak, DTR ile birlikte CD11c'yi eksprese eden bu farelerdeki hücreler, Corynebacterium difteri (difteri toksini, DTX) ekzotoksinine duyarlı hale getirilir; Bu hayvanların DTX ile sistemik olarak muamele edilmesi, tüm CD11c + ce'nin tükenmesine yol açarrf. CD11c, bir integrindir ve çeşitli farklı çözünür faktörler için bir hücre yüzeyi reseptörü olarak, esasen monositik soy 17 hücrelerinde aktivasyon ve olgunlaşma süreçlerinde yer alır. Sonuç olarak CD11c.DTR fare modeli, birçok farklı immünolojik soru bağlamında dendritik hücrelerin ve makrofaj alt kümelerinin rolünü incelemek için yoğun bir şekilde kullanılmıştır. Zamanla, sistemik olarak DTX ile tedavi edilen CD11c.DTR farelerinin yan etkiler geliştirebileceği ve yüksek mortalite oranlarını 18 , 19 görüntüleyebildiği bildirildi. Son zamanlarda, bu hayvanlarda intratrakeal DTX uygulaması sonrasında fulminan miyokardit gelişimini tanımlayan temel ölüm nedenini tanımladık. Toksin uyarısı, kalpteki uyarıcı iletim sisteminin merkez kısımları da dahil olmak üzere hücresel yıkıma neden oldu. Buna büyük CD45 eşlik ediyordu+ Lökosit infiltratı, sonuç olarak öldürücü kardiyak aritmilere yol açar. Bu durumda, sadece lökosit popülasyonunun ortaya çıkışı değil, kalpteki mekansal dağılımı da önemli idi. Bu deneysel soru, intravital antikor boyama ve organik solvent bazlı optik temizleme protokolü tarafından desteklenen bir ışık levha mikroskopik yaklaşımla çözülen modern mikroskobik görüntüleme için bir sorundur.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Tüm hayvan deneyleri, AB yönergelerine uygun olarak yürütülmüş ve Essen'deki ilgili yerel makamlar tarafından onaylanmıştır (AZ 84-02.04.2014.A036 - Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz Nordrhein-Westfalen, Essen, Almanya). Hayvanlar spesifik patojen içermeyen (SPF) koşullar altında kullanıldı ve muhafaza edildi.

1. Difteri Tehlikesi (DTX) ile Miyokardit İndüksiyonu

  1. DTX stok solüsyonunu 1 μg / mL çalışma solüsyonuna fosfat tamponlu salin (PBS) ile seyrelterek miyokardın indüksiyonu için DTX solüsyonunu hazırlayın.
  2. Hasenberg ve diğerleri tarafından gösterildiği gibi, bu solüsyondan 100 μL, 8 ila 10 haftalık CD11c.DTR farelerine ( yaklaşık 5 ng / g vücut ağırlığı (bw)) intratrakeal (it) uygulayın . Bir fungal spor süspansiyonunun uygulanması için 20 .
    NOT: Toksin intraperitoneal olarak uygulanması, benzer bir indüksiyon ile sonuçlanabilirÖlümcül miyokardit. Bununla birlikte, bu yaklaşım ilk onaylanmalıdır.
    1. Bunun için hayvanlara 100 mg / kg bw ketamine ve 10 mg / kg bw xylazine'in intraperitoneal (ip) enjeksiyonu ile anestezi uygulanır.
    2. Derin narkoza (toe pinch test) ulaştıktan sonra, ağız boşluğundan 22 G'lik bir ven kateteri kullanarak hayvanları entübe edin. Hayvanları, küçük bir hayvan solunum cihazı ile dakikada 250 solunum ile ve nefes başına 250 μL solunum hacmi havalandırarak, aynı zamanda Hasenberg ve diğerleri tarafından gösterilen lens tüpünün doğru konumlandırılmasını kontrol edin . ark. 20 .
      NOT: Doğru yerleştirildiğinde, hayvanların nefes oranı uygulanan havalandırma ayarlarına göre değişir.
    3. Havalandırma sisteminin bağlantısını kesin ve kateterle akciğere kontrol olarak 100 μL DTX solüsyonu veya eşit miktarda PBS yerleştirin ve hayvanları 1 dakika daha havalandırmaya devam edin.
  3. Hayvanların anesteziden kurtulmasına ve genel sağlık durumunu ve vücut ağırlığını 4 gün boyunca izlemesine izin verin.
    NOT: Genetik zemine, fare suşuna veya başlangıç ​​ağırlığına bağlı olarak, miyokarditin şiddeti ve başlangıcı değişebilir ve önce belirlenmelidir.

2. Light-sheet Microscopy için Örnek Hazırlama

  1. Toksin uygulamasından 4 gün sonra, bir indüksiyon hücresini buharlaşmış% 2 izofluran / oksijen karışımı ile yıkayarak farelere anestezi uygulayın. Retro-yörünge uygulama yolunu kullanarak, intravenöz (iv) 50 ul PBS içerisinde 15 ug doğrudan etiketli bir anti-CD45 antikoru (klon 30-F11, AlexaFluor647 (AF647)) enjekte ederek, Doğru miktarda antikor.
    NOT: İstenen narkoz derinliğine, fareler yatıkken ve parmak ucu testine tepki vermediğinde ulaşılmıştır.
  2. Kuluçka 2 saat sonra, servikal çıkığı veKalpleri, 5 mL PBS / EDTA (5 mM) ile yerinde perfüze edin.
    1. Kalbi ortaya çıkarın ve perfüzyon solüsyonunu 21 G'lik bir kateter kullanarak sağ ventriküle enjekte edin. Yavaþ ve sabit bir basınçla besleyin ve aortayı kesip açtıktan sonra kanın boşaltılabileceğinden emin olun.
      NOT: Bu transkardiyal perfüzyon, organın nihai 3B görselleştirilmesini bozabilecek küçük hazırlık eserleriyle sonuçlanabilir. Bu nedenle, gelişmiş hayvan deneycileri, inferior vena kava yoluyla perfüzyon uygulayarak abdominal aortu çıkarabilir.
  3. Kimyasal fiksasyon için, 5 mL% 4 paraformaldehit (PFA) ile kalbe aynı boşluk boyunca kalp boşaltın. Kateteri yerinde tutun ve basitçe PFA ile doldurulmuş yeni bir şırınga takın. Yavaş ve sabit basınçlı bir gaz.
    NOT: Paraformaldehit oldukça toksiktir; Cilt, gözler ve diğer mukoza ile temasından kaçının.
    1. Tırtıklı forseps ile kalbi hafifçe kavrayın; puBiraz yükselterim; Ve gelen ve giden arterler ve damarlar da dahil olmak üzere tüm doku bağlantılarını keser. Daha fazla fiksasyon için organı% 4'lük bir PFA'da 4 saat daha saklayın.
  4. Organı kurutmak için kalbi, karanlıkta 4 ° C'de 12 saat süreyle% 50,% 70 ve iki kez artan etanol serisinde inkübe edin. Burada, hava kabarcığı oluşumunu önlemek için yavaş dönme hızıyla bir tüp rotatöründe sürekli dönmelerine izin veren siyah 5 mL polipropilen reaksiyon tüplerini kullanın.
  5. Kimyasal temizleme ile komple numune hazırlama. Kalpler şeffaf hale getirmek için, gece boyunca sürekli dönerken% 98 dibenzil eter (DBE) içinde inkübe edin.
    NOT: DBE gözleri, deriyi ve solunum sistemini tahriş eder.

3. Açık levha mikroskopisi

  1. LSFM'yi ışık saçlı mikroskop kullanarak uygulayın (materyal tablosuna bakın). Numuneyi, DBE dolu cu'ya mikroskopun standart numune tutucusuna yerleştirinVette, 30 mm x 30 mm x 15 mm'ye kadar olan numuneler için uygundur.
  2. Kurutulmuş ve temizlenmiş agaroz blokları kullanarak görüntü yakalama işlemi sırasında numuneyi yerine sıkıca tutun.
    1. Agaroz blokları hazırlamak için% 2 eritilmiş agaroz bir kalıba (15 mm x 15 mm x 5 mm) döküldü. Agaroz sertleşene kadar soğumasını bekleyin.
    2. Artan bir etanol serisinde kurutun (% 50,% 70 ve iki kez% 100). Agaroz blokları gece boyunca% 98 DBE'de inkübe edin. Agaroz, kullanılıncaya kadar DBE'de saklayın.
      NOT: Agaroz ağırlıklı olarak sudan oluştuğundan bloğun büyüklüğüne bağlı olarak her dehidrasyon aşamasındaki inkübasyon süreleri uzatılabilir.
      NOT: DBE gözleri, deriyi ve solunum sistemini tahriş eder.
    3. Gerektiğinde, keskin bir neşter kullanarak hazırlanan agaroz bloğu istenilen şekle getirin. Tipik olarak, numune adaptörünün kenarlarına yerleştirilecek prizma veya kama şeklindeki formları kesin.
      NOT: Agaroz bloklar elastik olduğu için,Küçük kuvvetle itildiğinde numune yerinde kalır.
  3. İlgili uyarılma ve emisyon filtresi ayarları ile ilgilenilen floresans sinyallerini (burada, otofloresans ve anti-CD45 antikor boyaması) tespit edin.
    1. Bağ dokusundan elde edilen otofloresans sinyalinin saptanması için, 488 nm'lik uyarım dalga boyunda (OPSL: 50 mW) 525/50 nm band geçiş filtresi kullanın; AF647 ile bağlanmış bir antikor ile CD45 boyaması 668 nm'de (bant geçiren filtre: 680/30 nm) ve 647 nm'lik bir uyarılma dalga boyunda (diyot lazeri: 50 mW) tespit edilmiştir.
    2. İki ayrı z-düzlemi arasındaki mesafe olarak 4 μm'yu seçin.

4. Görüntü Post-processing

NOT: Elde edilen dijital görüntü verileri, bilimsel bir 3B / 4D görüntü işleme ve analiz yazılımı ile daha da işlenmiştir (materyal tablosuna bakınız).

  1. Veri dosyalarının açılması ve ön ayarlanması.
    1. Analiz yazılımını başlattıktan sonra, sol üst köşedeki "Aşmak" düğmesini seçin. Görüntü yığınlarını açmak için "Dosya", "Aç" ı seçin ve ilk edinilen kanaldaki verileri içeren bir klasörü seçin. Edinilen diğer kanalları eklemek için "Düzenle" ve "Kanal Ekle" yi seçin.
      NOT: Veri boyutuna ve bilgisayar sistemine bağlı olarak, bu işlem birkaç dakika alabilir. Sunulan protokol, 2 alım kanalı için tüm aşamaları (otofloresans ve AF647) göstermektedir.
    2. "Düzenle" yi tıklayıp "Görüntü Özellikleri" ni seçerek x, y ve z voksel boyutlarını düzeltin. Yeni pencere açıldığında, parametreleri ayarlayın.
      NOT: Bu adım, kullanılan mikroskop sistemi ve belirli veri formatına bağlıdır. Doğru xyz değerleri daha sonraki boyut ve uzak ölçümler için kritik önem taşır. Çoğu durumda, bu parametreler mikrograf dosyalarında meta veri olarak saklanır. Ancak, eğer dosyaRmat, analiz yazılımı tarafından doğru şekilde yorumlanamaz, piksel boyutunu manuel olarak girmek önemlidir. X ve y boyutlarındaki piksel boyutu kamera piksel boyutuna, potansiyel olarak uygulanan bölme ve objektif ve nesnel büyütmeye bağlıdır. Z'deki piksel boyutu kendi kendini tanımlayan z adım boyutuna eşittir ( örn. 4 μm).
  2. Kanal ayarlamaları
    1. Önce "Görüntü ayarı" nı ("Düzenle" ve "Ekran Ayarı Göster") açarak otofloresans sinyalini gri ölçeğe çevirin. Açılan tüm kanalları ve hepsinin ekran ayarlarını yeni bir pencere listeler; Varsayılan rengini değiştirmek için, otofluoresan kanalı seçin ve "beyaz" görüntü stilini seçin. Başlamak için "tamam" ı tıklayın.
    2. Siyah seviye ayarı için, "Görüntü ayarı" na dönün ve örnek düzeyi temsil etmeyen istenmeyen arka plan sinyallerini hariç tutmak için siyah seviye değerini ayarlayıns.
      1. Bunu yapmak için, kanal çubuğundaki sol üst üçgeni kullanın ve soldan sağa sürükleyin.
        NOT: Değişikliklerin hemen görselleştirilmesi sağlanacaktır. Sadece örnekten türetilmemiş sinyalleri bastırdığınızdan emin olun. Ek hesaplamalar için gürültü sinyalleri gerekebileceğinden zemin-siyah piksellerden kaçınmak için arka plandaki minimum değerler asla "0" olmamalıdır. Tüm siyah seviye değişikliklerinin görüntü elde ettikten sonra gerçekleştirildiğinden emin olun. Aksi takdirde, değerli numune bilgileri kaybolabilir. Siyah seviye ayarlaması sadece temsili amaçlara hizmet eder. Aynı görüntü ayarlarını farklı örneklerde kullanmak için, kanal listesinin altındaki "min" rakamsal alanına kesin değerler girilebilir. Bu, niceliksel analizler için çok yararlıdır.
    3. İlgili kanal yoğunluğunu ayarlamak için sağ üst üçgeni kullanarak veya kanalın altındaki "maksimum" rakamsal alana kesin değerler girerek yoğunluk ayarını yapınBen liste.
    4. Gama değerini artırmak veya azaltmak veya hassas değerleri girmek için kanal çubuğunun ortasındaki alttaki üçgeni sürükleyerek kontrast ayarı yapın.
    5. AF647 kanalını, otofloresans kanalına göre ayarlayın. Bir farklılık olarak, AF647 sinyalinin görselleştirmesini bir ısı haritası renk arama tablosuna ayarlayın. Adım 4.2.1'deki gibi bir yaklaşımla "ateş" kanal modunu seçerek bunu yapın.
      NOT: Genel sinyal yoğunlukları, otofloresan kanala kıyasla önemli ölüde düşük olduğundan, siyah seviyeler genellikle daha düşük değerlere ayarlanır. Otofloresan kanal gelince, bu kanalın parlaklığı genellikle artar.
    6. Doku yapılarını ayrıntılı olarak görselleştirmek için "karışım modu" nu seçin. Aynı parametre değerleriyle bir serideki tüm örnekleri analiz edin.
  3. Sanal kırpma
    1. 3D sahne fuarından önce organı sanal olarak kesmek içinRt, oluşturulan 3D nesneye bir kırpma düzlemi uygulayın.
      1. Nesne listesinde "Kırpma Düzlemi" simgesini (makas) tıklayın. Resim görünümünün içinde sarı bir çerçeve ve bir manipülatör (beyaz işmili) görünecektir. İş milini fare ile inceltici uca döndürün, böylece kırpma düzleminin yönünü değiştirin ve istenen kırpma derinliğini seçmek için iş milinin kalın orta bölümünü hareket ettirin.
      2. Nesne listesinin altında ilgili onay kutularının işaretini kaldırarak çerçeve ve manipülatörü gizleyin ve istediğiniz anlık görüntüleri oluşturun.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Sunulan LSFM yaklaşımı, ciddi miyokarditin indüksiyonu üzerine murin kalplerindeki lökosit dağılımını ve miktarını analiz etmektedir. Şekil 1A , miyokardit indüksiyonu için transjenik CD11c.DTR farelerinin ön tedavi protokolünü açıklamaktadır. Bu aşama miyokarda lökositlerin alınması için gerekli tetikleyiciyi temsil eder. Başarılı bir DTX uygulamasından sonra, hayvanlar genel zayıflık, iştahsızlık ve 2-4 gün aralığında kilo kaybı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Modern yaşam biliminde, biyolojik süreçlerin mikroskopik olarak görselleştirilmesi gittikçe önemli bir rol oynamaktadır. Bu bağlamda, son iki yüzyılda bu noktaya kadar adreslenemeyen sorulara cevap bulmaya yardımcı olan birçok gelişme sağlandı. Birincisi, ışık mikroskoplarının çözünürlük yeteneğini temelde arttırma eğiliminde olmuştur. Yapısal aydınlatma mikroskopisi (SIM) 21 , 22 , stimulated emission-depletion (STED) mikroskopi...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Teşekkürler

Gunzer laboratuarında yapılan araştırmalar Alman Federal Eğitim ve Araştırma Bakanlığı (AD 0315590 no'lu hibe ile) ve Alman Araştırma Vakfı (hibe numarası GU769 / 4-1, GU769 / 4-2) tarafından desteklendi. Teknik destek için IMCES'e, 3D karikatür modellemede yardım için Sebastian Kubat'a da teşekkür ediyoruz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
diphtheria toxinSigma AldrichD0564
phosphate buffered salineBiochromL182-10
ketamine [50 mg/mL]InresaPZN 4089014
xylazine [2 %]Ceva
syringeBraunREF 9161502Braun Omincan F 
indwelt venous catheter Becton DickinsonREF 381923BD Insyte Autoguard
small animal respiratorHarvard Apparatus73-0044MiniVent
anit-CD45 antibody (AF647)BioLegend103124
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) disodium salt dihydrateCarl Roth8043.2
catheter (21 G)BD BiosciencesREF 387455BD valu-set
paraformaldehydeSigma AldrichP6148
PE tube (5 mL)Carl RothEKY9.1Rotilabo
ethanolCarl Roth9065.4
dibenzyl etherSigma-Aldrich108014
tube rotatorMiltenyi Biotec130-090-753MACSmix
agarose (low gelling)Sigma AldrichA4018
mold (15 x 15 x 5 mm)Tissue Tek4566Cryomold 
light sheet microscope systemLaVision BiotecUltramicroscope 
microscope bodyOlympusMVX10 
objectiveOlympus0.5 NA MVPLAPO 2XC, WD 5.5 mm 
sCMOS camera 5.5MPAndor Technology
488 nm OPSL (50mW) laserCoherent
647 nm  diode laser (50mW)Coherent
3D image processing & analysis softwareBitplaneIMARIS Ver. 8.3
transgenic mouse strainSteffen Jung et al.CD11c.DTR
wt mouse strainEnvigoBalb/c Ola Hsd J
Laser ModuleLaVision Biotec
MVPLAPO 2XC Objective Lens

Referanslar

  1. Siedentopf, H., Uber Zsigmondy, R. Sichtbarmachung und Größenbestimmung ultramikoskopischer Teilchen, mit besonderer Anwendung auf Goldrubingläser. Annalen der Physik. 315 (1), 1-39 (1902).
  2. Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. J. Microsc. 170 (Pt 3), 229-236 (1993).
  3. Epp, J. R., et al. Optimization of CLARITY for Clearing Whole-Brain and Other Intact Organs(1,2,3). eNeuro. 2 (3), (2015).
  4. Greger, K., Swoger, J., Stelzer, E. H. Basic building units and properties of a fluorescence single plane illumination microscope. Rev. Sci. Instrum. 78 (2), 023705(2007).
  5. Keller, P. J., Stelzer, E. H. Digital scanned laser light sheet fluorescence microscopy. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (5), pdb top78 (2010).
  6. Becker, K., Jahrling, N., Kramer, E. R., Schnorrer, F., Dodt, H. U. Ultramicroscopy: 3D reconstruction of large microscopical specimens. J Biophotonics. 1 (1), 36-42 (2008).
  7. Dodt, H. U., et al. Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain. Nat. Methods. 4 (4), 331-336 (2007).
  8. Taormina, M. J., et al. Investigating bacterial-animal symbioses with light sheet microscopy. Biol. Bull. 223 (1), 7-20 (2012).
  9. Klingberg, A., et al. Fully Automated Evaluation of Total Glomerular Number and Capillary Tuft Size in Nephritic Kidneys Using Lightsheet Microscopy. J. Am. Soc. Nephrol. , (2016).
  10. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat. Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
  11. Schmid, B., et al. High-speed panoramic light-sheet microscopy reveals global endodermal cell dynamics. Nat Commun. 4, 2207(2013).
  12. Cella Zanacchi, F., et al. Live-cell 3D super-resolution imaging in thick biological samples. Nat. Methods. 8 (12), 1047-1049 (2011).
  13. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162 (2), 246-257 (2015).
  14. Maruyama, A., et al. Wide field intravital imaging by two-photon-excitation digital-scanned light-sheet microscopy (2p-DSLM) with a high-pulse energy laser. Biomed Opt Express. 5 (10), 3311-3325 (2014).
  15. Mann, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. 46 (8), 2028-2042 (2016).
  16. Jung, S., et al. In vivo depletion of CD11c+ dendritic cells abrogates priming of CD8+ T cells by exogenous cell-associated antigens. Immunity. 17 (2), 211-220 (2002).
  17. Corbi, A. L., Lopez-Rodriguez, C. CD11c integrin gene promoter activity during myeloid differentiation. Leuk. Lymphoma. 25 (5-6), 415-425 (1997).
  18. Zaft, T., Sapoznikov, A., Krauthgamer, R., Littman, D. R., Jung, S. CD11chigh dendritic cell ablation impairs lymphopenia-driven proliferation of naive and memory CD8+ T cells. J. Immunol. 175 (10), 6428-6435 (2005).
  19. Zammit, D. J., Cauley, L. S., Pham, Q. M., Lefrancois, L. Dendritic cells maximize the memory CD8 T cell response to infection. Immunity. 22 (5), 561-570 (2005).
  20. Hasenberg, M., Kohler, A., Bonifatius, S., Jeron, A., Gunzer, M. Direct observation of phagocytosis and NET-formation by neutrophils in infected lungs using 2-photon microscopy. J. Vis. Exp. (52), (2011).
  21. Bailey, B., Farkas, D. L., Taylor, D. L., Lanni, F. Enhancement of axial resolution in fluorescence microscopy by standing-wave excitation. Nature. 366 (6450), 44-48 (1993).
  22. Gustafsson, M. G. Surpassing the lateral resolution limit by a factor of two using structured illumination microscopy. J. Microsc. 198 (Pt 2), 82-87 (2000).
  23. Hell, S. W., Wichmann, J. Breaking the diffraction resolution limit by stimulated emission: stimulated-emission-depletion fluorescence microscopy. Opt Lett. 19 (11), 780-782 (1994).
  24. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  25. Hess, S. T., Girirajan, T. P., Mason, M. D. Ultra-high resolution imaging by fluorescence photoactivation localization microscopy. Biophys. J. 91 (11), 4258-4272 (2006).
  26. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nat. Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  27. Abbe, E. Beiträge zur Theorie des Mikroskops und der mikroskopischen Wahrnehmung. Archiv für mikroskopische Anatomie. 9 (1), 413-418 (1873).
  28. Göppert-Mayer, M. Über Elementarakte mit zwei Quantensprüngen. Annalen der Physik. 401 (3), 273-294 (1931).
  29. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  30. Männ, L., et al. CD11c.DTR mice develop a fatal fulminant myocarditis after local or systemic treatment with diphtheria toxin. Eur. J. Immunol. , in press (2016).
  31. Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat. Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  32. Erturk, A., et al. Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO. Nat. Protoc. 7 (11), 1983-1995 (2012).
  33. Dirckx, J. J., Kuypers, L. C., Decraemer, W. F. Refractive index of tissue measured with confocal microscopy. J Biomed Opt. 10 (4), 44014(2005).
  34. Chung, K., et al. Structural and molecular interrogation of intact biological systems. Nature. 497 (7449), 332-337 (2013).
  35. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat. Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  36. Schwarz, M. K., et al. Fluorescent-protein stabilization and high-resolution imaging of cleared, intact mouse brains. PLoS One. 10 (5), e0124650(2015).
  37. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat. Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  38. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  39. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  40. Shivapathasundharam, B., Berti, A. E. Transparent tooth model system. An aid in the study of root canal anatomy. Indian J. Dent. Res. 11 (3), 89-94 (2000).
  41. Karreman, M. A., et al. Fast and precise targeting of single tumor cells in vivo by multimodal correlative microscopy. J. Cell Sci. 129 (2), 444-456 (2016).
  42. Pan, C., et al. Shrinkage-mediated imaging of entire organs and organisms using uDISCO. Nat. Methods. 13 (10), 859-867 (2016).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

T pSay 123k sa l mikroskopimiyokarditt m r mikroskopisikimyasal temizlemeAntikor boyamaCD11c DTRsteril inflamasyon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır