ביטוי חלבון רקומביננטי, התגבשות, מחקרים ביופיסיקליים של א<em&gt; Bacillus</em&gt; -שמר Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Summary

Bacillus anthracis הוא הפתוגן המחייב של אנתרקס משאיפת קטלני, ולכן מחקרים על הגנים והחלבונים שלהם מוסדרים בקפידה. גישה חלופית היא ללמוד גנים אורתולוגיים. אנו מתארים מחקרים biophysicochemical של B. אנתרקיס אורת'ולוג ב B. cereus , bc1531, הדורש ציוד ניסיוני מינימלי וחסרים בעיות בטיחות חמורות.

Abstract

כדי להתגבר על הגבלות בטיחות ותקנות בעת לימוד גנים וחלבונים מפני פתוגנים אמיתיים, הומולוגים שלהם ניתן ללמוד. Bacillus anthracis הוא פתוגן מחייב שגורם לאנתרקס שאיפה קטלני. Bacillus cereus נחשב מודל שימושי ללימוד ב 'אנתרקיס בשל הקשר האבולוציוני הקרוב שלה. אשכול הגנים ba1554 - ba1558 של B. anthracis נשמר מאוד עם אשכול bc1531 - bc1535 ב- B. cereus , וכן עם bt1364-bt1368 באשכול ב- Bacillus thuringiensis, המציין את התפקיד הקריטי של הגנים המשויכים לסוג Bacillus . כתב היד מתאר שיטות להכנת ואפיון של מוצר חלבון של הגן הראשון ( ba1554 ) מקבוצת גנים ב B. anthracis באמצעות חלבון רקומביננטי של אורתולוג ב B. cereus , bc1531.

Introduction

ביטוי חלבון רקומביננטי נעשה שימוש נרחב כדי להתגבר על בעיות הקשורות מקורות חלבון טבעי, כגון כמויות חלבון מוגבל זיהום מזיק. יתר על כן, במחקרים על גנים וחלבונים פתוגניים, ניתן לנצל זן מעבדה חלופי שאינו דורש אמצעי בטיחות נוספים. לדוגמה, Bacillus cereus הוא מודל שימושי לחקר Bacillus anthracis בשל הקשר האבולוציוני הקרוב שלהם ¹ .

B. anthracis הוא פתוגן מחייב שגורם לאנתרקס משאיפה קטלנית בבני אדם ובעלי חיים, והוא עשוי לשמש כ bioweapon ² . לפיכך, מחקרים מעבדה על B. anthracis מוסדרים בקפדנות על ידי המרכזים האמריקאים לבקרת מחלות, המחייבים פרקטיקות של רמה 3 (BSL-3) של בטיחות ביולוגית, אשר קובעות כי אזור המעבדה יופרד עם לחץ שלילי בחדר. בניגוד ל- B. anthracis , B. cereus מסווג כסוכן BSL-1 ולכן יש חששות בטיחות מינימליים. B. cereus הוא פתוגן אופורטוניסטי אשר, עם זיהום, גורם הרעלת מזון שניתן לטפל ללא סיוע רפואי. עם זאת, מכיוון שב 'cereus חולק גנים קריטיים רבים עם B. anthracis , ניתן לבדוק את הפונקציות של חלבונים אנתראקיס באמצעות ההומולוגים המתאימים של B. cereus ¹ .

Ba1554 - ba1558 אשכול גנים של B. anthracis הוא שמר מאוד עם bc1531 - bc1535 אשכול של B. cereus , וכן עם bt1364-bt1368 אשכול של Bacillus thuringiensis , במונחים של ארגון גנים ורצף. יתר על כן, הגנים הראשונים ( ba1554 , bc1531 , bt1364 ) של אשכולות בהתאמה משומרים לחלוטין ( כלומר, 100% רצף נוקלאוטיד זהות), implyiNg תפקיד קריטי של המוצר הגן במינים Bacillus . בשל מיקומה של אשכולות גנים אלה, ba1554 זוהה בטעות כווסת שעתוק משוער ³ . עם זאת, רצף חומצות אמינו ניתוח של המוצר ba1554 מציין כי היא שייכת למשפחת MazG, אשר יש פעילות pyrophosphohydrolase נוקלאוטיד אינו קשור עם גורם שעתוק פעילות ^{4 , 5} . למרות חלבונים השייכים למשפחת MazG הם מגוונים ביחס לרצף הכולל אורך, הם חולקים משותף ~ 100-שאריות MazG תחום מאופיין EXXE _12-28 EXXD מוטיב ("X" מייצג שאריות חומצות אמינו, ומספר מציין את מספר שאריות X).

תחום ה- MazG לא תמיד מייצג באופן ישיר פעילות קטליטית מסוימת. חבר MazG מ Escherichia coli (EcMazG) בעל שני תחומים MazG, אבל בLy מסוף C- תחום MazG הוא פעיל enzymatically ⁶ . יתר על כן, הספציפי המצע של אנזימים MazG משתנה מ nonphoside nucleoside שאינם ספציפיים (עבור EcMazG) ספציפיים dCTP / dATP (עבור integrin הקשורים מזג) ו DUTP (עבור dUTPases) ^{6 , 7 , 8 , 9} . לכן, מנתח biophysicochemical של החלב BA1554 יש צורך לאשר פעילות NTPase שלה לפענח את הספציפיות המצע שלה.

כאן, אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד כי מעבדות ביותר ללא מתקן BSL-3 יכול לעקוב כדי לאפיין את המוצר חלבון של הגן bc1531 B. cereus , שהוא אורתולוג של B. anthracis ba1554 , ברמה המולקולרית. בקצרה, רקומביננטי BC1531 (rBC1531) התבטא ב coli ו מטוהרים באמצעות תג זיקה. עבור ניסויים קריסטלוגרפיים רנטגן, קריסטליZation התנאים של חלבון rBC1531 הוקרנו אופטימיזציה. כדי להעריך את הפעילות האנזימטית של rBC1531, פעילות NTPase היה פיקוח colorimetrically כדי למנוע רדיואקטיבי שכותרתו נוקליאוטידים כי כבר בשימוש מקובל. לבסוף, ניתוחים של הנתונים biophysicochemical שהושגו אפשרה לנו לקבוע את המדינה oligomerization ופרמטרים קטליטי של rBC1531, כמו גם להשיג נתונים עקיפה רנטגן מן גביש rBC1531.

Protocol

1. Recombinant חלבון ייצור וטיהור של rBC1531

1. הכנת חלבון BC1531 רקומביננטי (rBC1531) - ביטוי פלסמיד
   1. הכינו DNA גנומי של B. cereus ¹⁰ .
   2. להגביר את הגן bc1531 מתבנית של ד chenus גנומי על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR), באמצעות פריימרים קדימה ויופעת (ראה את רשימת החומרים) כדי ליצור BAM HI ו סאל אני הגבלת אתרי אנזים, בהתאמה ¹⁰ .
   3. לעכל את המוצר PCR ו שונה וקטור pET49b (pET49bm) באמצעות BAM HI ו Sal I, כמתואר ¹¹ .
   4. מערבבים את המוצר PCR מעוכל וקטור (יחס 3: 1) משלב 1.1.3 באמצעות ליגז T4 DNA בתגובה 10 μL, כמתואר ¹¹ . לדגור על 18 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
   5. פיפטה 3 μL של התגובה קשירת לתוך 50 μL של chemicaLly המוסמכת E. coli DH5α תאים בצינור. מערבבים בעדינות על ידי pipetting מעלה ומטה ומניחים על קרח במשך 30 דקות. הלם חום עבור 45 s ב 42 ° C. הוסף 1 מ"ל של Luria-Bertani (LB) בינוני לגדל את התאים תוך רועד במרץ (250 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס, 45 דקות).
   6. קח 100 μL של תאים שהשתנו משלב 1.1.6 ולהפיץ אותם על צלחות LB אגר עם 100 מיקרוגרם / קנמיצין מ"ל (קאן). לדגור על ~ 18 שעות ב 37 ° C.
   7. בחר מושבות באמצעות טיפ סטרילי לגדול התאים 3 מ"ל של מדיום LB עם 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​קן; לנער במרץ (250 סל"ד, 37 מעלות צלזיוס, 18 שעות).
   8. הכן DNA פלסמיד באמצעות שיטה ליקוי SDS אלקליין, כמתואר ¹⁰ .
   9. אישור רצף נוקליאוטידים של ביטוי rBC1531-ביטוי באמצעות רצף DNA ¹² .
2. Overexpression של חלבון rBC1531
   1. Re- להפוך את coli BL21 (DE3) זן עם rBC1531-expRession פלסמיד, כמתואר צעדים 1.1.5-1.1.6, עבור overexpression.
   2. בחר מושבה לגדל אותו 10 מ"ל של LB בינוני המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל ​​קן (LB + קאן); לנער במרץ 18 שעות על 37 מעלות צלזיוס.
   3. לחסן 10 מ"ל של תרבות לילה ב 1 L של LB + קאן בינוני לגדול ב 37 ° C עד OD ₆₀₀ (צפיפות אופטית ב 600 ננומטר) מגיע ~ 0.7.
   4. לצלול את התרבות במים קרים כקרח במשך 15 דקות ~ כדי לקרר את הטמפרטורה ל 18 מעלות צלזיוס ולהוסיף isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) לתרבות בריכוז סופי של 1 מ"מ על ביטוי חלבון רקומביננטי. לגדל את התרבות ב 18 מעלות צלזיוס עבור ~ ~ 18-18 נוספים.
3. טיהור של rBC1531
   1. קציר התאים על ידי צנטריפוגה (5,000 xg, 4 ° C, 30 דקות). מחק את supernatant בזהירות כדי לא להפריע לתאים. Re- להשעות את התאים 50 מ"ל של פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) פתרון המכיל 10 imidazole מ"מ.
   2. Lyse התאים פעמיים על ידי sonication על הקרח כדי למנוע את חימום יתר של lysates התא (זמן: 2 דקות 30 S, מחזור על: 5 S, מחזור הנחה: 10 S, משרעת: 38%).
   3. נקה לייסט התא על ידי צנטריפוגה (~ 25,000 XG, 4 ° C, 30 דקות).
   4. מערבבים 3 מ"ל של חרוזים ניקל 60 מ"ל של PBS המכיל 10 מ"מ imidazole וכוח הכבידה חיץ נוסף ליישב את חרוזי ניקל equilibrated ב 2.5 x 10 ס"מ טור כרומטוגרפיה זכוכית.
   5. פיפטה כדי להעביר את supernatant מ צעד 1.3.3 לעמוד עם חרוזי ניקל מראש equilibrated ו דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 2 שעות על גלגל מסתובב במהירות נמוכה (~ 20 סל"ד).
   6. אפשר supernatant לניקוז על ידי כוח הכבידה ולשטוף את חרוזי ניקל בעמודה שלוש פעמים עם 100 מ"ל של PBS המכיל 10 imidazole מ"מ.
   7. חלבון RBC1531 Elute על ידי החלת 4 x 5 מ"ל של PBS המכיל 250 מ"מ imidazole.
   8. קח 15 μL של elution מ צעד 1.3.7 ולהפעיל אותו על 15% SDS-PAGE. לדמיין את להקות חלבון בהג'ל באמצעות מכתים כחול קומסי ¹⁰ .
4. הסרת תגי הזיקה של חלבון rBC1531 על ידי פרוטאוליזה thrombin
   1. פיפטה שברים צינור דיאליזה (משקל מולקולרי לחתוך: 3 kDa) ומניחים את הצינור בכוס המכיל 4 L של חיץ תואמת thrombin cleavage (20 מ"מ HEPES, pH 7.4, 150 מ"מ NaCl, ו 1.5 מ"מ β-mercaptoethanol) ב 4 ° C במשך הלילה.
   2. פיפטה את השברים ולהעביר אותם צינור חרוטי.
   3. למדוד את ספיגת ב 280 ננומטר ולהעריך את ריכוז החלבון rBC1531, כמתואר ¹³ .
   4. קח 50 מיקרוגרם של rBC1531 בצינור 0.5 מ"ל ולהוסיף כמויות שונות של thrombin ( כלומר, 2, 1, 0.6, ו 0.3 יחידות). דגירה של תגובות rBC1531 ו thrombin ב 20 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות כדי לקבוע את הכמות המינימלית של thrombin נדרש לדבוק תג זיקה N- מסוף.
   5. הפעל את rBC1531 ותגובות טרומבין על 15%SDS-PAGE ולקבוע את הכמות הנמוכה ביותר של thrombin ( למשל, 0.3 יחידות של תרומבין לכל 50 מיקרוגרם של rBC1531) כי מעכל לחלוטין את תג זיקה N- מסוף לייצר RBC1531 ללא תג.
   6. הוסף 10 מ"ג של חלבון rBC1531 ו 60 יחידות של טרומבין לצינור 15 מ"ל ו דגירה על 20 מעלות צלזיוס למשך 3 ~ שעה לתגובה thrombin- proteolysis.
   7. החלת תקני סינון ג'ל על עמודה בגודל כרומטוגרפיה (SEC) כדי להכין עקומה סטנדרטית של משקולות מולקולריות וכרכים elution, כמתואר ¹³ .
   8. מניחים את החלבון rBC1531 מתעכל thrombin משלב 1.4.6 בצינור צנטריפוגלי מסנן (משקל מולקולרי לחתוך: 3 kDa) ו צנטריפוגות ב 3000 גרם ב 4 ° C כדי לצמצם נפח של פחות מ 5 מ"ל.
   9. החל את חלבון rBC1531 מרוכזים בעמודה SEC ולאסוף 60 שברים eluted ב 0.5 מ"ל לכל צינור ¹³ .
   10. קח 15 μL של כל חלק, להפעיל אותם על SDS-PAGE 15%, ו staiN ג 'ל באמצעות תמיסת מכתים קומאסי (0.15% (w / v) קומאסי כחול מבריק, 40% (v / v) מתנול, ו 10% (v / v) חומצה אצטית קרחוני) כמתואר ¹⁰ .
   11. פיפטה שברים המכילים rBC1531 ולאסוף אותם בצינור אחד.

2. התגבשות הקרנה ואופטימיזציה של rBC1531

1. תנאי הקרנה עבור התגבשות חלבון rBC1531
   1. לרכז את rBC1531 משלב 1.4.11 עד ~ 18.5 מ"ג / מ"ל ​​באמצעות צינור מסנן צנטריפוגלי, כמתואר בשלב 1.4.8.
   2. הוסף 50 μL של פתרון התגבשות כל התגבשות (ראה סעיף 2.2) ¹⁴ בארות של 96-היטב יושב טיפות התגבשות. מקום 0.5 μL של 18.5 מ"ג / מ"ל ​​פתרון חלבון rBC1531 על מיטת ישיבה. מערבבים את פתרון החלבון עם 0.5 μL של פתרון טוב, חוזר על התהליך עבור הצלחת כולה.
   3. מכסים את הצלחת עם סרט דבק ברור.מניחים את צלחות 96 גם על 18 מעלות צלזיוס ולאפשר דיפוזיה אדי.
   4. סרוק את הטיפות בהגדלה 20-40X באמצעות מיקרוסקופ אור כדי לפקח על היווצרות קריסטל מדי יום במשך 2-3 שבועות.
   5. איסוף נתונים עקיפה רנטגן ¹² באמצעות גבישים חלבון rBC1531 שהתקבלו.
2. אופטימיזציה של התנאים rBC1531 התגבשות
   1. הכן 500 μL של הפתרון התגבשות הראשונית שנבחרה במצב ( למשל, 0.1 C נתרן Cacodylate, pH 6.5 ו 1.0 M ציטרט ציטראט) ולמלא צלחת התגבשות 24 גם לירידה טיפה.
   2. הוסף 0.5 μL של 18.5 מ"ג / מ"ל ​​פתרון חלבון rBC1531 למיטה יושבת, לערבב עם 0.5 μL של פתרון טוב, לכסות את הצלחת מיד עם סרט דבק ברור. מניחים את הצלחת על 18 מעלות צלזיוס.
   3. לצפות צמיחה גביש תחת מיקרוסקופ אור במשך שבוע.
   4. לייעל את התנאים התגבשות שונים על ידי שינוי ה- pH ( כלומר., PH 5.5-6.8) של 0.1 m cacodylate ו על ידי שינוי ריכוז המלח ( כלומר, 0.9-1.2 M) של ציטרט נתרן כדי להשיג גבישים בודדים. צג הצמיחה גביש ~ 1 בשבוע ולאסוף נתונים עקיפה X- רנטגן ¹² .

3. אפיון של Triphosphatase Nucleoside (NTPase) פעילות של rBC1531

1. ואלידציה של מחקר קולורימטרי המבוסס על פוספט אי-אורגני
   1. הכן מלאי של pyrophosphate (100 מ"מ) ו לדלל אותו לריכוז הסופי של 0.1, 0.25, 0.5, 1.0, 5.0, 10, 50, 100, ו 250 מיקרומטר μL 200 של חיץ התגובה (20 מ"מ HEPES, pH 7.4; 150 MM NaCl, ו 2 מ"מ MgCl ₂ ) לשכפל 96 צלחות היטב. השתמש בצלחת הראשונה כביקורת (זה אינו מכיל pyrophosphatase). ודא כי הצלחת השנייה מכילה pyrophosphatase כצלחת עובד, בהתאם להוראות בשלב 3.1.2.
   2. הוסף 0.01 יחידה של Saccharomyces cerevisiae p אורגנייםYrophosphatase (1 μL) על הבארות של צלחת עובד ו דגירה על 20 מעלות צלזיוס למשך 30-60 דקות.
   3. הכן תמיסת חומצה molybdate על ידי ערבוב molybdate אמוניום (0.86% v / v) ו חומצה אסקורבית (14% v / v) פתרונות ביחס של 7: 3. הוסף 16 μL של תמיסת חומצה מוליבדט לשני בארות עבודה ובקרה לחכות 15 דקות.
   4. קרא את הצפיפות האופטית ב 690 ננומטר (OD _690nm ).
2. Assay NTPase
   1. הכנת מלאי של 100 מ"מ nucleoside triphosphate (NTP) המצע לדלל את הריכוז הרצוי ( למשל, 0, 0.2, 4.4, 11, 22, 44, 88, או 132 מיקרומטר) ב μL 180 של חיץ assay (20 מ"מ HEPES, PH 7.4, 150 מ"מ NaCl, ו 2 מ"מ MgCl ₂ ).
   2. הוסף 20 מיקרוגרם של rBC1531 (1.5 מ"מ) ואת מצעים NTP מ 3.2.1 עד 200 μL לכל תגובה צלחת 96-היטב פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב היטב. מכסים את הצלחת עם המכסה ומניחים אותו 37 ° C חממה למשך 30 דקותכדי לבצע את התגובה המצע הידרוליזה.
   3. מעבירים את הצלחת לאמבט מים 70 מעלות צלזיוס ומאפשרים לעמוד במשך 15 דקות כדי לעצור את תגובות rBC1531 בתיווך קטליטי.
   4. הוסף 0.01 יחידה של S. cerevisiae pyrophosphatase אנאורגני (1 μL) היטב כל צלחת התגובה (מ 3.2.3 צעד) ו דגירה על 20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הוסף 16 μL של תמיסת חומצה מוליבדט לצלחת תגובה לפתח את הצבע (~ 15 דקות). קרא ב OD _690nm .
   5. ניתוח באמצעות משוואת Michaelis-Menten, כמתואר ¹² .

תוצאות

אפיון של חלבון העניין במחקר זה החל על ידי הכנת כמות מספקת של רקומביננטי B. B. creus bc1531 (rBC1531) חלבון, רצוי יותר ממספר מיליגרם. קטע ה- DNA המקודד את החלבון BC1531 הוכן על ידי PCR באמצעות הדנ"א הגנומי של B. cereus כתבנית, שכן הוא מכיל גנים אורתולוגים זהים ba...

Discussion

Studies of true pathogens are limited due to safety restrictions and regulations. Alternatively, pathogens can be studied using evolutionarily related non-pathogens or less pathogenic species. The ba1554 gene is considered a critical gene in B. anthracis. Fortunately, an identical gene is present in nonclinical B. cereus. Thus, without serious safety concerns, recombinant BC1531 protein can be used for biophysical and enzymatic characterization. Here, we described detailed procedures, moving fr...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacillus cereus ATCC14579	Korean Collection for Tissue Culture	3624
Genomic DNA prep kit	GeneAll	106-101	Genomic DNA preparation
Forward primer	Macrogen	GAAGGATCCGGAAGCAAAAA CGATGAAAGATATGCA	BamHI site is underlined
Reverse primer	Macrogen	CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT CCCTCATCAATACGTG	SalI site is underlined
nPfu-Forte	Enzynomics	P410	PCR polymerase
BamHI	Enzynomics	R003S
SalI	Enzynomics	R009S
pET49b expression vector	Novagen	71463	Expression vector was modified to add affinity tags and BamHI/SalI sites10
T4 DNA ligase	Enzynomics	M001S
Dialysis memebrane	Thermofisher	18265017
Dry block heater	JSR	JSBL-02T
LB broth (Luria-Bertani)	LPS solution	LB-05
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)	Becton, Dickinson and Company
Kanamycin	LPS solution	KAN025
Mini-prep kit	Favorgen	FAPDE300	Plasmid DNA preparation
BL21(DE3) Competent cell	Novagen	69450-3CN
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Fisher BioReagents	50-213-378
Sodium chloride	Daejung	7548-4100	PBS material
Potassium chloride	Daejung	6566-4405	PBS material
Potassium phosphate	Bio Basic Inc	PB0445	PBS material
Sodium phosphate	Bio Basic Inc	S0404	PBS material
Imidazole	Bio Basic Inc	IB0277
Sonicator	Sonics	VCX 130
Ni-NTA agaros	Qiagen	30210	Nickel bead
Rotator	Finepcr	AG
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-rad	1610374	SDS-PAGE protein standard
Coonmassie Brilliant Blue R-250	Fisher BioReagents	BP101-25	Coomassie staining solution
Methyl alcohol	Samchun chemical	M0585	Coomassie staining solution
Acetic acid	Daejung	1002-4105	Coomassie staining solution
Dialysis memebrane	Thermofisher	68035
2-Mercaptoethanol	Sigma-aldrich	M6250
Thrombin	Merckmillipore	605157-1KUCN	Prepare aliquots of 20 μl (1 Unit per μl) and store at 70 °C and thaw before use
Superdex 200 16/600	General Electric	28989335	Size exclusion chromatography
Gel filtration standard	Bio-rad	151-1901
Centrifugal filter	Amicon	UFC800396
Crystralization plates	Hampton research	HR3-083	96-well sitting drop plate
The JCSG core suite I-IV	Qiagen	130924-130927	Crystallization secreening solution
Microscope	Nikon	SMZ745T
Cryschem plates	Hampton research	HR3-158	24-well sitting drop plate
Inorganic pyrophosphatase	Sigma	10108987001
Ammonium molybdate solution	Sigma	13106-76-8
L-ascorbic acid	Sigma	50-81-7
NTP substrate	Startagene	200415-51
Spectrophotometer	Biotek	SynergyH1	microplate reader
GraphPad Prism 5	GraphPad	Prism 5 for Window