Expressão de Proteína Recombinante, Cristalização e Estudos Biofísicos de<em&gt; Bacillus</em&gt; -conservado Nucleotide Pyrophosphorylase, BcMazG

Resumo

Bacillus anthracis é o agente patogénico obrigatório do antraz mortal por inalação, pelo que os estudos dos seus genes e proteínas são rigorosamente regulados. Uma abordagem alternativa é estudar genes ortólogos. Descrevemos estudos biofísico-químicos de um ortólogo de B. anthracis em B. cereus , bc1531, requerendo equipamento experimental mínimo e sem preocupações de segurança graves.

Resumo

Para superar as restrições e regulamentações de segurança ao estudar genes e proteínas de patógenos verdadeiros, seus homólogos podem ser estudados. Bacillus anthracis é um agente patogénico obrigatório que provoca o antraz mortal por inalação. Bacillus cereus é considerado um modelo útil para estudar B. anthracis devido à sua estreita relação evolutiva. O grupo de genes ba1554 - ba1558 de B. anthracis é altamente conservado com o cluster bc1531 - bc1535 em B. cereus , bem como com o cluster bt1364 - bt1368 em Bacillus thuringiensis, indicando o papel crítico dos genes associados no gênero Bacillus . Este manuscrito descreve métodos para preparar e caracterizar um produto proteico do primeiro gene ( ba1554 ) do grupo genético em B. anthracis usando uma proteína recombinante de seu ortholog em B. cereus , bc1531.

Introdução

A expressão de proteína recombinante é amplamente utilizada para superar problemas associados a fontes de proteína naturais, tais como quantidades limitadas de proteínas e contaminação prejudicial. Além disso, nos estudos de genes patogénicos e proteínas, uma estirpe laboratorial alternativa que não requer precauções adicionais de segurança pode ser utilizada. Por exemplo, Bacillus cereus é um modelo útil para estudar Bacillus anthracis devido à sua estreita relação evolutiva ¹ .

B. anthracis é um agente patogénico obrigatório que provoca o antraz mortal por inalação em seres humanos e gado e pode potencialmente ser utilizado como arma biológica ² . Assim, os estudos laboratoriais sobre B. anthracis são rigorosamente regulados pelos Centros de Controle de Doenças dos Estados Unidos, exigindo práticas de nível 3 de biossegurança (BSL-3), que determinam que a área do laboratório seja segregada com pressão negativa. Em contraste com B. anthracis , B. cereus é categorizado como um agente BSL-1 e, portanto, tem preocupações mínimas de segurança. B. cereus é um patógeno oportunista que, após a infecção, provoca intoxicação alimentar que pode ser tratada sem assistência médica. No entanto, uma vez que B. cereus partilha muitos genes críticos com B. anthracis , as funções das proteínas de B. anthracis podem ser estudadas utilizando os correspondentes homólogos de B. cereus ¹ .

O agrupamento de genes ba1554 - ba1558 de B. anthracis é altamente conservado com o agrupamento bc1531 - bc1535 De B. cereus , bem como com o grupo bt1364-bt1368 de Bacillus thuringiensis , em termos de organização e sequência de genes. Além disso, os primeiros genes ( ba1554 , bc1531 e bt1364 ) dos respectivos clusters são absolutamente conservados ( isto é, 100% de identidade de sequência de nucleótidos), implyiUm papel crítico do produto gênico nas espécies de Bacillus . Devido à sua localização nestes agrupamentos de genes, ba1554 foi mal identificado como um suposto transcrição regulador [ ^3] . No entanto, a análise da sequência de aminoácidos do produto ba1554 indica que pertence à família MazG, que tem actividade de nucleótido pirofosfoidrolase e não está associada à actividade do factor de transcrição ^{4 , 5} . Embora as proteínas pertencentes à família MazG sejam diversas em relação à sequência e ao comprimento globais, partilham um domínio MazG comum de ~ 100 resíduos caracterizado por um motivo EXXE 12-28 EXXD ("X" significa qualquer resíduo de aminoácido e o número Indica o número de resíduos X).

O domínio MazG nem sempre representa diretamente uma determinada atividade catalítica. Um membro MazG de Escherichia coli (EcMazG) possui dois domínios MazG, mas emO domínio MazG C-terminal é enzimaticamente activo ⁶ . Além disso, a especificidade do substrato de enzimas MazG varia de nucleosídeos trifosfatos não específicos (para EcMazG) para dCTP / dATP específicos (para integrados MazG) e dUTP (para dUTPases) ^{6 , 7 , 8 , 9} . Por conseguinte, são necessárias análises biofísicoquímicas da proteína BA1554 para confirmar a sua actividade NTPase e para decifrar a sua especificidade de substrato.

Aqui, fornecemos um protocolo passo a passo que a maioria dos laboratórios sem uma instalação BSL-3 pode seguir para caracterizar o produto proteico do gene B. cereus bc1531 , que é um ortholog de B. anthracis ba1554 , a nível molecular. Resumidamente, BC1531 recombinante (rBC1531) foi expresso em E. coli e purificado utilizando um marcador de afinidade. Para experimentos cristalográficos de raios X,Zação da proteína rBC1531 foram selecionadas e otimizadas. Para avaliar a actividade enzimática de rBC1531, a actividade de NTPase foi monitorizada colorimetricamente para evitar nucleótidos marcados radioactivamente que foram convencionalmente utilizados. Finalmente, as análises dos dados biofísico-químicos obtidos nos permitiram determinar o estado de oligomerização e os parâmetros catalíticos de rBC1531, bem como obter dados de difração de raios X a partir do cristal rBC1531.

Protocolo

1. Produção e Purificação de Proteína Recombinante de rBC1531

1. Prepara�o de um plasm�eo de express� da prote�a BC1531 recombinante (rBC1531)
   1. Preparar DNA genômico de B. cereus ¹⁰ .
   2. Amplificar o gene bc1531 a partir de um molde de ADN genómico de B. cereus por reacção em cadeia com polimerase (PCR), utilizando iniciadores directos e inversos (ver a Lista de Materiais) para criar locais de enzimas de restrição Bam HI e Sal I, respectivamente ¹⁰ .
   3. Digerir o produto de PCR e um vector pET49b modificado (pET49bm) utilizando Bam HI e Sal I, como descrito ¹¹ .
   4. Mistura-se o produto de PCR digerido e o vector (razão 3: 1) do passo 1.1.3 utilizando ADN-ligase de T4 numa reacção de 10 μL, tal como descrito ¹¹ . Incubar a 18 ° C durante 30 min.
   5. Pipetar 3 μL da reação de ligação em 50 μL deLmente células E. coli DH5α competentes num tubo. Misture suavemente pipetando para cima e para baixo e coloque em gelo por 30 min. Choque térmico durante 45 s a 42 ° C. Adicionar 1 mL de meio Luria-Bertani (LB) e crescer as células enquanto agita vigorosamente (250 rpm, 37 ° C, 45 min).
   6. Tomar 100 μL das células transformadas do passo 1.1.6 e espalhá-las sobre as placas LB-agar com 100 μg / mL de canamicina (Kan). Incubar durante ~ 18 h a 37 ° C.
   7. Escolher as col�ias utilizando uma ponta est�il e cultivar as c�ulas em 3 mL de meio LB com 100 � / mL de Kan; Agitar vigorosamente (250 rpm, 37 ° C, 18 h).
   8. Preparar o ADN plasmídico utilizando um método de lise alcalino-SDS, como descrito ¹⁰ .
   9. Confirmar a sequência nucleotídica da construção da expressão de rBC1531 utilizando sequenciação de ADN ¹² .
2. A sobre-expressão da proteína rBC1531
   1. Re-transformar a estirpe E. coli BL21 (DE3) com rBC1531-expPlasm�eo de ress�io, tal como descrito nos passos 1.1.5-1.1.6, para sobre-express�.
   2. Selecione uma colônia e cresça em 10 mL de meio LB contendo 50 μg / mL de Kan (LB + Kan); Agitar vigorosamente durante 18 h a 37 ° C.
   3. Inocular 10 mL de cultura durante a noite em 1 L de meio LB + Kan e crescer a 37 ° C até a DO ₆₀₀ (densidade óptica a 600 nm) atingir ~ 0,7.
   4. Submergir a cultura em água gelada durante ~ 15 min para arrefecer a temperatura para 18 ° C e adicionar isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) à cultura a uma concentração final de 1 mM para a expressão da proteína recombinante. Cultivar a cultura a 18 ° C durante um período adicional de ~ 16-18 h.
3. Purificação de rBC1531
   1. Colher as células por centrifugação (5.000 xg, 4 ° C, 30 min). Descartar o sobrenadante com cuidado para não perturbar as células. Re-suspender as células em 50 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) contendo imidazole 10 mM.
   2. Lyse as células duas vezes por sonicação em gelo para evitar o excesso de aquecimento dos lisados ​​celulares (tempo: 2 min 30 s, ciclo em: 5 s, ciclo off: 10 s, amplitude: 38%).
   3. Limpar o lisado celular por centrifugação (~ 25 000 xg, 4 ° C, 30 min).
   4. Misture 3 mL de esferas de níquel e 60 mL de PBS contendo imidazole 10 mM e extraia o tampão extra para depositar as esferas de níquel equilibradas numa coluna de cromatografia de vidro 2,5 x 10 cm.
   5. Pipetar para transferir o sobrenadante do passo 1.3.3 para a coluna com esferas de níquel pré-equilibradas e incubar a 4 ° C durante 2 h num rolo de fiar a uma velocidade baixa (~ 20 rpm).
   6. Deixar o sobrenadante drenar por gravidade e lavar as esferas de níquel na coluna três vezes com 100 mL de PBS contendo imidazole 10 mM.
   7. Eluir a proteína rBC1531 aplicando 4 x 5 mL de PBS contendo imidazole 250 mM.
   8. Tomar 15 μL da eluição do passo 1.3.7 e executá-la em SDS-PAGE a 15%. Visualize as bandas de proteínasO gel usando colora�o azul de Coomassie ¹⁰ .
4. A remoção dos marcadores de afinidade da proteína rBC1531 por proteólise de trombina
   1. Pipetar as fracções em tubo de diálise (peso molecular cortado: 3 kDa) e colocar o tubo num copo contendo 4 L de tampão compatível com a clivagem da trombina (HEPES 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM e P-mercaptoetanol 1,5 mM) A 4 ° C durante a noite.
   2. Pipetar as frações e transferi-los para um tubo cônico.
   3. Medir a absorvância a 280 nm e estimar a concentração de proteína rBC1531, conforme descrito ¹³ .
   4. Tomar 50 μg de rBC1531 num tubo de 0,5 ml e adicionar várias quantidades de trombina ( ie, 2, 1, 0,6 e 0,3 unidades). Incubar as reacções rBC1531 e trombina a 20 ° C durante ~ 3 h para determinar a menor quantidade de trombina necessária para clivar o marcador de afinidade N-terminal.
   5. Executar o rBC1531 e reações de trombina em um 15%SDS-PAGE e determinam a quantidade mais baixa de trombina ( por exemplo, 0,3 unidades de trombina por 50 μg de rBC1531) que digerem completamente o marcador de afinidade N-terminal e produzem um rBC1531 livre de marcadores.
   6. Adicionar 10 mg de proteína rBC1531 e 60 unidades de trombina a um tubo de 15 mL e incubar a 20 ° C durante ~ 3 h para a reacção de proteólise de trombina.
   7. Aplicar padrões de filtração de gel a uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) para preparar uma curva padrão de pesos moleculares e volumes de eluição, conforme descrito ¹³ .
   8. Colocar a proteína rBC1531 digerida com trombina do passo 1.4.6 num tubo de filtro centrífugo (peso molecular cortado: 3 kDa) e centrifugar a 3000 g a 4 ° C para reduzir até um volume inferior a 5 mL.
   9. Aplicar a proteína rBC1531 concentrada na coluna SEC e recolher 60 fracções eluídas em 0,5 mL por tubo ¹³ .
   10. Tomar 15 μL de cada fração, executá-los em uma SDS-PAGE a 15%, e staiN o gel utilizando uma solução de coloração com Coomassie (azul brilhante de Coomassie 0,15% (p / v), metanol a 40% (v / v) e ácido acético glacial a 10% (v / v) como descrito ¹⁰ .
   11. Pipetar as frações que contêm rBC1531 e coletá-las em um tubo.

2. Triagem de Cristalização e Optimização de rBC1531

1. Condições de rastreio para a cristalização da proteína rBC1531
   1. Concentrar o rBC1531 do passo 1.4.11 até ~ 18,5 mg / mL usando um tubo de filtro centrífugo, como descrito no passo 1.4.8.
   2. Adicionar 50 μL de cada solução de rastreio de cristalização (ver secção 2.2) ¹⁴ aos poços de placas de cristalização de 96 poços sentadas. Colocar 0,5 μL da solução de proteína rBC1531 de 18,5 mg / mL numa cama sentada. Misturar a solução de proteína com 0,5 μL da solução do poço, repetindo o processo para toda a placa.
   3. Cubra a placa com filme adesivo transparente.Colocar as placas de 96 poços a 18 ° C e permitir a difusão de vapor.
   4. Digitalize as gotas com uma ampliação de 20-40X usando um microscópio de luz para monitorar a formação de cristais diariamente durante 2-3 semanas.
   5. Recolher dados de difracção de raios X ¹² utilizando os cristais de proteína rBC1531 obtidos.
2. Otimização das condições de cristalização de rBC1531
   1. Preparar 500 μL da solução de condição de cristalização inicial seleccionada ( eg, cacodilato de sódio 0,1 M, pH 6,5 e citrato de sódio 1,0 M) e encher uma placa de cristalização de 24 poços para a gota sentada.
   2. Adicionar 0,5 μL da solução de proteína rBC1531 a 18,5 mg / mL a um leito sentado, misturar com 0,5 μL da solução do poço e cobrir imediatamente a placa com película adesiva transparente. Colocar a placa a 18 ° C.
   3. Observe o crescimento do cristal sob um microscópio de luz por uma semana.
   4. Otimizar várias condições de cristalização variando o pH ( ie, PH 5,5-6,8) de cacodilato 0,1 M e alterando a concentração de sal ( isto é, 0,9-1,2 M) de citrato de sódio para se obter cristais singulares. Monitorar o crescimento do cristal durante ~ 1 semana e coletar dados de difração de raios-X ¹² .

3. Caracterização da Actividade Nucleósido Trifosfatase (NTPase) de rBC1531

1. Validação do estudo colorimétrico inorgânico dependente de fosfato
   1. Preparar uma reserva de pirofosfato (100 mM) e dilui-la até concentrações finais de 0,1, 0,25, 0,5, 1,0, 5,0, 10, 50, 100 e 250 μM em 200 μL de tampão de reacção (HEPES 20 mM, pH 7,4; 150 MM de NaCl e 2 mM de MgCl2) em placas de 96 poços em duplicado. Utilizar a primeira placa como controlo (isto não contém pirofosfatase). Certifique-se de que a segunda placa contém pirofosfatase como placa de trabalho, conforme indicado no passo 3.1.2.
   2. Adicionar 0,01 unidades de Saccharomyces cerevisiae p inorgânicoYrophosphatase (1 μL) aos poços da placa de trabalho e incubar a 20 ° C durante 30-60 min.
   3. Preparar solução de ácido molibdato misturando soluções de molibdato de amónio (0,86% v / v) e ácido ascórbico (14% v / v) numa proporção de 7: 3. Adicione 16 μL de solução de ácido molibdato aos poços de trabalho e controle e aguarde 15 min.
   4. Ler a _densidade óptica a 690 nm (OD 690 nm).
2. Ensaio colorimétrico de NTPase
   1. Preparar uma reserva de substrato de nucleósido trifosfato (NTP) 100 mM e diluir até à concentração desejada ( eg 0, 0,2, 4,4, 11, 22, 44, 88 ou 132 μM) em 180 μL de tampão de ensaio (HEPES 20 mM, PH 7,4, NaCl 150 mM e MgCl2 ₂ mM).
   2. Adicionar 20 μg de rBC1531 (1,5 mM) e os substratos NTP do passo 3.2.1 até 200 μL por reacção numa placa de 96 poços e pipetar para cima e para baixo para misturar bem. Cobrir a placa com a sua tampa e colocá-lo em uma incubadora a 37 ° C por 30 minPara realizar a reacção de hidrólise do substrato.
   3. Transferir a placa para um banho de água a 70 ° C e deixar em repouso durante 15 minutos para parar as reacções catalíticas mediadas por rBC1531.
   4. Adicionar 0,01 unidade de pirofosfatase inorgânica de S. cerevisiae (1 μL) a cada poço da placa de reacção (do passo 3.2.3) e incubar a 20 ° C durante 30 min. Adicionar 16 μL de solução de ácido molibdato à placa de reação para desenvolver a cor (~ 15 min). Ler a OD _690nm .
   5. Analise usando a equação de Michaelis-Menten, como descrito ¹² .

Resultados

A caracterização da proteína de interesse neste estudo começou por preparar uma quantidade suficiente de proteína Bc1531 (rBC1531) recombinante de B. cereus , de preferência mais do que vários miligramas. O fragmento de ADN que codifica a proteína BC1531 foi preparado por PCR utilizando o ADN genómico de B. cereus como molde, uma vez que contém genes ortólogos idênticos a ba1554 . RBC1531 foi sobre-expresso como uma proteína solúvel em c?...

Discussão

Studies of true pathogens are limited due to safety restrictions and regulations. Alternatively, pathogens can be studied using evolutionarily related non-pathogens or less pathogenic species. The ba1554 gene is considered a critical gene in B. anthracis. Fortunately, an identical gene is present in nonclinical B. cereus. Thus, without serious safety concerns, recombinant BC1531 protein can be used for biophysical and enzymatic characterization. Here, we described detailed procedures, moving fr...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacillus cereus ATCC14579	Korean Collection for Tissue Culture	3624
Genomic DNA prep kit	GeneAll	106-101	Genomic DNA preparation
Forward primer	Macrogen	GAAGGATCCGGAAGCAAAAA CGATGAAAGATATGCA	BamHI site is underlined
Reverse primer	Macrogen	CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT CCCTCATCAATACGTG	SalI site is underlined
nPfu-Forte	Enzynomics	P410	PCR polymerase
BamHI	Enzynomics	R003S
SalI	Enzynomics	R009S
pET49b expression vector	Novagen	71463	Expression vector was modified to add affinity tags and BamHI/SalI sites10
T4 DNA ligase	Enzynomics	M001S
Dialysis memebrane	Thermofisher	18265017
Dry block heater	JSR	JSBL-02T
LB broth (Luria-Bertani)	LPS solution	LB-05
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)	Becton, Dickinson and Company
Kanamycin	LPS solution	KAN025
Mini-prep kit	Favorgen	FAPDE300	Plasmid DNA preparation
BL21(DE3) Competent cell	Novagen	69450-3CN
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Fisher BioReagents	50-213-378
Sodium chloride	Daejung	7548-4100	PBS material
Potassium chloride	Daejung	6566-4405	PBS material
Potassium phosphate	Bio Basic Inc	PB0445	PBS material
Sodium phosphate	Bio Basic Inc	S0404	PBS material
Imidazole	Bio Basic Inc	IB0277
Sonicator	Sonics	VCX 130
Ni-NTA agaros	Qiagen	30210	Nickel bead
Rotator	Finepcr	AG
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-rad	1610374	SDS-PAGE protein standard
Coonmassie Brilliant Blue R-250	Fisher BioReagents	BP101-25	Coomassie staining solution
Methyl alcohol	Samchun chemical	M0585	Coomassie staining solution
Acetic acid	Daejung	1002-4105	Coomassie staining solution
Dialysis memebrane	Thermofisher	68035
2-Mercaptoethanol	Sigma-aldrich	M6250
Thrombin	Merckmillipore	605157-1KUCN	Prepare aliquots of 20 μl (1 Unit per μl) and store at 70 °C and thaw before use
Superdex 200 16/600	General Electric	28989335	Size exclusion chromatography
Gel filtration standard	Bio-rad	151-1901
Centrifugal filter	Amicon	UFC800396
Crystralization plates	Hampton research	HR3-083	96-well sitting drop plate
The JCSG core suite I-IV	Qiagen	130924-130927	Crystallization secreening solution
Microscope	Nikon	SMZ745T
Cryschem plates	Hampton research	HR3-158	24-well sitting drop plate
Inorganic pyrophosphatase	Sigma	10108987001
Ammonium molybdate solution	Sigma	13106-76-8
L-ascorbic acid	Sigma	50-81-7
NTP substrate	Startagene	200415-51
Spectrophotometer	Biotek	SynergyH1	microplate reader
GraphPad Prism 5	GraphPad	Prism 5 for Window