組換えタンパク質の発現、結晶化、および生物物理学的研究<em&gt;バチルス</em&gt;保有ヌクレオチドピロホスホリラーゼ、BcMazG

要約

Bacillus anthracisは致命的な吸入炭疽菌の必須病原体であるため、その遺伝子やタンパク質の研究は厳格に規制されています。代わりのアプローチは、オーソロガス遺伝子を研究することである。最小の実験装置を必要とし、重大な安全性の懸念がないB.セレウスの B. anthracisオルソログ（bc1531）の生物物理化学的研究を記載する。

要約

真の病原体から遺伝子やタンパク質を研究する際の安全規制や規制を克服するために、それらの同族体を研究することができます。 Bacillus anthracisは致命的な吸入炭疽菌を引き起こす必須の病原体である。 Bacillus cereusは、その近縁の進化的関係のためにB. anthracisを研究するための有用なモデルと考えられている。 炭疽菌の遺伝子クラスターba1554 - ba1558はバチルス ・セレウスの bc1531-bc1535クラスターならびにバチルス・チューリンゲンシスの bt1364-bt1368クラスターと高度に保存されており、 バチルス属の関連遺伝子の重要な役割を示している。この原稿ではB. cereusの bc1531のオルソログの組換えタンパク質を用いて炭疽菌の遺伝子クラスターからの第1遺伝子（ ba1554 ）のタンパク質産物を調製し特徴付ける方法を説明しています。

概要

組換えタンパク質発現は、限られたタンパク質量および有害な汚染などの天然のタンパク質源に関連する問題を克服するために広く使用されている。さらに、病原性遺伝子およびタンパク質の研究において、追加の安全予防措置を必要としない別の実験室株を利用することができる。例えば、 Bacillus cereusは、 Bacillus anthracisをそれらの近い進化的関係のために研究するための有用なモデルである¹ 。

炭疽菌はヒトや家畜の致命的な吸入炭疽菌を引き起こす必須の病原体であり、潜在的に生物兵器として使用することができる² 。したがって、 B. anthracisに関する実験室研究は、実験室領域が負の室内圧力で隔離されることを義務づけるバイオセーフティーレベル3（BSL-3）プラクティスを必要とする米疾病管理センター（NHS）によって厳格に規制されている。 B. anthracisとは対照的にB.セレウスはBSL-1剤に分類され、したがって安全性の懸念が最小限である。 B.セレウスは日和見病原体であり、感染時に食中毒を引き起こし、医学的援助なしに治療することができる。しかしB. cereusはB. anthracisと多くの重要な遺伝子を共有しているのでB. anthracisタンパク質の機能はB. cereus ^1の対応する同族体を用いて研究することができる。

B. anthracisの ba1554 - ba1558遺伝子クラスターは、 bc1531 - bc1535クラスターと高度に保存されています Bacillus thuringiensisの bt1364-bt1368クラスターと同様に 、遺伝子構成および配列の点で、B。さらに、それぞれのクラスターの最初の遺伝子（ ba1554 、 bc1531 、およびbt1364 ）は、完全に保存されている（ すなわち、 100％のヌクレオチド配列同一性）、implyiBacillus種における遺伝子産物の重要な役割を担う。これらの遺伝子クラスターにおけるその位置のために、ba1554は、推定転写調節因子³として誤って同定された。しかしながら、 ba1554産物のアミノ酸配列分析は、それがヌクレオチドピロホスホヒドロラーゼ活性を有し、転写因子活性に関連しないMazGファミリーに属することを示している4,5。 MazGファミリーに属するタンパク質は、全配列および長さに関して多様であるが、EXXE 12-28EXXDモチーフによって特徴付けられる共通の約100残基のMazGドメインを共有する（「X」は任意のアミノ酸残基を表し、 X残基の数を示す）。

MazGドメインは、必ずしも特定の触媒活性を直接的に説明するとは限らない。 エシェリヒア・コリ （EcMazG） 由来の MazGメンバーは、2つのMazGドメインを有するが、C末端のMazGドメインは酵素的に活性である⁶ 。さらに、MazG酵素の基質特異性は、非特異的ヌクレオシド三リン酸（EcMazGの場合）から特異的dCTP / dATP（インテグリン関連MazGの場合）およびdUTP（dUTPaseの場合）6,7,8,9まで変化する。したがって、そのNTPアーゼ活性を確認し、その基質特異性を解明するためには、BA1554タンパク質の生物物理化学的分析が必要である。

ここでは、BSL-3機能を持たない大部分の研究室が分子レベルでB. anthracis ba1554のオルソログであるB. cereus bc1531遺伝子のタンパク質産物を特徴づけることができる段階的プロトコールを提供する。簡潔には、組換えBC1531（rBC1531）を大腸菌で発現させ、親和性タグを用いて精製した。 X線結晶学実験のために、結晶rBC1531タンパク質のzation条件をスクリーニングし最適化した。 rBC1531の酵素活性を評価するために、NTPアーゼ活性を比色分析して、従来使用されていた放射性標識ヌクレオチドを回避した。最後に、得られた生物物理化学的データの分析により、rBC1531のオリゴマー化状態および触媒パラメータを決定することができ、ならびにrBC1531結晶からX線回折データを得ることができた。

プロトコル

1. rBC1531の組換えタンパク質産生および精製

1. 組換えBC1531タンパク質（rBC1531） - 発現プラスミドの調製
   1. B. cereus ^10のゲノムDNAを調製する。
   2. BamHIおよびSalI制限酵素部位をそれぞれ作製するために、フォワードおよびリバースプライマー（材料リストを参照）を用いて、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によってB.セレウスゲノムDNAの鋳型からbc1531遺伝子を増幅する。
   3. PCR産物と改変pET49bベクター（pET49bm）をBamHIとSalIを用いて消化し 、 ¹¹ 。
   4. 記載されているように、10μLの反応液中のT4 DNAリガーゼを用いて、ステップ1.1.3からの消化されたPCR産物およびベクター（3：1比）を混合する。 18℃で30分間インキュベートする。
   5. ライゲーション反応3μLをケミカ50μLにピペット大腸菌 DH5α細胞をチューブ内に1回通す。ピペットで上下に穏やかに混合し、氷上に30分間置く。 42℃で45秒間の熱ショック。 Luria-Bertani（LB）培地1 mLを添加し、激しく振盪しながら細胞を増殖させる（250 rpm、37℃、45分間）。
   6. ステップ1.1.6からの形質転換された細胞100μLを取り出し、100μg/ mLカナマイシン（Kan）を含むLB-寒天プレート上にそれらを広げる。 37℃で約18時間インキュベートする。
   7. 滅菌チップを使用してコロニーを選び、100μg/ mLのKanを含む3mLのLB培地で細胞を増殖させる;激しく振盪する（250rpm、37℃、18時間）。
   8. 記載されているように、アルカリ性SDS溶解法を用いてプラスミドDNAを調製する^。10 。
   9. DNAシーケンシング¹²を使用して、rBC1531発現コンストラクトのヌクレオチド配列を確認する。
2. rBC1531タンパク質の過剰発現
   1. 大腸菌 BL21（DE3）株をrBC1531-expで再形質転換する過剰発現のために、工程1.1.5-1.1.6に記載されているように、レシジョンプラスミド。
   2. コロニーを選択し、50μg/ mLカン（LB + Kan）を含む10mLのLB培地で増殖させる。 37℃で18時間激しく振盪する。
   3. 1LのLB + Kan培地に一晩培養した10mLを接種し、OD ₆₀₀ （600nmでの光学密度）が〜0.7に達するまで37℃で増殖させる。
   4. 培養物を氷冷水中に約15分間浸漬して温度を18℃に冷却し、イソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）を最終濃度1mMで培養液に添加して組換えタンパク質を発現させる。 18〜18℃でさらに16〜18時間培養する。
3. rBC1531の精製
   1. 遠心分離（5,000×g、4℃、30分）により細胞を回収する。細胞を乱さないように注意深く上清を捨てる。 10 mMイミダゾールを含む50 mLのリン酸緩衝食塩水（PBS）溶液に細胞を再懸濁する。
   2. 細胞ライセートの過熱（時間：2分30秒;サイクルオン：5秒;サイクルオフ：10秒;振幅：38％）を防止するために、氷上で超音波処理することによって細胞を2回溶解する。
   3. 遠心分離（約25,000×g、4℃、30分）により細胞溶解物を除去する。
   4. ニッケルビーズ3mLと10mMイミダゾールを含む60mLのPBSを混合し、余分な緩衝液を重力流して、平衡化したニッケルビーズを2.5×10cmガラスクロマトグラフィーカラムに沈殿させる。
   5. ピペットを用いて、ステップ1.3.3の上清を予め平衡化されたニッケルビーズを有するカラムに移し、低速（約20rpm）で回転ホイール上で4℃で2時間インキュベートする。
   6. 上清を重力により排出させ、10mMイミダゾールを含有する100mLのPBSでカラム中のニッケルビーズを3回洗浄する。
   7. 250mMイミダゾールを含有する4×5mLのPBSを適用することにより、rBC1531タンパク質を溶出する。
   8. ステップ1.3.7から15μLの溶出液を取り出し、15％SDS-PAGEで溶出する。タンパク質バンドを可視化するクーマシーブルー染色を用いたゲル¹⁰ 。
4. トロンビンタンパク質分解によるrBC1531タンパク質の親和性タグの除去
   1. この画分を透析チューブ（分子量カットオフ：3kDa）にピペットで入れ、4Lのトロンビン切断適合性緩衝液（20mM HEPES、pH7.4,150mM NaCl、および1.5mMβ-メルカプトエタノール）を含むビーカーに入れ、 4℃で一晩インキュベートする。
   2. 画分をピペットで取り出し、コニカルチューブに移す。
   3. 280nmでの吸光度を測定し、記載されているようにrBC1531タンパク質濃度を推定する。
   4. 0.5 mLのチューブで50μgのrBC1531を取り、様々な量のトロンビン（ すなわち、 2,1,6、および0.3単位）を加える。 rBC1531とトロンビン反応を20℃で約3時間インキュベートして、N末端アフィニティタグを切断するのに必要なトロンビンの量を最小限に抑えます。
   5. rBC1531およびトロンビン反応を15％SDS-PAGEで分析し、N末端アフィニティータグを完全に消化し、タグを含まないrBC1531を産生するトロンビンの最も少ない量（ 例えば、 50単位のrBC1531あたり0.3単位のトロンビン）を決定する。
   6. 10mgのrBC1531タンパク質と60ユニットのトロンビンを15mLチューブに加え、トロンビン - タンパク質分解反応のために20℃で約3時間インキュベートする。
   7. 分子量および溶出量の標準曲線を作成するために、サイズ排除クロマトグラフィー（SEC）カラムにゲルろ過標準を適用する（ ^13） 。
   8. ステップ1.4.6のトロンビン消化rBC1531タンパク質を遠心フィルターチューブ（分子量カットオフ：3kDa）に入れ、4℃で3000gで遠心分離して、5mL未満の体積に減少させる。
   9. 濃縮したrBC1531タンパク質をSECカラムにアプライし、溶出画分60個をチューブ1本あたり0.5 mLずつ集めます。
   10. それぞれの画分15μLをとり、15％SDS-PAGE上でそれらを実行し、記載の10のクマシー染色溶液（0.15％（w / v）クーマシーブリリアントブルー、40％（v / v）メタノール、および10％（v / v）氷酢酸）を用いたゲル。
   11. rBC1531を含む画分をピペットで取り出し、1本のチューブに集めます。

2. rBC1531の結晶スクリーニングおよび最適化

1. rBC1531タンパク質の結晶化のスクリーニング条件
   1. ステップ1.4.11のrBC1531を遠心フィルターチューブを使用して〜18.5 mg / mLまで濃縮します（1.4.8項を参照）。
   2. 各結晶化スクリーニング溶液（セクション2.2を参照）14μLを96ウェルシッティングドロップ結晶化プレートのウェルに加える。 18.5mg / mLのrBC1531タンパク質溶液0.5μLを座位ベッド上に置く。 0.5μLのウェル溶液とタンパク質溶液を混合し、プレート全体のプロセスを繰り返します。
   3. 透明な接着フィルムでプレートを覆う。96ウェルプレートを18℃に置き、蒸気拡散を可能にする。
   4. 光学顕微鏡を用いて20〜40倍の倍率で液滴をスキャンし、結晶形成を毎日2-3週間モニターする。
   5. 得られたrBC1531タンパク質結晶を用いてX線回折データ¹²を収集する。
2. rBC1531結晶化条件の最適化
   1. 選択した初期結晶化条件溶液（ 例えば、 0.1Mカコジル酸ナトリウム、pH6.5および1.0Mクエン酸ナトリウム）500μLを調製し、シッティングドロップ用の24ウェル結晶化プレートを充填する。
   2. 0.5μLの18.5mg / mL rBC1531タンパク質溶液を座布団に添加し、ウェル溶液0.5μLと混合し、すぐに透明な接着フィルムでプレートを覆う。 18℃にプレートを置きます。
   3. 1週間、光学顕微鏡下で結晶成長を観察する。
   4. pHを変化させることによって様々な結晶化条件を最適化する（ すなわち、pH 5.5〜6.8）を用いて、そしてクエン酸ナトリウムの塩濃度（ すなわち、 0.9〜1.2M）を変化させて単結晶を得ることによって調製した。 〜1週間の結晶成長をモニターし、X線回折データを収集する¹² 。

rBC1531のヌクレオシドトリホスファターゼ（NTPアーゼ）活性の特徴付け

1. 無機リン酸依存性比色分析の検証
   1. ピロリン酸（100mM）のストックを調製し、200μLの反応緩衝液（20mM HEPES、pH7.4; 150mM）中に0.1,0.25,0.5,1.0,5.0,10,50,100および250μMの最終濃度に希釈する。 mM NaCl;および2mM MgCl ₂ ）で2回洗浄した。コントロールとして最初のプレートを使用してください（これにはピロホスファターゼが含まれていません）。第2プレートには、ステップ3.1.2の指示に従って、作業プレートとしてピロホスファターゼが含まれていることを確認してください。
   2. Saccharomyces cerevisiae無機p 0.01単位を加える。ヨウ化ホスファターゼ（1μL）を作用プレートのウェルに添加し、20℃で30〜60分間インキュベートする。
   3. モリブデン酸アンモニウム（0.86％v / v）とアスコルビン酸（14％v / v）の溶液を7：3の比で混合することにより、モリブデン酸溶液を調製する。モリブデン酸溶液16μLを作業ウェルと対照ウェルの両方に加え、15分間待つ。
   4. 690 nm（OD 690 nm）の光学濃度を読み取ります。
2. 比色NTPアーゼアッセイ
   1. 100mMのヌクレオシド三リン酸（NTP）基質のストックを調製し、180μLのアッセイ緩​​衝液（20mM HEPES、pH7.4）中で所望の濃度（ 例えば、 0,0.2,4.4,11,22,44,88または132μM） pH7.4; 150mM NaCl;および2mM MgCl ₂ ）で洗浄した。
   2. 96ウェルプレートで20μgのrBC1531（1.5mM）と3.2.1ステップのNTP基質を200μLまで加え、ピペットで上下にピペットでよく混合します。蓋でプレートを覆い、37℃のインキュベーターに30分間置く基質加水分解反応を実施する。
   3. プレートを70℃の水浴に移し、rBC1531媒介触媒反応を停止させるために15分間放置する。
   4. S.cerevisiae無機ピロホスファターゼ（1μL）0.01単位を反応プレートの各ウェルに加え（ステップ3.2.3から）、20℃で30分間インキュベートする。 16μLのモリブデン酸溶液を反応プレートに加えて発色させる（約15分）。 OD _690nmで読んでください。
   5. 12に記載されているようにMichaelis-Menten方程式を用いて解析する。

結果

この研究における目的のタンパク質の特徴付けは、好ましくは数ミリグラム以上の十分な量の組換えバチルスセレウスbc1531 （rBC1531）タンパク質を調製することによって開始した。 ba1554と同一のオルソロガス遺伝子を含むので、 BセレウスのゲノムDNAを鋳型としてPCRを行い、BC1531タンパク質をコードするDNA断片を調製した。 rBC1531は大腸菌細胞にお...

ディスカッション

Studies of true pathogens are limited due to safety restrictions and regulations. Alternatively, pathogens can be studied using evolutionarily related non-pathogens or less pathogenic species. The ba1554 gene is considered a critical gene in B. anthracis. Fortunately, an identical gene is present in nonclinical B. cereus. Thus, without serious safety concerns, recombinant BC1531 protein can be used for biophysical and enzymatic characterization. Here, we described detailed procedures, moving fr...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacillus cereus ATCC14579	Korean Collection for Tissue Culture	3624
Genomic DNA prep kit	GeneAll	106-101	Genomic DNA preparation
Forward primer	Macrogen	GAAGGATCCGGAAGCAAAAA CGATGAAAGATATGCA	BamHI site is underlined
Reverse primer	Macrogen	CTTGTCGACTTATTCTTTCTCT CCCTCATCAATACGTG	SalI site is underlined
nPfu-Forte	Enzynomics	P410	PCR polymerase
BamHI	Enzynomics	R003S
SalI	Enzynomics	R009S
pET49b expression vector	Novagen	71463	Expression vector was modified to add affinity tags and BamHI/SalI sites10
T4 DNA ligase	Enzynomics	M001S
Dialysis memebrane	Thermofisher	18265017
Dry block heater	JSR	JSBL-02T
LB broth (Luria-Bertani)	LPS solution	LB-05
LB Agar, Miller (Luria-Bertani)	Becton, Dickinson and Company
Kanamycin	LPS solution	KAN025
Mini-prep kit	Favorgen	FAPDE300	Plasmid DNA preparation
BL21(DE3) Competent cell	Novagen	69450-3CN
Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)	Fisher BioReagents	50-213-378
Sodium chloride	Daejung	7548-4100	PBS material
Potassium chloride	Daejung	6566-4405	PBS material
Potassium phosphate	Bio Basic Inc	PB0445	PBS material
Sodium phosphate	Bio Basic Inc	S0404	PBS material
Imidazole	Bio Basic Inc	IB0277
Sonicator	Sonics	VCX 130
Ni-NTA agaros	Qiagen	30210	Nickel bead
Rotator	Finepcr	AG
Precision Plus Protein Dual Color Standards	Bio-rad	1610374	SDS-PAGE protein standard
Coonmassie Brilliant Blue R-250	Fisher BioReagents	BP101-25	Coomassie staining solution
Methyl alcohol	Samchun chemical	M0585	Coomassie staining solution
Acetic acid	Daejung	1002-4105	Coomassie staining solution
Dialysis memebrane	Thermofisher	68035
2-Mercaptoethanol	Sigma-aldrich	M6250
Thrombin	Merckmillipore	605157-1KUCN	Prepare aliquots of 20 μl (1 Unit per μl) and store at 70 °C and thaw before use
Superdex 200 16/600	General Electric	28989335	Size exclusion chromatography
Gel filtration standard	Bio-rad	151-1901
Centrifugal filter	Amicon	UFC800396
Crystralization plates	Hampton research	HR3-083	96-well sitting drop plate
The JCSG core suite I-IV	Qiagen	130924-130927	Crystallization secreening solution
Microscope	Nikon	SMZ745T
Cryschem plates	Hampton research	HR3-158	24-well sitting drop plate
Inorganic pyrophosphatase	Sigma	10108987001
Ammonium molybdate solution	Sigma	13106-76-8
L-ascorbic acid	Sigma	50-81-7
NTP substrate	Startagene	200415-51
Spectrophotometer	Biotek	SynergyH1	microplate reader
GraphPad Prism 5	GraphPad	Prism 5 for Window