אובייקט הרומן מבחן ההכרה לחקירה של למידה וזיכרון בעכברים

Summary

המבחן זיהוי האובייקט (אורט) הוא assay פשוט ויעיל להערכת בלמידה ובזיכרון בעכברים. המתודולוגיה המתוארת להלן.

Abstract

המבחן זיהוי האובייקט (אורט) הוא assay התנהגותית נפוץ לחקור אספקטים שונים הקשורים בלמידה ובזיכרון בעכברים. אורט הוא פשוט למדי, ניתן להשלים במשך 3 ימים: habituation יום, יום אימונים ויום הבדיקה. במהלך האימון, העכבר מותר לחקור 2 עצמים זהים. ביום הבדיקה, אחד מהאובייקטים הכשרה מוחלף אובייקט הרומן. כי עכברים יש העדפה של מולדת החדשנות, אם העכבר מזהה האובייקט מוכר, זה תוכלו לבלות את רוב זמנה על האובייקט הרומן. בשל העדפה מולדת זו, יש אין צורך חיזוק חיובי או שלילי או זמן הכשרה לוחות זמנים. בנוסף, ניתן לשנות את אורט גם עבור יישומים רבים. מרווח זמן השמירה ניתן מקוצר לבחון את הזיכרון לטווח קצר, או מאורכים כדי לחקור זיכרון לטווח ארוך. להתערבות פרמקולוגית ניתן להשתמש ב במועדים שונים לפני אימון, לאחר הכשרה, או לפני האחזור לחקור שלבים שונים של למידה (קרי, רכישה, איחוד מוקדם או מאוחר או החזרה). בסך הכל, אורט היא בדיקת מתח נמוך יחסית, יעיל עבור זיכרון בעכברים, המתאים עבור זיהוי שינויים שתלמידים בעקבות מניפולציות תרופתי, ביולוגי או גנטית.

Introduction

המבחן זיהוי האובייקט (אורט), הידוע גם בשם אובייקט הרומן זיהוי הבדיקה (), הוא אמצעי יחסית מהיר ויעיל לבדיקת שלבים שונים של למידה וזיכרון בעכברים. זה היה במקור שתואר על ידי Ennaceur ו- Delacour בשנת 1988, המשמשים בעיקר חולדות¹; עם זאת, מאז, עברו בהצלחה המותאמים לשימוש בעכברים^2,3,4,5,6,7. המבחן מתבסס על כמה כמו שלוש פגישות: מושב אחד habituation אימון אחד, מבחן אחד. אימון פשוט כרוך חקר חזותי של שני עצמים זהים, בזמן הפעלת הבדיקה כרוכה בהחלפת אחד מהאובייקטים בחנו בעבר עם חפץ הרומן. מאחר מכרסמים בהעדפה מולדת לחדשנות, מכרסם שזוכר את האובייקט מוכר אבלה יותר זמן לחקור את האובייקט הרומן^7,8,9.

היתרון העיקרי של אורט על בדיקות זיכרון מכרסמים אחרים הוא זה מסתמך על נטייה טבעית של מכרסמים לחקר חידוש⁸. לכן אין צורך רבים סשנים של הדרכה או כל חיזוק חיובי או שלילי להניע התנהגות. פירוש אורט הוא הרבה פחות מלחיץ, ביחס אחרים בדיקות^{10,11,12,13,14,15}, ולא דורש באופן משמעותי פחות זמן מאשר זיכרון נפוץ אחר בדיקות, כמו מבוך המים מוריס או מבוך בארנס, אשר שניהם יכול לקחת שבוע או יותר. כתוצאה מכך, התנאים של אורט להידמות יותר מאלה המשמשים לומד האדם קוגניציה, גובר תוקף אקולוגי של הבדיקה מבדקים זיכרון מכרסמים רבים אחרים. באופן דומה, כי אורט היא משימה פשוטה זיכרון חזותי, עבר בהצלחה המותאמים לשימוש במינים רבים, כולל בני אדם, קופים, כדי להעריך היבטים בין מינים שונים של זיכרון הצהרתי ^{2,16 ,17}. לבסוף, אורט ניתן בקלות לשנות לבחון שלבים שונים של למידה וזיכרון (קרי, רכישה, איחוד או האחזור), כדי להעריך סוגים שונים של זיכרון (למשל, זיכרון מרחבי), או כדי להעריך שמירה שונה מרווחים (קרי, זיכרון לטווח קצר לעומת לטווח ארוך).

צדדיות של אורט מספק פלטפורמה ליישומים אין ספור מחקרים. הלימודים יכולים לעשות שימוש סוכנים תרופתי כדי לשבש או לשפר את הזיכרון. משתנה הזמן של המנהל הסמים לפני או אחרי אימון, או לפני בדיקות יכול מרמזות על הבסיס העצבי מנגנונים להוביל משובשות או משופרת זיכרון^{6,18,19, 20}. באופן דומה, ניתן optogenetic טכנולוגיה נהג על אלו גם נקודות זמן שונות להסתכל עצבית ההפעלה/עיכוב אשר תורם השלבים השונים של למידה וזיכרון. אורט, היא מתאימה גם להערכת ההבדלים בבעלי חיים מהונדס, במחקרים הנגע, או במודלים ניווניות או הזדקנות מחקרים^{21,22,23,24, 25 , 26 , 27 , 28}. ניתן לשנות את הזמן בין בדיקה, המכונה את מרווח זמן השמירה, והדרכה כדי להעריך שינויים אלה על הזיכרון לטווח קצר, ארוך²⁶. בסופו של דבר, אורט יכול לשמש ככלי ללמוד שינויים תרופתי, גנטי, נוירולוגיות למידה וזיכרון, או כלים אלה ניתן ללמוד את הבסיס של למידה וזיכרון ב אורט.

Protocol

כל ההליכים שבוצעה כאן הוגשו שאושרו על-ידי חיה על עצמך, והשימוש בהם הוועדה, שהתנהלו בעקבות הנחיות NIH.

1-בחירת עצמים, הגדרת הניסוי

1. לבחור אובייקטים שונים מספיק כדי שיפלו בקלות על ידי עכברים, אבל יש תואר דומה של מורכבות (מרקם, צורה, צבע המתבנת, בהירות, וכו) על מנת למזער את כל הפוטנציאל המושרה העדפה אובייקט זה ייתכן הטיה התוצאות (לקבלת תיאור מקיף של עצם הבחירה ⁷, ראה Ennaceur 2010).
   1. לבדיקת מולדת העדפה ואפליה (ראה שלבים 2 & 3).
   2. חפצים בגודל של עכבר או רק מעט גדול יותר לעודד את חקר ( איור 1). כדי לצמצם את העדפה המושרה, להבטיח כי עכברים הם מסוגל לטפס על שני עצמים או אף אובייקט, למרות יכולת לטפס על חפץ עשוי להגביר את ההתעניינות חקר (זמן מבוזבז יושב עם אובייקט לא נספר לכיוון חקר זמן.)
   3. יש לפחות שני עותקים של כל אובייקט. עם זאת, כדי למזער את פוטנציאל רמזים ריח במהלך הבדיקה, יש לפחות 3 כל אובייקט, כפילויות לאימונים ואחד לבדיקת.
   4. חפצים עשוי מחומר בלתי ניתנת לשבירה, כמו אובדן עצם עקב נזק במהלך ניסויים יכול להפריע ההמשכיות של בדיקות, העלול לגרום נזק או פגיעה לחיה.
   5. ניקוי יסודי האובייקטים לפני ובין שימוש (70% vol/כרך אתנול הוא המתאים).
2. כדי להקטין את הלחץ של תאורה בהירה, להשתמש תאורה ' מאטום לשקוף ', נמוך, עם מרכז המבוך מואר בסביבות 20 lux. השתמש של טמפרטורה ולחות הדומה תנאי מגורים רגיל. אם עכברים מועברות מחדר דיור אל חדר אחר לניסוי, להתאקלם עכברים לחדר החדש שלהם לפחות 1 שעה לפני השימוש בכל יום.
3. ידית עכברים טוב לפני אימון. כי המבחן מסתמך על הנטייה הטבעית של מכרסמים לחקור את החדשנות, להפחית מתח או חרדה טיפול שעלולות לפגוע רצונם לחקור את הזירה, ולאחר מכן, את האובייקטים. באופן אידיאלי, להתמודד עם עכברים 1 - 2 פעמים / יום במשך לפחות 1 דקה, 1-2 שבועות לפני בדיקת ^{15 , 29}.
4. לשימוש הזירה המרכזית, חדר מרובע (בסביבות 40 ס"מ על 40 ס"מ x 40 ס מ) זני לבן או שחור, פלסטיק שאינו נקבובי, בניגוד לצבע של העכבר. לחלופין, השתמש בעריכת ארנה בסיבוב במיוחד, בעת שימוש עכברים חרדה יכול לשבת בפינות ארנה מרובע, ארנה עגול עשוי להיות עדיף לעודד התנהגות גישוש ^{18 , 30}-
   1. ביום אימון, מקום 2 עצמים זהים באלכסון (קרי אחת לפינה NW ואחד בפינה SE). אם אובייקטים הם קלים מדי, ניתן להעביר על ידי העכבר להדק אותם על הרצפה. שליפת הרכבה יצירות מרק טוב.
   2. בדיקה ביום, להשתמש עוד בעותק 3 ^rd כל אובייקט כדי למקם אובייקט מוכר אחד, אובייקט רומן אחד על אותו באלכסון כמו ביום אימון ( איור 2).
   3. מאוזנים השימוש של כל ערכה של אובייקטים כך כל אובייקט משמשת באותה מידה כמו אובייקט מוכר, כאובייקט הרומן. כמו כן, מאוזנים המיקום של האובייקט הרומן לכל אחד 4 הפינות של הזירה. הקפידו לציין אילו אלכסון משמש עבור איזו חיה כך האלכסון פעם ביום אימון הוא זהה לזה המשמש ביום הבדיקה, עבור כל עכבר.
   4. ניקוי יסודי את המנגנון ואת האובייקטים כדי להסיר ריח רמזים לפני ובין שימוש (70% vol/כרך אתנול הוא המתאים).
5. למקם את המצלמה ישירות תקורה של המנגנון לתצוגה אופטימלית של חקר. רק להשתמש בתוכנה עם האף-נקודת זיהוי לניתוח מדויק. אם משתמש בתוכנת, לכידת תמונת רקע עם האובייקטים במקום לפני הפעלת. התוכנה, הגדר את האזור של חקר להיות כ 2-3 ס מ מסביב לאובייקט.
6. כדי להפחית הפרעות הנסיין, להקליט את המשפט, ציון על זה מאוחר יותר. עיוור השערים לתנאים ניסיוני. אם ניקוד ידני במהלך הניסוי, ודא כי הנסיין הוא יותר מ- 1 מטר מן הזירה, וגלוי לא העכבר.
   הערה: בכל זמן העכבר מבלה בישיבה על האובייקט ללא פעיל vibrissae גורף או להסניף לא נחשב חקר זמן.
חקר
7. הגדר כאשר העכבר ' s רעש הוא הצביע לעבר האובייקט ותוך 2-3 ס מ של האובייקט, עם vibrissae פעיל גורף או להסניף. זה לא נחשב עת יושב על האובייקט ללא אינדיקציה לחקירת פעילים.

2. הצורך טייס הניסויים

1. בדיקה על העדפה המושרה
   1. עבור habituation, להסיר את העכבר מכלובה הביתה ומניחים אותו באמצע המגרש פתוח. לאפשר את העכבר כדי לחקור בחופשיות על 5 דק
   2. על יום אימונים (T1), מקום 2 אובייקטים שונים מול הגזרות של המנגנון, (דהיינו, NW פינות SE). להסיר את העכבר מכלובה הביתה ומניחים אותו באמצע המגרש פתוח. לאפשר גלישה חופשית במשך 10 דקות
   3. לחשב מדד אפליה. אם אין העדפה המושרה, מדד אפליה צריך להיות ליד או אפס. כל האובייקטים מראים העדפה לא אמור לשמש אורט.
2. בדיקה ליכולת אפליה
   1. עבור habituation, להסיר את העכבר מכלובה הביתה ומניחים אותו באמצע המגרש פתוח. לאפשר את העכבר כדי לחקור בחופשיות על 5 דק
   2. על אימון (T1), מקום 2 עצמים זהים מול הגזרות. הנח את העכבר במרכז הזירה ולאפשר את העכבר כדי לחקור במשך 10 דקות
   3. על בדיקות הפעלה (T2), מקום אחד של האובייקט ששימש T1 ואובייקט אחד הרומן ברבעים הנגדי (קרי, NW, פינות SE). שישים דקות אחרי T1, מקם את העכבר במרכז הזירה ולאפשר גלישה חופשית במשך 10 דקות
   4. לחשב מדד אפליה. במרווח השמירה 60 דקות, מדד אפליה צריך להיות מעל 0.25-

3. ניתוח ניסיוני

1. Habituation
   1. להסיר את העכבר מכלובה הביתה ומניחים אותו באמצע המגרש פתוח, ריק. אפשר בחינם חקר הזירה של 5 דקות. לאחר הכלוב בבית ריק, לשמור אותה לשימוש כלוב אחזקות למחרת.
   2. בסוף 5 דקות, להסיר את העכבר והצב בכלוב החזקה. אל תחזרו על העכבר בכלוב המקורי, או זה עלול להשפיע על ההתנהגות של העכברים הנותרים להיבדק.
   3. לנקות ביסודיות את המנגנון בין עכברים באמצעות אתנול vol/כרך 70%-
      הערה: במהלך habituation, התנהגות חרדה יכול להיות מוערך על ידי חישוב הזמן המושקע במרכז (ראה ליד & Belzung 2003 ³¹). זהו מדד של שימושי כאשר בוחנים את משך הזמן עבור T1. עכברים חרדה גבוהה יותר עשויה לדרוש הפעלה 10 דקות להגיע לקריטריון חקר מינימום.
2. אימונים (T1)
   1. מקום שני עצמים זהים ברבעים מול הזירה (קרי, פינה NE, פינה SW).
   2. 24 שעות לאחר habituation, להסיר את העכבר מכלובה הביתה ומניחים אותו במרכז הזירה, במרחר שווה האובייקטים זהים 2.
   3. מאפשרים גלישה חופשית למשך תקופה מינימלית של 5 דקות. אם משתמש זן של עכברים ידועים נמוך גינקולוגיות או חקר פעילות, (קרי, במרבית העכברים לא מגיעים מינימום של 20 s חקר של שני העצמים על ידי 5 דקות, כאמור את הניסויים פיילוט או הספרות), להרחיב את המשפט 10 דקות עבור כל מיקרופון e במדגם.
   4. בסוף המשפט, להסיר את העכבר והצב בכלוב החזקה. לאחר הכלוב בבית ריק, לשמור אותה לשימוש כמו בכלוב החזקה על בדיקות ביום.
   5. ניקוי יסודי את המנגנון ואת האובייקטים בין עכברים באמצעות אתנול vol/כרך 70%-
3. בדיקה (T2)
   1. למקם אובייקט אחד לשימוש בזמן T1 (כלומר, האובייקט מוכר), אובייקט אחד הרומן ברבעים הנגדי של הזירה. השתמש באותם המקומות המשמשים במהלך T1 עבור כל עכבר.
   2. -T1 לערך מרווח זמן T2 של בחירה, להסיר את העכבר מכלובה הביתה ומניחים אותו בזירה מרכז, במרחר שווה את האובייקט מוכר והאובייקט הרומן.
      הערה: בכל מרווח זמן השמירה של 24 שעות, במרבית העכברים לא תהיה אפשרות להפלות בין האובייקט מוכר ואת הרומן (בדרך כלל-0.2 < d2 < 0.2, לעומת חיובי לשלוט ³²). אם בודקים תופעות nootropic, השתמש בנקודה זמן כדי לחקור שיפור הזיכרון. כדי לחקור זיכרון גירעונות, להשתמש למרווח זמן קצר יותר שמירה על מקום בין 20 דקות ל- 4 שעות, בהתאם המתח של העכבר.
   3. מאפשרים גלישה חופשית למשך 10 דקות. בסוף המשפט, להסיר את העכבר והצב בכלוב החזקה.
4. עבור שניהם T1 ו T2, ציון של 5 דקות קודם. אם העכבר אינו עומד הפעם חקר מינימלי של 20 s עבור שני אובייקטים, להמשיך הבקיע אחרי 5 דקות עד חקר הכולל עולה על 20 ס

4. ניתוח נתונים

1. לקבלת פטור
   1. במהלך שני אימונים (T1) ובדיקות (T2), לחשב זמן חקר הכולל שני האובייקטים עבור כל מושב (e1, e2). במרבית העכברים אמורים להגיע חקר המינימלי הכולל עבור שני אובייקטים של 20 s על ידי 5 דק
   2. הזמן להרחיב T1 ו T2 10 דקות עבור זנים של עכברים יש חקר נמוכה, לא בקריטריון זה מינימום על ידי 5 דקות, כפי שנצפה במהלך הבדיקה טייס.
   3. ציון התנהגות במשך 5 דקות או מעבר 5 דקות עד שהם מגיעים הקריטריון המינימלי 20 s.
   4. אם עכברים לא להגיע למינימום 20 s של חקר עבור שני אובייקטים עבור T1 או T2-10 דקות, אל תכלול ניתוח, כפי שזה לא יכול להיות מאושרות הם בילו מספיק זמן לחקור ללמוד/להפלות.
2. המוחלט לעומת ניתוח יחסי
   הערה: נוסחאות שונות עבור ניתוח ואת הקשר שלהם אחד לשני ניתן לראות בטבלה 1. E1
   1. חישוב זמן חקר סה כ במהלך אימון עבור 2 עצמים זהים, a1 ו- a2 איפה החפצים זהים.
      e1 = a1 + a2
   E2
   2. חישוב משך הזמן הכולל חקר במהלך הבדיקה עבור האובייקט מוכר (a) והרומן אובייקט (ב).
      e2 = + b
   3. חישוב d1 בפשטות את הזמן לחקור את הרומן אובייקט פחות זמן בילו לחקור את האובייקט מוכר. המדד אפליה מוחלטת (d1) לא לוקח מתחשבת בהבדלים בין עכברים או טיפול בזמן חקר קבוצות, אבל בנסיבות מסוימות, ייתכן מדד רגיש יותר ²-
      d1 = b-a
   4. D2 חישוב הזמן בילה לחקור את האובייקט הרומן מינוס הזמן בילה לחקור את האובייקט מוכר מחולק על ידי חקר סה כ זמן. המדד הנפוץ ביותר הוא ערך יחסי אפליה המכונה לעתים קרובות האינדקס אפליה (d2), אשר לא מושפע על ידי הבדלים בזמן חקירה. זה אומר כל הערכים תיפול בין-1 ו- +1.
      d2 = d1/e2
   לחלופין,
   5. לחשב את זיהוי או העדפה אינדקס (d3) ³. זה הזמן המושקע לחקור את האובייקט הרומן מחולק הזמן הכולל. משמעות הדבר היא שכל הערכים תיפול בין 0 ל-1. לעיתים קרובות מוכפלים ב- 100, משמש כערך אחוז.
      d3 = b/e2 * 100
3. ניתוח סטטיסטי
   1. באמצעות הערכים אפליה רעה עבור כל קבוצה, לקבוע ביצועי זיכרון באמצעות חד-כיווני אנובה. לצורך ניתוח נוסף, לערוך השוואות דו-כיווני פוסט הוק עם שטופלו לעומת מצב הרכב ואת קבוצות שליטה חיובי/שלילי.

תוצאות

ניסיוני הכנה אורט כללי מוצגת באיור2. על habituation ממוקמים היום (T0) עכברים בזירה ריק עבור 5 דק. עשרים וארבע שעות אחר כך, עכברים להציב בחזרה בבית הבליעה עם 2 עצמים זהים ואסור לחקור בחופשיות עד 10 דקות (T1). על בדיקות היום (T2), העכברים שוב להציב בזירה, אך עם אובייקט מוכר ?...

Discussion

אורט היא שיטה יעילה וגמישה עבור הלומדים בלמידה ובזיכרון בעכברים. בעת הגדרת ניסוי, חשוב לקחת בחשבון מספר משתנים אשר יכולים להשפיע על התוצאה. כפי שפורט בתוצאות נציג, המתח של העכבר ישפיע על שני מרווח זמן ושמירה של חקר. ירידה בזמן חקירה עשויים להטות או מסיכת תוצאות אפליה מוחלטת ניתוח^2...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Open Field Box	Panlab/Harvard Apparatus	LE800SC	Available in grey, white, or black
ANY-maze	Stoelting Co.	60000	Behavior tracking system
EthoVisionXT 12	Noldus		Behavior tracking system; requires 3 point tracking
Video Camera	Any		Video camera should be mounted directly overhead of the apparatus
70% Ethanol	Fisher Scientific	BP2818-4	Prior to starting testing and in between trials, each object should be carefully cleaned. The floor and walls of the apparatus should also be cleaned.