Test de reconnaissance d’objet nouveau pour la recherche sur l’apprentissage et la mémoire chez les souris

Résumé

Le test de reconnaissance de l’objet (ORT) est un test simple et efficace pour évaluer l’apprentissage et la mémoire chez les souris. La méthodologie est décrite ci-dessous.

Résumé

Le test de reconnaissance de l’objet (ORT) est un test comportemental couramment utilisé pour l’étude des divers aspects de l’apprentissage et la mémoire chez les souris. L’ORT est assez simple et peut être complété sur une période de 3 jours : jour d’accoutumance, journée de formation et test day. Au cours de la formation, la souris est autorisée à explorer 2 objets identiques. Le jour du test, l’un des objets formation est remplacé par un nouvel objet. Parce que les souris ont une préférence innée pour la nouveauté, si la souris reconnaît l’objet familier, il passe la majeure partie de son temps à l’objet du roman. En raison de cette préférence innée, il n’y a pas besoin de renforcement positif ou négatif ou longtemps des horaires de formation. En outre, l’ORT peut également être modifiée pour de nombreuses applications. L’intervalle de conservation peut être raccourcie pour examiner la mémoire à court terme, ou allongé pour sonder la mémoire à long terme. Intervention pharmacologique peut être utilisée à différentes époques avant la formation, après la formation, ou avant le rappel d’enquêter sur les différentes phases de l’apprentissage(acquisition, consolidation précoce ou tardive ou en rappel). Dans l’ensemble, l’ORT est un test relativement faibles contraintes, efficace pour la mémoire chez les souris et est approprié pour la détection des changements neuropsychologiques après les manipulations pharmacologiques, biologiques ou génétiques.

Introduction

Le test de reconnaissance d’objet (ORT), également connu sous le nom du test de reconnaissance de nouveaux objet (NOR), est un moyen relativement rapide et efficace pour tester les différentes phases de l’apprentissage et la mémoire chez les souris. Il a été initialement décrite par Ennaceur et Delacour en 1988 et utilisé principalement dans les rats¹; Cependant, depuis lors, elle a été adaptée avec succès pour une utilisation à la souris^2,3,4,5,6,7. L’épreuve s’appuie sur aussi peu que trois sessions : session une accoutumance, un entraînement et un test session. La formation comprend simplement une exploration visuelle de deux objets identiques, alors que la session de test consiste à remplacer un des objets précédemment explorés avec un nouvel objet. Parce que les rongeurs ont une préférence innée pour la nouveauté, un rongeur qui se souvient de l’objet familier passera plus de temps à explorer les nouveaux objet^7,8,9.

Le principal avantage de l’ORT sur d’autres tests de mémoire de rongeurs, c’est qu’il repose sur la propension naturelle des rongeurs pour explorer la nouveauté⁸. Il n’y a donc pas besoin de nombreuses séances de formation ou tout renforcement positif ou négatif pour motiver le comportement. Cela signifie que l’ORT est beaucoup moins stressant, par rapport à d’autres essais^{10,11,12,13,14,15}et nécessite beaucoup moins de temps pour exécuter d’autres couramment utilisés mémoire teste, comme le labyrinthe aquatique Morris ou le labyrinthe de Barnes, qui peut prendre jusqu'à une semaine ou plus. Par conséquent, les conditions de l’ORT ressemblent davantage à celles utilisées dans l’étude de la cognition humaine, augmentant la validité écologique de l’essai au cours de nombreux autres tests mémoire rongeurs. De même, parce que ORT est une tâche simple rappel visuel, il a été avec succès adapté pour utilisation chez de nombreuses espèces, y compris les humains et les primates non humains, afin d’évaluer différents aspects entre les espèces de mémoire déclarative ^{2,16 ,},¹⁷. Enfin, l’ORT peut facilement être modifié afin d’examiner les différentes phases de l’apprentissage et la mémoire (c.-à-d., acquisition, consolidation ou rappel), afin d’évaluer les différents types de mémoire (par exemple, la mémoire spatiale), ou d’évaluer la rétention différentes intervalles (par exemple, mémoire à long terme à court terme vs ).

La polyvalence de l’ORT fournit une plate-forme pour des applications innombrables recherches. Des études peuvent faire utiliser des agents pharmacologiques pour perturber ou améliorer la mémoire. Variant le temps d’administration des médicaments avant ou après l’entraînement ou avant le test peut-il allusion à neural sous-jacent mécanismes qui conduisent à perturbé ou amélioré la mémoire^{6,18,19, 20}. d’une manière similaire, la technologie d’optogenetic peut être utilisé à ces mêmes divers moments à regarder l’activation/inhibition neuronale qui contribue aux différentes phases de l’apprentissage et la mémoire. L’ORT est également approprié pour déterminer les différences chez les animaux transgéniques, dans les études de la lésion, dans les modèles neurodégénératives ou dans vieillissement études^{21,22,23,24, 25 , 26 , 27 , 28}. le temps entre la formation et les tests, connu comme l’intervalle de conservation, pouvant être modifié pour évaluer un de ces changements sur le court et long terme mémoire²⁶. En fin de compte, l’ORT peut servir comme un outil pour étudier les changements pharmacologiques, génétiques et neurologiques à l’apprentissage et la mémoire, ou ces outils peuvent être utilisés pour étudier la base de l’apprentissage et la mémoire de l’ORT.

Protocole

toutes les procédures effectuées ici ont été soumis à et approuvé par l’animalier et Use committee et ont été réalisées suivant les directives des NIH.

1. sélection d’objets et de montage expérimental

1. Sélectionner les objets qui sont assez différentes pour être facilement distinguées par des souris, mais d’un égal degré de complexité (texture, forme, structuration de couleur et de luminosité, etc.) afin de minimiser tout risque induit par préférence d’objet qui peut-être biaiser les résultats (voir Ennaceur 2010 pour obtenir une description complète de l’objet choix ⁷).
   1. Essai de préférence innée et de discrimination (voir étapes 2 & 3).
   2. Utiliser des objets qui sont des moyennes sur les souris ou seulement légèrement plus grand pour encourager l’exploration ( Figure 1). Pour réduire la préférence induite, veiller à ce que les souris sont capables de grimper sur les deux objets ou aucun objet, bien que la capacité à grimper sur un objet peut accroître l’intérêt dans l’exploration (temps passé assis juste sur un objet ne sont pas compté vers le temps de l’exploration)
   3. Ont au moins 2 exemplaires de chaque objet. Toutefois, pour minimiser les éventuels indices d’odeur au cours des essais, ont au moins 3 de chaque objet, doublons pour la formation et l’autre pour les tests.
   4. Utiliser des objets en matériau incassable, comme la perte d’un objet dues aux dommages causés au cours de l’expérimentation pourraient interférer avec la continuité des tests et potentiellement provoquer des dommages ou des blessures à l’animal.
   5. Nettoyer soigneusement les objets avant et entre l’utilisation (vol/vol éthanol à 70 % est approprié).
2. Pour minimiser le stress de l’éclairage lumineux, utilisez un éclairage diffus, faible, avec le centre du labyrinthe allumé environ 20 lux. Utiliser une température et humidité analogue aux conditions de logement ordinaire. Si des souris sont déplacés d’une pièce d’habitation à une autre pièce pour l’expérience, s’acclimater souris à leur nouvelle salle pendant au moins 1 h avant d’utiliser chaque jour.
3. Poignée souris bien avant la formation. Parce que le test s’appuie sur la tendance naturelle des rongeurs pour explorer la nouveauté, de réduire tout stress ou anxiété de manipulation qui peut-être interférer avec leur désir d’explorer la scène et par la suite, les objets. Idéalement, manipuler souris 1 - 2 fois / jour pendant au moins 1 min, 1 à 2 semaines avant le test ^{15 , 29}.
4. Pour l’arène principale, utiliser une chambre carrée (environ 40 cm x 40 cm x 40 cm) en blanc ou noir, en plastique non poreux, contraste avec la couleur de la souris. Également utiliser une arène ronde éd. plus précisément, lorsque vous utilisez souris anxieux qui peuvent siéger dans les coins d’un carré aréna, une arène ronde peut être préférable d’encourager le comportement exploratoire ^{18 , 30}.
   1. Sur la journée de formation, placer 2 objets identiques sur la diagonale (c.-à-d. un dans le coin nord-ouest et un dans le coin sud-est). Si les objets sont trop légers et peuvent être déplacés par la souris, les fixer au sol. Amovible, œuvres de mastic de montage bien.
   2. Journée de test, utilisez la copie de 3 ^rd de chaque objet pour placer un objet familier et un nouvel objet sur la même diagonale que la journée de formation ( Figure 2).
   3. Contrebalancer l’utilisation de chaque ensemble d’objets, afin que chaque objet est utilisé également comme un objet familier et comme un objet nouveau. En outre, contrebalancer l’emplacement de l’objet nouveau pour chacun des 4 coins de l’arène. N’oubliez pas de noter quel diagonal est utilisée pour quel animal afin que la diagonale utilisée le jour de la formation est la même que celle utilisée le jour du test, pour chaque souris.
   4. Nettoyer soigneusement l’appareil et les objets à supprimer les repères de l’odeur avant et entre l’utilisation (vol/vol éthanol à 70 % est approprié).
5. Placer la caméra directement au-dessus de l’appareil pour une vision optimale de l’exploration. Utilisez exclusivement des logiciel avec détection de nez-point pour une analyse précise. Si vous utilisez le logiciel, capturer une image de fond avec les objets en place avant de commencer. Dans le logiciel, définissez la zone d’exploration pour environ 2-3 cm autour de l’objet.
6. Pour réduire l’interférence de l’expérimentateur, enregistrer le procès et il marquer plus tard. Le buteur aux conditions expérimentales de l’aveugle. S’inscrivant manuellement lors de l’expérience, faire en sorte que l’expérimentateur est plus de 1 mètre de l’arène et non visibles à la souris.
   Remarque : N’importe quel moment la souris passe assis sur l’objet sans vibrisses actives balayant ou l’inhalation ne compte pas comme du temps de l’exploration.
7. Définir exploration que lorsque la souris ' bruit s est pointé vers l’objet et dans 2-3 cm de l’objet, avec actives vibrisses balayant ou l’inhalation. Ne comptez pas n’importe quel moment, assis sur l’objet sans indication d’exploration active.

2. Des expériences de pilote nécessaire

1. tests de préférence induite
   1. pour l’accoutumance, retirez la souris de sa cage maison et placez-le au milieu de l’arène ouverte. Permettre à la souris pour explorer librement pendant 5 min.
   2. Sur Training Day (T1), placer 2 objets différents dans les quadrants en face de l’appareil, (c.-à-d., NW et coins SE). Retirez la souris de sa cage maison et placez-la au milieu de l’arène ouverte. Permettre l’exploration libre pour 10 min.
   3. Calculer l’indice de discrimination. S’il n’y a pas de préférence induite, l’indice de discrimination devrait être à ou proche de zéro. Tous les objets qui montrent des préférences ne doivent pas être utilisés pour ORT.
2. Aux tests à capacité de discrimination
   1. pour l’accoutumance, retirer les souris de sa cage maison et placez-le au milieu de l’arène ouverte. Permettre à la souris pour explorer librement pendant 5 min.
   2. Sur formation Session (T1), placer 2 objets identiques dans les quadrants opposés. Placez la souris au centre de l’arène et de laisser la souris Explorer pendant 10 min.
   3. Sur essai Session (T2), un lieu de l’objet utilisé dans T1 et un objet nouveau dans les quadrants opposés (NW et coins SE). Soixante minutes après T1, placez la souris au centre de l’arène et permettre une exploration libre pour 10 min.
   4. Calculer l’indice de discrimination. À un intervalle de rétention 60 min, l’indice de discrimination doit être au-dessus de 0,25.

3. Procédure expérimentale

1. 1. l' accoutumance Retirez la souris de sa cage maison et placez-la au milieu de l’arène ouverte et vide. Permettre gratuitement l’exploration de l’arène pendant 5 min. Une fois que la cage est vide, enregistrez-le pour une utilisation comme une cage tenue le lendemain.
   2. à la fin de 5 min, retirez la souris et placez dans une cage de rétention. Ne retournez pas la souris à sa cage originale, ou cela peut affecter le comportement des souris restants à tester.
   3. Nettoyer soigneusement l’appareil entre les souris à l’aide d’éthanol à 70 % vol/vol.
      Remarque : Au cours de l’habituation, anxiété-comme le comportement peut être évalué en calculant le temps passé dans le Centre (voir Prut & Belzung 2003 ³¹). Il s’agit d’une mesure utile lorsqu’on considère la durée pour le T1. Souris d’anxiété supérieure peuvent exiger une session de 10 min pour atteindre le critère minimal exploration.
2. Formation (T1)
   1. Placer deux objets identiques dans les quadrants en face de l’arène (c.-à-d., angle nord-est et coin sud-ouest).
   2. 24h après accoutumance, retirez la souris de sa cage maison et placez-le dans le centre de l’arène, équidistant entre les objets identiques 2.
   3. Permettre l’exploration libre pendant un minimum de 5 min. Si vous utilisez une souche de souris qui sont connus pour avoir de faible activité locomotrice ou exploration, (c'est-à-dire la plupart des souris n’atteignent pas un minimum de 20 exploration s des deux objets de 5 min, tel que mentionné dans les expériences-pilotes ou la littérature), prolonger le procès de 10 min pour tous les micro e dans la cohorte.
   4. à la fin du procès, retirez la souris et placez dans la cage de rétention. Une fois que la cage est vide, enregistrez-le pour une utilisation comme la cage de tenue sur les tests jour.
   5. Nettoyer soigneusement l’appareil et des objets entre les souris à l’aide d’éthanol à 70 % vol/vol.
3. Testing (T2)
   1. placer un objet utilisé au cours du T1 (par exemple, l’objet familier) et un objet nouveau dans les quadrants en face de l’arène. Utiliser les mêmes endroits que celui utilisé au cours de la T1 pour chaque souris.
   2. à la T1 à T2 intervalle de choix, retirer les souris de sa cage maison et placez-le dans l’arène du centre, équidistant de l’objet familier et l’objet du roman.
      Remarque : À un intervalle de conservation de 24 h, plupart des souris ne sera pas en mesure d’établir une distinction entre l’objet familier et roman (habituellement -0,2 < d2 < 0,2, comparativement à un positif de contrôle ³²). Si les tests pour les effets nootropiques, utiliser ce point dans le temps pour sonder pour l’amélioration de la mémoire. Pour sonder des déficits de mémoire, utilisez un intervalle de rétention plus court de n’importe où entre 20 min à 4 h, selon la souche de souris.
   3. Permettent une exploration libre pendant 10 min. À la fin du procès, retirez la souris et placez dans la cage de rétention.
4. Pour les T1 et T2, marquer les 5 premières minutes. Si la souris ne répond pas à l’époque d’exploration minimale de 20 s pour les deux objets, continuer marquant passé 5 min jusqu'à ce que l’exploration totale est supérieure à 20 s.

4. Analyse des données

1. Critères d’Exclusion
   1. pendant les deux formation (T1) et les tests (T2), calculer le temps total d’exploration pour les deux objets pour chaque session (e1 et e2). Plupart des souris devraient atteindre une exploration minimale totale des deux objets de 20 s par 5 min.
   2. Temps étendre T1 et T2 à 10 min pour les souches de souris qui ont exploration faible et ne répondent pas ce critère minimal de 5 min, comme observé au cours des essais pilotes.
   3. Score de comportement pendant 5 min ou au-delà de 5 min avant d’avoir atteint le critère minimum de 20 s.
   4. Si la souris ne parviennent pas à un minimum de 20 s d’exploration pour les deux objets pour T1 ou T2 à 10 min, exclure de l’analyse, il ne peut être confirmé qu’ils ont passé assez temps Explorer pour apprendre/discrimination.
2. Vs absolues Relative analyse
   Remarque : des formules différentes pour l’analyse et leur relation à l’autre peuvent être vu dans le tableau 1. E1
   1. calculer le temps total exploration au cours de la formation pour 2 objets identiques, où a1 et a2 sont les objets identiques.
      e1 = a1 + a2
   E2
   2. calculer le temps total exploration pendant l’essai pour l’objet familier (un) et le roman d’objet b.
      e2 = a + b
   Objet
   3. d1 calculer simplement comme le temps passé explorant le roman moins temps passée à explorer l’objet familier. La mesure absolue de la discrimination (d1) ne tient pas compte des différences de temps d’exploration entre la souris ou le traitement des groupes, bien que dans certaines circonstances, il peut être un plus sensible mesure ².
      d1 = b-a
   4. Calculer d2 comme le temps passé à explorer l’objet roman moins le temps passée à explorer l’objet familier divisé par temps de total exploration. La mesure plus couramment utilisée est une valeur de discrimination relative souvent désignée comme l’indice de discrimination (d2), qui n’est pas influencé par des différences dans le temps de l’exploration. Cela signifie que toutes les valeurs tombera entre -1 et + 1.
      d2 = d1/e2
   5. Vous pouvez également calculer la reconnaissance ou préférence index (d3) ³. C’est le temps passé à explorer l’objet roman divisé par la durée totale. Cela signifie que toutes les valeurs tombera entre 0 et 1. Il est souvent multiplié par 100 et utilisée comme valeur pourcentage.
      d3 = b/e2 * 100
3. Analyse statistique
   1. en utilisant les valeurs de discrimination moyenne pour chaque groupe, déterminer les performances de la mémoire à l’aide d’ANOVA à. Pour une analyse ultérieure, faire des comparaisons bidirectionnelle post hoc avec les groupes de contrôle positif/négatif et un État véhicule traité vs.

Résultats

Un montage expérimental général pour l’ORT est illustré à la Figure 2. Sur l’accoutumance souris jour (T0) sont placés dans l’arène vide pendant 5 min. vingt-quatre heures plus tard, les souris sont remis à la chambre avec 2 objets identiques et a permis d’explorer librement jusqu'à 10 min (T1). Sur les tests de jour (T2), les souris sont encore une fois placés dans l’arène, mais avec un objet familier et un nouvel objet et a permis d’e...

Discussion

L’ORT est une méthode efficace et souple pour étudier l’apprentissage et la mémoire chez les souris. Lorsque vous configurez une expérience, il est important de tenir compte d’un certain nombre de variables qui peuvent affecter le résultat. Tel que discuté dans les résultats représentatifs, la souche de souris affectera les deux intervalle de temps et rétention d’exploration. Une diminution des temps d’exploration peut fausser ou masque se traduit par une discrimination absolue analyse

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Open Field Box	Panlab/Harvard Apparatus	LE800SC	Available in grey, white, or black
ANY-maze	Stoelting Co.	60000	Behavior tracking system
EthoVisionXT 12	Noldus		Behavior tracking system; requires 3 point tracking
Video Camera	Any		Video camera should be mounted directly overhead of the apparatus
70% Ethanol	Fisher Scientific	BP2818-4	Prior to starting testing and in between trials, each object should be carefully cleaned. The floor and walls of the apparatus should also be cleaned.