Teste de reconhecimento de objeto romance para a investigação da aprendizagem e memória em ratos

Resumo

O teste de reconhecimento de objeto (ORT) é um ensaio simples e eficiente para a avaliação da aprendizagem e memória em camundongos. A metodologia é descrita abaixo.

Resumo

O teste de reconhecimento de objeto (ORT) é um ensaio comportamental comumente utilizado para a investigação de vários aspectos da aprendizagem e memória em camundongos. A ORT é bastante simples e pode ser concluída em 3 dias: dia de habituação, dia de treinamento e teste de dia. Durante o treinamento, o mouse é permitido explorar 2 objetos idênticos. No dia do teste, um dos objetos de treinamento é substituído com um novo objeto. Porque os ratos têm uma preferência inata por novidade, se o mouse reconhece o objeto familiar, ele passará a maior parte de seu tempo no romance objeto. Devido a esta preferência inata, não há nenhuma necessidade para reforço positivo ou negativo ou tempo horários de treinamento. Além disso, o ORT também pode ser modificada para numerosas aplicações. O intervalo de retenção pode ser encurtado para examinar a memória de curto prazo, ou alongado para sondar a memória de longo prazo. Intervenção farmacológica pode ser usada em vários momentos antes do treinamento, após o treinamento, ou antes da recordação para investigar as diferentes fases da aprendizagem (ou seja, aquisição, cedo ou tarde consolidação ou recordação). Em geral, a ORT é um teste relativamente baixo-stress, eficiente para a memória em ratos e é apropriado para a detecção de alterações neuropsicológicos após manipulação farmacológica, biológica ou genética.

Introdução

O teste de reconhecimento de objeto (ORT), também conhecido como o teste de reconhecimento objeto romance (NOR), é um meio relativamente rápido e eficiente para testar as diferentes fases da aprendizagem e memória em camundongos. Foi originalmente descrita por Ennaceur e Delacour em 1988 e usado principalmente em ratos¹; no entanto, desde então, tem sido adaptado com sucesso para uso em camundongos^2,3,4,5,6,7. O teste baseia-se em apenas três sessões: uma habituação sessão, sessão de um treinamento e teste de uma sessão. Treinamento envolve simplesmente a exploração visual de dois objetos idênticos, enquanto a sessão de teste envolve substituindo um dos objetos anteriormente explorados com um novo objeto. Porque os roedores têm uma preferência inata por novidade, um roedor que lembra o objeto familiar vai gastar mais tempo explorando o objeto romance^7,8,9.

A principal vantagem da ORT sobre outros testes de memória roedores é que baseia-se na tendência natural dos roedores para explorar novidade⁸. Portanto, não há nenhuma necessidade de inúmeras sessões de treinamento ou qualquer reforço positivo ou negativo para motivar o comportamento. Isso significa que a ORT é muito menos estressante, em relação a outros testes^{10,11,12,13,14,15}e requer significativamente testes de menos tempo para executar do que outros usados com memória, como o labirinto de água Morris ou labirinto de Barnes, que pode levar até uma semana ou mais. Consequentemente, as condições da ORT mais se assemelham aqueles usados no estudo de cognição humana, aumentando a validade ecológica do teste sobre muitos outros testes de memória de roedores. Da mesma forma, porque ORT é uma tarefa simples recordação visual, tem sido adaptado com sucesso para uso em numerosas espécies, incluindo os seres humanos e primatas não-humanos, para avaliar aspectos entre espécies diferentes de memória declarativa ^{2,16 ,17}. Finalmente, o ORT pode ser facilmente modificado para examinar as diferentes fases da aprendizagem e memória (ou seja, aquisição, consolidação ou recordação), para avaliar diferentes tipos de memória (por exemplo, memória espacial), ou para a avaliação de retenção diferente intervalos (ou seja, memória de longo prazo curto prazo vs ).

A versatilidade da ORT oferece uma plataforma para inúmeras aplicações. Estudos podem fazer uso de agentes farmacológicos para interromper ou melhorar a memória. Variar o tempo de administração de drogas antes ou depois do treino ou antes do teste pode dica no neural subjacente mecanismos que levam à interrompido ou reforçada memória^{6,18,19, 20}. de forma semelhante, a tecnologia de optogenetic pode ser usado para estes mesmo vários pontos de tempo para examinar a ativação/inibição neural que contribui para as diferentes fases de aprendizagem e memória. A ORT é também adequado para avaliar as diferenças em animais transgénicos, em estudos de lesão, modelos neurodegenerativas ou no envelhecimento estudos^{21,22,23,24, 25 , 26 , 27 , 28}. o tempo entre o treinamento e teste, conhecido como o intervalo de retenção, pode ser alterado para avaliar qualquer uma dessas alterações na memória de curto e longo prazo²⁶. Em última análise, a ORT pode ser usado como uma ferramenta para estudar alterações farmacológicas, genéticas e neurológicas de aprendizagem e memória, ou estas ferramentas podem ser usadas para estudar a base do aprendizado e memória no ORT.

Protocolo

todos os procedimentos realizados aqui foram apresentados ao aprovado pelo cuidado do Animal e usar o Comité e realizaram-se seguindo as diretrizes do NIH.

1. seleção de objetos e configuração Experimental

1. Selecione os objetos que são diferentes o suficiente para ser facilmente discriminados por ratos, mas tem um grau de complexidade (textura, forma, a padronização de cor e brilho, similar etc.) a fim de minimizar qualquer potencial induzido por preferência de objeto que pode influenciar os resultados (ver Ennaceur 2010 para obter uma descrição detalhada do objeto escolha ⁷).
   1. Teste de preferência inata e discriminação (consulte as etapas 2 & 3).
   2. Objetos de uso que são tamanho de rato ou apenas ligeiramente maior para incentivar a exploração ( Figura 1). Para reduzir a preferência induzida, certifique-se de que os ratos são capazes de subir em objetos ou em nenhum objeto, embora a habilidade de subir em um objeto pode aumentar o interesse na exploração (tempo gasto sentado sobre um objeto não é contado para tempo de exploração.)
   3. Tem pelo menos 2 cópias de cada objeto. No entanto, para minimizar possíveis pistas de odor durante o teste, ter pelo menos 3 de cada objeto, duplicatas para treinamento e outro para teste.
   4. Usar objetos feitos de material não-quebrável, como perda de um objeto devidos a danos durante a experimentação podem interferir com a continuidade de testes e potencialmente causar danos ou ferimentos ao animal.
   5. Limpe cuidadosamente os objetos antes e entre uso (etanol a 70% vol/vol é apropriado).
2. Para minimizar o stress de iluminação brilhante, use iluminação difusa, baixa, com o centro do labirinto iluminado por volta de 20 lux. Use uma temperatura e umidade semelhante às condições de habitação regular. Se os ratos estão sendo movidos de uma sala de habitação para um quarto diferente para o experimento, aclimatar ratos para sua nova sala pelo menos 1 h antes da utilização de cada dia.
3. Pega ratos bem antes do treinamento. Porque o teste baseia-se na tendência natural de roedores para explorar a novidade, reduza qualquer stress ou ansiedade de manipulação que pode interferir com o seu desejo de explorar a arena e, posteriormente, os objetos. Idealmente, lidar com ratos 1 - 2 vezes / dia durante pelo menos 1 min, 1 a 2 semanas antes do teste de ^{15 , 29}.
4. Para a arena principal, usar uma câmara quadrada (cerca 40 x 40 cm x 40 cm) feitos de branco ou preto, plástico não-porosas, contrastava com a cor do mouse. Como alternativa, usar uma arena redonda Ed. especificamente, quando usando ratos ansiosos que podem sentar-se nos cantos de um quadrado arena, uma arena redonda pode ser preferível para encorajar o comportamento exploratório ^{18 , 30}.
   1. Em dia de treinamento, coloque 2 objetos idênticos na diagonal (ou seja, um no canto do nanowatt e um no canto sudeste). Se os objetos são muito leves e podem ser movidos pelo mouse, fixá-las no chão. Removível montagem massa funciona bem.
   2. Para dia de teste, use a cópia de 3 ^rd de cada objeto para colocar um objeto familiar e um novo objeto na mesma diagonal como o dia de treinamento ( Figura 2).
   3. Contrabalançar o uso de cada conjunto de objetos para que cada objeto é usado igualmente como um objeto familiar e como um objeto de romance. Além disso, contrabalançar a localização do objeto romance a cada um dos 4 cantos da arena. Certifique-se de observar qual diagonal é usado para qual animal para que a diagonal usado sobre o dia de treinamento é o mesmo usado no teste dia, para cada rato.
   4. Limpe cuidadosamente o aparelho e objetos para remover pistas de odor antes e entre uso (etanol a 70% vol/vol é apropriado).
5. Coloque a câmara aérea diretamente do aparelho para a exibição ideal de exploração. Só uso software com deteção de nariz-ponto para análise precisa. Se utilizar o software, capture uma imagem de fundo com os objetos no lugar antes de começar. No software, definir a área de exploração para ser aproximadamente 2-3 cm ao redor do objeto.
6. Para reduzir a interferência do experimentador, gravar o julgamento e marcá-lo mais tarde. Cega o marcador para as condições experimentais. Se manualmente marcando durante o experimento, certifique-se de que o experimentador é mais de 1 metro da arena e não é visível para o mouse.
   Nota: Quando o mouse passa sentado no objeto sem ativo vibrissae varrendo ou cheirando não conta como tempo de exploração.
Exploração de
7. definir como quando o mouse ' ruído s está apontado para o objeto e dentro de 2 a 3 cm do objeto, com ativo vibrissae varrendo ou cheirando. Não contam qualquer hora sentado no objeto sem indicação de exploração activa.

2. Necessário experiências piloto

1. teste de preferência induzida
   1. para habituação, remover o mouse de sua gaiola em casa e colocá-lo no meio da arena aberta. Permitir que o mouse para explorar livremente por 5 min.
   2. No dia de treinamento (T1), coloque 2 objetos diferentes em quadrantes opostos do aparelho, (i.e., NW e SE cantos). Remova o mouse de sua gaiola em casa e colocá-lo no meio da arena aberta. Permitir a livre exploração de 10 min.
   3. Calcular o índice de discriminação. Se não houver nenhuma preferência induzida, o índice de discriminação deve ser em ou perto de zero. Quaisquer objetos que mostram a preferência não devem ser usados para ORT.
2. Testes para capacidade de discriminação
   1. para habituação, remover o rato de sua gaiola em casa e colocá-lo no meio da arena aberta. Permitir que o mouse para explorar livremente por 5 min.
   2. Na sessão de treino (T1), coloque 2 objetos idênticos em quadrantes opostos. Coloque o mouse no centro da arena e permitir que o mouse para explorar durante 10 min.
   3. Em teste sessão (T2), lugar de objeto usado durante T1 e um objeto romance em quadrantes opostos (i.e., NW e SE cantos). Sessenta minutos após T1, posicione o mouse no centro da arena e permitir a livre exploração de 10 min.
   4. Calcular o índice de discriminação. Em um intervalo de retenção de 60 min, o índice de discriminação deve ser acima de 0,25.

3. Procedimento experimental

1. habituação
   1. remover o mouse de sua gaiola em casa e colocá-lo no meio da arena aberta e vazia. Permita a livre exploração da arena por 5 min. Uma vez que a gaiola em casa está vazia, salvá-lo para uso como uma gaiola de exploração no dia seguinte.
   2. No final de 5 min, retire o mouse e coloque em uma gaiola de exploração. Não devolva o rato da gaiola original, ou isso pode afetar o comportamento dos ratos restantes a serem testadas.
   3. Limpe cuidadosamente o aparelho entre ratos usando etanol a 70% vol/vol.
      Nota: Durante a habituação, comportamento de ansiedade pode ser avaliado calculando o tempo gasto no centro (ver Prut & Belzung 2003 ³¹). Esta é uma métrica útil ao considerar o comprimento de tempo para T1. Ratos de ansiedade mais elevados podem exigir uma sessão de 10 min para alcançar o critério mínimo de exploração.
2. Formação (T1)
   1. Coloque dois objetos idênticos em quadrantes opostos da arena (i.e., canto NE e canto SW).
   2. 24 h após a habituação, remover o mouse de sua gaiola em casa e coloque-o no centro da arena, equidistante de 2 objetos idênticos.
   3. Permitir a livre exploração por um período mínimo de 5 min. Se usando uma cepa de ratos que são conhecidos por terem baixa atividade locomotora ou exploração, (ou seja, maioria dos ratos não atingir um mínimo de 20 exploração de s dos dois objetos por 5 min, conforme observado em experiências piloto ou literatura), estender o julgamento de 10 min para todos mic e na coorte.
   4. No final do julgamento, retire o mouse e coloque na gaiola exploração. Uma vez que a gaiola em casa está vazia, salvá-lo para uso como a gaiola de exploração em testes dia.
   5. Limpe cuidadosamente o aparelho e objetos entre ratos usando etanol a 70% vol/vol.
3. Testing (T2)
   1. Coloque um objeto usado durante T1 (ou seja, o objeto familiar) e um objeto romance em quadrantes opostos da arena. Usar os mesmos locais como usado durante T1 para cada mouse.
   2. Em the T1 para T2 intervalo de escolha, remover o rato de sua gaiola em casa e colocá-lo na arena central, equidistante do objeto familiar e o romance objeto.
      Nota: Em um intervalo de retenção de 24 h, a maioria dos ratos não será capazes de discriminar entre o objeto familiar e romance (geralmente-0.2 < d2 < 0.2, em comparação com um positivo controle ³²). Se testando efeitos nootropic, use este ponto de tempo de investigação para o realce da memória. Para sondar para déficits de memória, use um intervalo de retenção mais curto de algum lugar entre 20 min para 4h, dependendo da cepa de rato.
   3. Permitir a exploração livre por 10 min. No final do julgamento, retire o mouse e coloque na gaiola exploração.
4. Para T1 e T2, marcar o primeiro 5 min. Se o mouse não satisfaz o tempo mínimo de exploração de 20 s para ambos os objetos, continuar marcando passado 5 min até exploração total for superior a 20 s.

4. Análise de dados

1. Os critérios de exclusão
   1. durante ambos treinamento (T1) e teste (T2), calcular o tempo de exploração total para os dois objetos para cada sessão (e1 e e2). A maioria dos ratos devem alcançar uma exploração mínima total para ambos os objetos de 20 s por 5 min.
   2. Tempo estender T1 e T2, a 10 min para cepas de ratos que têm baixa exploração e não satisfazem este critério mínimo por 5 min, como observado durante o teste piloto.
   3. Marcar o comportamento por 5 min ou para além de 5 min até atingirem o critério mínimo 20 de s.
   4. Se ratos não atingir um mínimo de s 20 da prospecção para ambos os objetos ou T1 ou T2 em 10 min, excluir da análise, como não pode ser confirmado gastaram bastante tempo explorando para aprender/discriminar.
2. Absolutos vs análise relativa
   Nota: fórmulas diferentes para análise e sua relação com o outro podem ser vistas na tabela 1. E1
   1. calcular o tempo de exploração total durante o treino de 2 objetos idênticos, onde a1 e a2 são os objetos idênticos.
      e1 = a1 + a2
   E2
   2. calcular como o tempo total de exploração durante o teste para o objeto familiar (a) e o romance objeto b.
      e2 = a + b
   3. Calcular d1 simplesmente como o tempo gasto explorando o romance objeto menos tempo a explorar o objeto familiar. A medida de discriminação absoluta (d1) não leva em conta as diferenças em vez de exploração entre os ratos ou tratamento grupos, embora em determinadas circunstâncias, pode ser uma medida mais sensível ².
      d1 = b-a
   4. Calcular d2 como o tempo passado a explorar o objeto novo menos o tempo a explorar o objeto familiar dividido pelo tempo total exploração. A medida mais comumente usada é um valor de discriminação relativa, muitas vezes referido como o índice de discriminação (d2), que não é influenciado pelas diferenças no tempo de exploração. Isto significa que todos os valores vão cair entre -1 e + 1.
      d2 = d1/e2
   5. , Alternativamente, calcular o índice (d3) de reconhecimento ou preferência ³. Este é o tempo gasto a explorar o novo objeto dividido pelo tempo total. Isto significa que todos os valores cairão entre 0 e 1. Muitas vezes é multiplicado por 100 e usado como valor de percentagem.
      d3 = b/e2 * 100
3. Análise estatística
   1. usando os valores de discriminação média para cada grupo, determinar o desempenho da memória usando o One-Way ANOVA. Para posterior análise, fazer comparações bidirecional post hoc com os grupos de controle positivo/negativo e condição do veículo Tratado vs.

Resultados

Uma configuração geral e experimental para a ORT é mostrada na Figura 2. Na habituação ratos dia (T0) são colocados na arena vazia por 5 min. de vinte e quatro horas depois, os ratos são colocados de volta na câmara com 2 objetos idênticos e permitiu explorar livremente por até 10 min (T1). Em testes dia (T2), os ratos são novamente colocados na arena, mas com um objeto familiar e um objeto de romance e permitiu explorar para até 10 min. O interva...

Discussão

A ORT é um método eficiente e flexível para estudar aprendizagem e memória em camundongos. Ao configurar um experimento, é importante considerar uma série de variáveis que podem afetar o resultado. Conforme discutido nos resultados representativos, a cepa de rato afetará ambos intervalo de tempo e de retenção de exploração. Uma diminuição no tempo de exploração pode inclinar ou máscara resulta em uma discriminação absoluta análise^2,3,

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Open Field Box	Panlab/Harvard Apparatus	LE800SC	Available in grey, white, or black
ANY-maze	Stoelting Co.	60000	Behavior tracking system
EthoVisionXT 12	Noldus		Behavior tracking system; requires 3 point tracking
Video Camera	Any		Video camera should be mounted directly overhead of the apparatus
70% Ethanol	Fisher Scientific	BP2818-4	Prior to starting testing and in between trials, each object should be carefully cleaned. The floor and walls of the apparatus should also be cleaned.