JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

עבודה זו מציגה שיטה במהירות ובמדויק לכמת את הפיגמנטציה הבטן של תסיסנית melanogaster באמצעות ניתוח תמונה דיגיטלית. שיטה זו מייעלת את ההליכים בין רכישת פנוטיפ וניתוח נתונים וכולל הדגימה הרכבה, רכישת תמונה, מיצוי ערך פיקסל, ומדידה תכונה.

Abstract

פיגמנטציה היא תכונה פשוטה מבחינה מורפולוגית אך משתנה מאוד שלעתים קרובות יש לה משמעות מסתגלת. היא שימשה באופן נרחב כמודל להבנת ההתפתחות והאבולוציה של פנוטיפים מורפולוגיים. פיגמנטציה בטן ב תסיסנית melanogaster היה שימושי במיוחד, המאפשר לחוקרים לזהות את loci כי ביסודו inter- ו intrapecific וריאציות במורפולוגיה. עם זאת, עם זאת, d. melanogaster פיגמנטציה בטן כבר assayed במידה רבה מבחינה איכותית, באמצעות ניקוד, ולא כמותי, אשר מגביל את צורות ניתוח סטטיסטי שניתן להחיל על נתונים פיגמנטציה. עבודה זו מתארת ​​מתודולוגיה חדשה המאפשרת כימות של היבטים שונים של דפוס פיגמנטציה הבטן של המבוגר ד melanogaster . הפרוטוקול כולל הדגימה הדגימה, לכידת תמונה, מיצוי נתונים, וניתוח. כל התוכנה המשמשת לכידת תמונות וניתוח מאקרו תכונהשנכתב עבור ניתוח תמונות קוד פתוח. היתרון של גישה זו היא היכולת למדוד במדויק תכונות פיגמנטציה באמצעות מתודולוגיה כי הוא לשחזור מאוד על פני מערכות הדמיה שונות. בעוד הטכניקה שימשה למדידת וריאציה של דפוסי הפיגמנטציה טרגאל של המבוגר ד melanogaster , המתודולוגיה היא גמישה וישימה רחב על דפוסי פיגמנטציה במספר עצום של אורגניזמים.

Introduction

פיגמנטציה מראה וריאציה פנוטיפית עצומה בין מינים, אוכלוסיות, יחידים, ואפילו בתוך אנשים במהלך אונטוגני 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . למרות שיש מספר רב של מחקרים על פיגמנטציה במגוון רחב של בעלי חיים, פיגמנטציה אולי למד הכי טוב ב תסיסנית melanogaster , שבו מלוא העוצמה של גנטיקה מולקולרית שימש כדי להבהיר את המנגנונים ההתפתחותיים והפיזיולוגיים להסדיר פיגמנטציה וכיצד מנגנונים אלה מתפתחים 1 , 6 . הרבה ידוע על הגנים המסדירים את הסינתזה הביוכימית של פיגמנטים בד. מלנוגאסטר 7 , 8 והגנים השולטים בדיאטה הזמני והמרחביהפצה של ביוסינתזה זו 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . יתרה מזאת, מיפוי גנטי זיהה את הלוקים הגנטיים שעמדו ביסוד ההבדלים הבין-בין-אישיים בפיגמנטציה ב- d melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 . כמו כן נבדקו היחסים בין פיגמנטציה לבין תכונות פליאוטרופיות, כגון התנהגות 18 , 19 וחסינות 19 , 20 , כמו גם המשמעות האדפטיבית של דפוסי פיגמנטציה 15 , 21 , 22 . ככזה, פיגמנטציה ב מלנוגאסטר התפתחה כמו מ 'חזק אך פשוטOdel לפיתוח ואבולוציה של פנוטיפים מורכבים.

פיגמנטציה אצל מבוגרים ד מלנוגאסטר מאופיין על ידי דפוסים שונים של מלניזציה על פני הגוף, במיוחד על הכנפיים ועל החזה הגב והבטן. זה הפיגמנטציה של כל צלחת cuticular (tergite) על הבטן הגב, עם זאת, כי קיבל את תשומת הלב המחקרית ביותר. יש וריאציה ניכרת פיגמנטציה זו ( איור 1A- F ), בגלל הן גנטי 17 , 23 ו 24 סביבתיים , 25 גורמים. לציפורן של tergite הבטן מורכב תאים התפתחותיים הקדמי אחורי ( איור 1G ), שכל אחד מהם ניתן לחלק נוסף בהתאם בהתאם פיגמנטציה וקישוט 26 . התא הקדמי כולל שישה cuticleסוגים (a1-a6), ואת התא האחורי כולל שלושה (p1-p3) ( איור 1G ). מבין אלה, את p1, p2, ו a1 cuticle הם בדרך כלל מקופל תחת tergite ב abdomens un-stretched כך שהם מוסתרים. הציפורן הנראית לעין מאופיינת על ידי רצועה של פיגמנטציה כבדה, הנקראת כאן "רצועת פיגמנט", המורכבת מטיפוסים מסוג A4 (שעיר עם זיפים מתונים) ו- A5 (שעיר עם זיפים גדולים), עם הקצה האחורי של הלהקה פיגמנט אינטנסיבי יותר מהקצה הקדמי ( איור 1G ). קדמית להקה זו הוא אזור של פיגמנטציה קלה שעיר, אשר יש זיפים האחורי (a3), אבל לא anteriorly (a2). שינוי בפיגמנטציה בין זבובים הוא ציין הן את עוצמת הפיגמנטציה ואת רוחב של פיגמנט הלהקה. באופן כללי, וריאציה היא הגדולה ביותר במגזרים האחורי ביותר (קטעים הבטן 5, 6, ו -7) והוא נמוך יותר קטעים הקדמי יותר (הבטן se3 ו -4). יתר על כן, יש דימורפיזם מיני ב d melanogaster פיגמנטציה, עם זכרים בדרך כלל יש פיגמנטציה מלאה 5 ו tergites הבטן ( איור 4 ג ).

במרבית המחקרים של פיגמנטציה בטנית ב- d melanogaster , הפיגמנטציה טופלה כמאפיין קטגורי או סודי, כאשר הדפוס נמדד איכותית 27 , 28 , 29 או חצי כמותי בסולם 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . שיטות אלה סובלות בהכרח מחוסר דיוק, ומכיוון שהן מסתמכות על הערכה סובייקטיבית של פיגמנטציה, קשה להשוות את הנתונים בין המחקרים. מחברים אחדים כימו את הממדים המרחביים של פיגמנטציה 38 , 39 , את עוצמת הפיגמנטציה של סוג מסוים של קוטיקולה 23 , 25 , 39 , 40 , או את העוצמה הממוצעת של פיגמנטציה על פני הטרגיט הבטן כ -41 , 42 , 43 . אף על פי כן, שיטות כימות אלה אינן מודדות הן את האינטנסיביות והן את ההתפלגות המרחבית של הפיגמנטציה הבבטית בו זמנית, ולכן אינם לוכדים את הניואנסים של האופן שבו הפיגמנטציה משתנה על פני הבטןטחון. יתר על כן, כמה שיטות כימות אלה 38 , 41 , 42 , 43 דורשים את הנתיחה ואת הרכבה של cuticle הבטן. זה גם זמן רב הורס את המדגם, מה שהופך אותו זמין עבור ניתוחים מורפולוגיים נוספים. ככל שהבנת ההתפתחות והאבולוציה של הפיגמנטציה הבטן מעמיקה, כלים מתוחכמים יותר כדי למדוד במהירות ובדייקנות הן את ההתפלגות המרחבית והן את עוצמת הפיגמנטציה.

המטרה הכוללת של שיטה זו היא לנצל את ניתוח התמונה הדיגיטלית כדי להשיג מדידה חוזרת ומדויקת יותר של פיגמנטציה הבטן ד melanogaster . המתודולוגיה כוללת שלושה שלבים. ראשית, הזבוב הבוגר הוא רכוב ללא הרס, ואת התמונה הדיגיטלית של הבטן הגב נלקח. שנית, באמצעות מאקרו ImageJ, המשתמשמגדיר פס קדמי קדמי של פיקסלים המשתרע הקדמי של a2 לציפורן האחורי של a5 cuticle (קופסה ירוקה, איור 1G ) על שני קטעים הבטן השלישי והרביעי. ערך הפיקסל הממוצע לאורך רוחב הרצועה מחולק לאורך ציר הזמן, ומייצר פרופיל המבחין בחלוקה המרחבית ובעוצמת הפיגמנטציה כפי שהיא משתנה מהחלק הקדמי לחלק האחורי של הטרגיט. שלישית, סקריפט R משמש לתיאור פרופיל הפיגמנטציה במתמטיקה באמצעות קו מעוקב. התסריט R משתמש בשפכים ובנגזרות הראשון והשני שלו כדי לחלץ את רוחב הציפורן a2-a5, את רוחב רצועת הפיגמנט ואת רמות הפיגמנט המקסימליות והמינימליות. השיטה ולכן מכמת הן את המאפיינים המרחביים ואת עומק הפיגמנטציה בטן.

מתודולוגיה זו מכמתת את הפיגמנטציה של הטרגיטים הבטן השלישית והרביעית,אשר היו מוקד של מחקרים קודמים רבים 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , או באופן בלעדי או בשילוב עם tergites האחורי. אם כי פחות משתנה מאשר טרגיטים הבטן החמישית והשישית, tergites השלישי והרביעי אינם פיגמנטציה לחלוטין אצל גברים, כך פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על גברים ונשים כאחד. עם זאת, כפי שמוצג כאן, פרוטוקול ניתן להשתמש כדי למדוד פיגמנטציה של 5 ו tergites הבטן הנקבות אצל נקבות. יתר על כן, שינויים קלים של סקריפטים המשמשים כדי לחלץ את המאפיינים של פרופיל פיגמנטציה צריך לאפשר את השיטה לשמש לכמת וריאציה פיגמנטציה במגוון רחב של אחריםאורגניזמים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. הדגימה הרכבה

הערה: חנות זבובים מתים באתנול 70% במים לפני הדמיה.

  1. יוצקים 10 מ"ל של אגר 1.25% מומס במים רותחים ב 60 מ"מ x 15 מ"מ צלחת פטרי ולאפשר לו להגדיר.
  2. תחת מיקרוסקופ לנתח, להשתמש זוג מלקחיים קנס לעשות ~ 20 מ"מ ong, 2 מ"מ רחב, 1 מ"מ חריץ עמוק על פני השטח של הג'ל. בעזרת מלקחיים בסדר, להטביע את הצד הגחון של זבוב מבוגר בחריץ, עם הצד הגבי של זבוב הקרנת מעל הג'ל.
    הערה: את רופפת של ג 'ל מאפשר repositioning קל מבלי לפגוע בדגימה. אותו חריץ יכול לשמש עבור מספר רב של דגימות, אם כי הוא יהפוך מלוכלך, שבור למעלה, ו שמיש עם הזמן. לאחר מכן המשתמש יכול ליצור חריץ נוסף באותו ג'ל. כל צלחת יכולה לשמש תמונה ~ 200 זבובים.
  3. לגמרי לכסות את הדגימה באתנול 70% במים כדי להפחית את כל השתקפויות האור מן השעווה דונגי ולמנוע נזק באגף durמניפולציה הדגימה.

2. הגדרת מיקרוסקופ

הערה: תמונות נרכשות באמצעות היקף לנתח, בסיס האור המועבר, מצלמה דיגיטלית, מקור אור קר מקורר למחשב רץ תמונה רכישת תוכנת שליטה. הוראות תוכנה ספציפיות ל- Micro-Manager v1.4.20 44 , שהיא תוכנת קוד פתוח המשלבת ImageJ 45 .

  1. הפעל את המיקרוסקופ, מצלמה דיגיטלית, מקור אור כפול מקורר קר, המחשב.
  2. הפעל את תוכנת לכידת התמונות כדי לפתוח חלון Micro-Manager וחלון ImageJ. בחלון ImageJ לחץ על "Image"> "Type"> "8-bit" כדי להגדיר את כל התמונות כ -8 סיביות. לחץ על "Live" בחלון Micro-Manager כדי לפתוח חלון "Snap / Live" המציג תצוגה מקדימה בזמן אמת מהמצלמה.
    1. מקסם את הגודל של "הצמד / Live" חלון אם neמזור. בחר "Grayscale" בתפריט הנפתח "מצב תצוגה" בכרטיסייה "ניגודיות" בחלון Micro-Manager.
  3. הפעל את מקור האור הקר לעוצמה המקסימלית שלו ומקם את הקצות של כל gooseneck על 120 מ"מ מהבמה, אחד בצד שמאל ואחד בצד ימין.
    הערה: משתמשים יכולים גם להשתמש מאירה חדה, אם כי זה עשוי ליצור טבעת של האור המוחזר סביב הבטן לעוף.
  4. באופן ידני את הגדלת המיקרוסקופ ל 60X כך שדה הראייה לוכדת שטח כ 3 מ"מ קוטר על הבמה.
  5. מניחים 2 מ"מ בשלב מיקרומטר על הבמה (החלפת הרקע לבן אם יש צורך). תוך כדי צפייה בתצוגה מקדימה חיה, התמקדו במיקרומטר הבמה והתאימו את החשיפה בחלון Micro-Manager על-ידי הזנת זמן החשיפה ב- ms בתיבה "חשיפה".
  6. כדי לכייל את המרחב באופן מרחבי, בחר את "קו ישר" כלי tהוא חלון ImageJ ו לצייר קו אורך מיקרומטר הבמה. בחלון ImageJ לחץ על "Analyse"> "Set Scale" כדי לפתוח את החלון "Set Scale", הזן את אורך המיקרומטר במיקרומטר בתיבה "מרחק ידוע" והזן "מיקרומטר" ביחידה "Unit of length" קופסא.
    1. ראה כי "הגדר קנה מידה" החלון ואז מציג את קנה המידה של "פיקסלים / מיקרומטר." רשום לעצמך את הסולם ולחץ על "אישור".
  7. בחלון "הצמד / חי", לחץ על "עצור" ולאחר מכן על "הצמד" כדי ללכוד תמונה של מיקרומטר הבמה.
  8. שמור את התמונה כ- TIFF בגווני אפור של 8 סיביות כדי להבטיח את היכולת לבצע כיול מרחבי של התמונות שוב, במידת הצורך. בחלון ImageJ לחץ על "File"> "שמירה בשם"> "Tiff ..." ציין היכן לשמור את הקובץ בדפדפן הקובץ, תן שם לקובץ ולחץ על "שמור".
  9. העבר את הבמה לשחור ומקוםצלחת פטרי מחזיק זבוב רכוב אגר (מדרגות 1.1-1.2) על הבמה.
  10. להסתכל דרך המיקרוסקופ ולמקם את הזבוב כדי להבטיח את קו האמצע הגבי הוא ישר על מנת להציג בצורה הטובה ביותר את דפוס פיגמנטציה. להעביר כל כנפיים ונספחים כדי להבטיח את הנוף של הבטן הוא unobstructed. אם הציפורן פיגמנט (A2-A5) אינו גלוי, לסחוט את הבטן רוחבית עד שהוא (אם כי הבטן של זבובים מאוחסן באתנול 70% במים למתוח, כך שזה לא הכרחי בדרך כלל).
    הערה: בעת מיקום הזבוב, ייתכן שהמשתמש יצטרך להשתמש בהגדלה נמוכה יותר (20X). ההגדלה חייבת להיות מוחזרת ל 60X לפני שתמשיך.
  11. מתמקדים באופן ידני בבטן הגב של הזבוב. כוונן ידנית את הקצות של מקור האור כדי למזער את הצללים ואת ההשתקפות על הבטן הגבי.
  12. תוך כדי צפייה בתצוגה מקדימה חיה על מסך המחשב, ושימוש היסטוגרמה ערך פיקסל בכרטיסייה "ניגודיות" של חלון Micro-Manager,כוונן את החשיפה כמתואר בשלב 2.4 כדי למקסם את טווח ערכי הפיקסלים של תמונת התצוגה המקדימה.
  13. הסר את לטוס צלחת פטרי ולהחליף אותם עם פלט LED (ספקטרלי של 430-660 ננומטר) מחובר מטר מתח, מרוכז בתחום התצוגה באותו מיקום כמו זבוב. השתמש מטר LED מתח כמו מד אור 46 ולהקליט את המתח שנוצר על ידי האור המכה את LED (~ 125 mV).
    הערה: מד ה - LED והמתח משמשים כדי להבטיח שרמת האור תהיה קבועה במהלך הפעלות הדמיה מרובות בניסוי יחיד.
  14. למשך הניסוי, אל תשנה עוד את המיקום או העוצמה של מקור האור, את ההגדלה של המיקרוסקופ, או את החשיפה של המצלמה.

3. הדמיה הדמיה

  1. מניחים צלחת פטרי מחזיק זבוב רכוב אגר (מדרגות 1.1-1.3) על הבמה מיקרוסקופ שחור. להתאים את המיקום של הזבוב, כך השלישי וארבעH קטעים הבטן גלויים קו האמצע הגבי הוא ישר, כפי שמתואר בשלב 2.9. ודא כי ההגדלה היא 60x לפני שתמשיך.
  2. התמקדו באופן ידני במיקרוסקופ כך שהטרגיות הבטן השלישית והרביעית נמצאות בפוקוס. השתמש בתוכנה ללכידת תמונות כדי לרכוש תמונה כ- TIFF בגווני אפור בגודל 8 סיביות, כמתואר בשלב 2.6.
    הערה: התמונה יכולה להיות שנתפסו בצבע ולאחר מכן להמיר לגווני אפור לניתוח.
  3. שמור את התמונה בשם "SESH000_sampleID.tiff", כמתואר בשלב 2.7.
    הערה: כאן, [SESH] הוא קבוע, [000] הוא מספר הפגישה והוא משתנה אך חייב להיות באורך של שלוש ספרות, ו- [sampleID] הוא מה שהמשתמש מעוניין, למרות שהוא אינו חייב להכיל תווים נוספים (_) חייב להיות באורך קבוע. [Sampleid] צריך לכלול פרטים על הגורמים המשמשים בניתוח של נתוני הפיגמנטציה ( למשל, טמפרטורה או שושלת), מופרדים על ידי אלפבית ייחודי שאינו מובחןאופי, כגון מקף (-). זה מאפשר גורמים אלה ניתן לנתח בקלות מתוך [מדגם] באמצעות תוכנה סטטיסטית סטנדרטית.
  4. הסר את צלחת פטרי מהבמה ולהחליף את הזבוב עם הדגימה הבאה. חזור על שלבים 3.1-3.3 עד שכל הדגימות צולמו, ללא כוונון נוסף של רמות התאורה, ההגדלה או החשיפה.

4. הדמיה על פני מספר מושבים

  1. אם יש צורך לצלם תמונות על מספר פעילויות באתר, לשמור על עוצמת האור, החשיפה וההגדלה על פני הפעלות באתר. בתחילת כל הפעלה, בדוק את הכיול המרחבי של המצלמה (שלב 2.4) ואת עוצמת האור בשלב (כפי שנמדד על ידי מד LED / מתח, שלב 2.12).
  2. לכוד ולשמור תמונה של מיקרומטר הבמה (צעדים 2.5-2.7) כדי להבטיח את היכולת מרחבית לכייל את התמונות שוב, במידת הצורך.
  3. השתמש לפחות 15 דגימות שליטה באופן אקראי לדמיין אותם בכל מפגש alloW עבור איתור וחיסול של ההשפעות הפגישה. ודא שבדוגמאות בקרה כפולות בין הפעלות יש אותו [דגימה] אך שונה [SESH000].
    הערה: דגימות הבקרה הן זבובים שנאספו, מאוחסנים ומוטבעים באופן זהה לדגימות ניסיוניות, אך הם משוחזרים מחדש במהלך הפעלות. המספר המדויק של דגימות בקרה יהיה תלוי בהגדרת הניסוי של המשתמש. ראה את הדיון לפרטים נוספים.

5. ניתוח תמונה

הערה: ניתוח תמונה מתבצע ImageJ 45 ומשתמש "מדידה של Pigmentation.ijm," מאקרו המסופק כקובץ משלים.

  1. מניחים את כל התמונות כדי לנתח באותה תיקייה.
  2. הפעל את ImageJ ולהפעיל את "מדידה של Pigmentation.ijm" מאקרו על ידי לחיצה על "Plugins"> "מאקרו"> "הפעלה", בחירת "מדידה של Pigmentation.ijm" בדפדפן הקובץ, ולחיצה על "לִפְתוֹחַ."
    הערה: כל השלבים הבאים נמצאים בתוך המאקרו. כל צעד הוא פקודת מאקרו אישית.
  3. שים לב כי תיבת הדו שיח "פעולה נדרשת" נפתחת, וציין "בחר את התיקייה שבה מאוחסנות תמונות." לחץ על "אישור" ולהשתמש בדפדפן הקובץ כדי לבחור את התיקייה המכילה את התמונות ולאחר מכן לחץ על "בחר".
  4. שים לב כי תיבת הדו שיח "פעולה נדרשת" תיפתח, ותציין "בחר את התיקייה שבה ברצונך לשמור את הנתונים." לחץ על "אישור" והשתמש בדפדפן הקבצים כדי לבחור את התיקייה הרצויה לשמירת פרופילי הפיגמנטציה. לחץ על "בחר".
  5. שים לב שתיפתח תיבת דו-שיח שתשאל "כמה תווים במזהה המדגם שלך?" בתיבה נתוני קלט, הזן את מספר התווים ב- [SampleID], כמפורט בשלב 3.3, ולחץ על "אישור".
  6. שים לב שתיפתח תיבת דו-שיח שתשאל "עד ​​כמה החזר ה- ROI שלך גדול?" בתיבה נתוני קלט, הזן את רוחב הפיקסלים של החלון הקדמי,רצועה אחורית שבה פרופיל הפיגמנטציה היא להיות קרא (מלבן ירוק, איור 1G , איור 2 א , ו 2 א '). לחץ על "אישור" ברירת המחדל היא 20 פיקסלים.
    הערה: פרופיל הפיגמנטציה נקרא על פני רצועת לציפורן, במקום על קו, כדי להפחית את הרעש עקב שערות וזיפים. רוחב פס זה יהיה תלוי ברזולוציה של התמונה, אבל זה צריך להיות ~ 1/20 th רוחב של הבטן, בפיקסלים.
  7. שים לב שהמאקרו יפתח את התמונה של הזבוב הראשון, ותיבת דו-שיח תשאול אם למדוד את הזבוב הנוכחי (לחץ על "כן"), כדי לעבור לטוס הבא (לחץ על "לא") או כדי לצאת מאקרו (לחץ על "ביטול").
  8. שים לב כי תיבת הדו שיח תפתח, הקובע "הגדר את קו האמצע של הבטן הגבי, מ - ANTERIOR ל - POSTERIOR." הכלי "קו ישר" כבר ייבחר. צייר קו מ קדמי אחוריכדי להגדיר את קו האמצע של הבטן הגבי. לחץ על "אישור" ראה איור 2 א ו -2 א ', שורה צהובה.
    הערה: זה משמש כדי לארגן מחדש את התמונה כך קו האמצע הגבי שוכב אופקית על פני המסך, עם הקדמי בצד שמאל, מה שהופך את הצעדים הבאים קל יותר.
  9. שים לב כי תיבת הדו שיח תפתח, הקובע "הגדר את הקצה האחורי של Tergite 4 ממש מאחורי רצועת הפיגמנט." הכלי "קו ישר" כבר ייבחר. צייר קו מקצה קו האמצע האחורי אל הקצה הימני-צדדי, כך שמרכז הקו (מסומן בריבוע לבן) יושב רק אחורית על הקצה האחורי של רצועת הפיגמנט (קוטיקולה A5). לחץ על "אישור". ראה איור 2 א ו -2 א ', קו מגנטה.
    הערה: התסריט R יזהה באופן אוטומטי את הקצה האחורי של רצועת הפיגמנט מפרופיל הפיגמנטציה.
  10. שים לב שיחתיבת יפתח, הקובע "הגדר את הקצה ANTERIOR של Tergite 4 בקצה הקדמי של הציפורן פיגמנט (a2)." הכלי "קו ישר" כבר ייבחר. צייר קו מקצה האמצע הקדמי הקדמי עד קצה ימין לרוחב, כך מרכז הקו (מסומן על ידי ריבוע לבן) יושב בקצה הקדמי של לציפורן פיגמנט (a2). לחץ על "אישור". ראה איור 2 א ו -2 א ' , קו ציאן.
    הערה: התסריט R יגדיר נקודה זו כקצה הקדמי של הציפורן הפיגמנט של הטרגיט. על התמונה, המאקרו יראה את האזור של הריבית (ROI) שבה פרופיל פיגמנטציה נקרא (מלבן ירוק, איור 2 א ו 2 א ', מוגדל באיור 2B ו 2 ב '). המאקרו יפתח גם חלון שני המציג את פרופיל הפיגמנטציה עבור החזר ההשקעה ( איור E 2C ו- 2C '), כאשר ציר ה- x הוא המיקום, מבוטא כמספר הפיקסלים מהקצה האחורי של הפרופיל, וציר ה- y הוא ערך הפיקסלים הממוצע בכל מיקום.
  11. הצג את החלקים של פרופיל הפיגמנטציה שייפתח על ידי המאקרו. במידת הצורך, לחץ על "Live" בחלון הפרופיל כדי להתאים את המיקום של החזר ה- ROI כך שהוא אינו כולל מבנים ( כגון זיפים) שישפיעו על פרופיל הפיגמנטציה. לאחר פרופיל משביע רצון, לחץ על "אישור".
  12. חזור על שלבים 5.8-5.11 עבור Tergite 3.
    הערה: המאקרו מייצא את פרופילי הפיגמנטציה לשני קובצי CSV, כל אחד מהם נקרא "SESH000_samplename_TX_profile.csv", כאשר [SESH000_samplename] הוא שם התמונה ו- [TX] הוא T3 או T4 עבור tergites השלישי והרביעי, בהתאמה.
  13. שים לב שהמאקרו פותח את התמונה הבאה. חזור על שלבים 5.7-5.13 עד שכל התמונות נותחו.
"עיבוד נתונים, ניתוח, ותיקון מושב

הערה: כל ניתוח הנתונים מתבצע R 47 ומשתמש "ניתוח של Pigmentation.R" סקריפט שסופק. להלן, "L ..." מציין איזה שורה (ים) של הסקריפט לרוץ עבור כל חלק של הניתוח. עיין במידע המשלים לקבלת פרטים נוספים על אופן הניתוח.

  1. ערוך את הסקריפט R כדי להגדיר את ספריית העבודה (L6) והגדר את filepath לתיקייה המכילה את פרופילי ה- .csv (L11).
  2. הפעל L13-15 כדי ליצור רשימה של פרופילי הפיגמנט המאוחסנים בתיקיית הפרופיל.
  3. לטעון ולהפעיל את "הקורא" ו "addPrimaryKey" פונקציות (L17-41) לקרוא את הפרופילים למסגרת נתונים אחת.
  4. לערוך את התסריט ב L43 כדי לציין את הכיול המרחבי של התמונות מיקרומטר / פיקסלים, כפי שנקבע בשלב 2.5.
  5. לטעון ולהפעיל את "adjusפונקציה "tts" (L46-58) כדי להמיר את מיקום הפרופיל (ציר x, איור 2C ו 2C ') מ-פיקסלים-מן-אחורי-קצה החזר ה- ROI ל- μm-from-anterior-edge-of-ROI (0 = שחור, 255 = לבן) לערך הפיגמנטציה (0 = ללא פיגמנט, 255 = פיגמנט מרבי).
  6. טען ולהפעיל את הפונקציה "spline.der.er" (L60-71) כדי ליצור את השדרה מעוקב של פרופילים פיגמנטציה נגזרות הראשון והשני שלה ( איור 2D -2F ו 2 '- 2F ').
  7. טען ולהפעיל את "coord" ו "assmbly.coord" פונקציות (L74-163), תחילה כדי לחלץ את המיקום של האחורי (T 3 ) ו הקדמי (T 2 ) הקצוות של הלהקה פיגמנט ( איור 2 ו 2 ד ') ואת הקצה האחורי של הציפורן A2 (T 1 , איור 2 ד ו -2 D ), ולאחר מכן לחלץ את מקסימום (P max ) מינימום (P דקות ) פיגמנטציה ערכים, נלקחה ב T 3 ו T 1 , בהתאמה.
    הערה: הקצה הקדמי של הציפורן a2 כבר מוגדר בשלב 5.9.
  8. אופציונלי: טען והפעל את הפונקציה "Chek" (L165-175) כדי לבדוק אם הפונקציה "coord" מזוהה כהלכה את המיקומים T1-3 עבור פרופיל פיגמנט שנבחר באופן אקראי.
  9. טען והפעל את פונקציות האינדקס והערכים (L178-193) כדי ליצור טבלת נתונים עם הכותרת "Session", "לדוגמא", "Tergite", "id" (שרשור של דוגמא וטרגייט), "P max " "P דקות ", "רוחב פס " (רוחב רצועת הפיגמנט, = T3 - T 2 ), ו- "W tergite " (רוחב פיגמנט cA utcles a2-a5, = T 3 ).
  10. לטעון ולהפעיל את "תיקון" הפונקציה (L196-234) כדי ליצור טבלת נתונים התיקון P max ו P דקות עבור כל הגורמים המטרדים הנובעים עקב השפעות הפגישה. השתמש עלייה ממוצעת (או ירידה) ב P max או P דקות מן הדגימות שליטה מחדש הדמיה על פני הפעלות סמוכות זמנית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

הפרוטוקול שימש כדי לחקור את ההשפעה של טמפרטורת גידול על פיגמנטציה בטנית. מחקרים קודמים הראו כי עלייה בטמפרטורה התפתחותית גורמת לירידה בהתפשטות הפיגמנטציה הבטן במספר מינים של תסיסנית , כולל ד מלנוגאסטר 30 , 32...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

מתודולוגיה זו מאפשרת את הרכישה המדויקת, המהירה והדירנטית של נתוני הפיגמנטציה בצורה כמותית המתאימה למספר ניתוחים במורד הזרם. השיטה שימשה כדי לרכוש נתונים על השפעת הטמפרטורה על פיגמנטציה בטן בקו איזוגני של זבובים. עם זאת, ניתן להשתמש במתודולוגיה במחקרים עתידיים על גנ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין מה לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי הקרן הלאומית למדע מענקים IOS-1256565 ו- IOS-1557638 ל- AWS. אנו מודים לפטרישיה ויטקופ ולשלושה מבקרים אנונימיים על הערותיהם המועילות על גרסה קודמת של מאמר זה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Dumont #5 Biology ForcepsFST11252-30
AgarSigma-Aldrich5040
Dissecting ScopeLeicaMZ16FA
BaseLeicaMDG41
CameraLeicaDFC280
Gooseneck Cold Light SourceSchottACE 1
Image Acquisition Control SoftwareMicro-Manager v1.3.20https://micro-manager.org/
Image Analysis SoftwareImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/
Data Analysis SoftwareR 3.3.2https://www.r-project.org/
LEDThor LabsLEDWE-15
MultimeterFlukeFluke 75 Series II
60 mm x 15 mm Petri dishCelltreat Scientific Products229663
Stage micrometerKlarman Rulings, Inc.KR-867

References

  1. Wittkopp, P. J., Beldade, P. Development and evolution of insect pigmentation: Genetic mechanisms and the potential consequences of pleiotropy. Semin. Cell Dev. Biol. 20 (1), 65-71 (2009).
  2. Lindgren, J. Interpreting melanin-based coloration through deep time: a critical review. Proc Roy Soc B-Biol Sci. 282 (1813), (2015).
  3. Kronforst, M. R., Papa, R. The Functional Basis of Wing Patterning in Heliconius Butterflies: The Molecules Behind Mimicry. Genetics. 200 (1), 1-19 (2015).
  4. Albert, N. W., Davies, K. M., Schwinn, K. E. Gene regulation networks generate diverse pigmentation patterns in plants. Plant Signal Behav. 9, e29526(2014).
  5. Monteiro, A. Origin, development, and evolution of butterfly eyespots. Annu Rev Entomol. 60, 253-271 (2015).
  6. Kronforst, M. R. Unraveling the thread of nature's tapestry: the genetics of diversity and convergence in animal pigmentation. Pigm Cell Melanoma Res. 25 (4), 411-433 (2012).
  7. Wright, T. R. The genetics of biogenic amine metabolism, sclerotization, and melanization in Drosophila melanogaster. Adv Genet. 24, 127-222 (1987).
  8. True, J. R. Insect melanism: the molecules matter. TREE. 18 (12), 640-647 (2003).
  9. Kopp, A., Duncan, I. Control of cell fate and polarity in the adult abdominal segments of Drosophila by optomotor-blind. Development. 124 (19), 3715-3726 (1997).
  10. Kopp, A., Muskavitch, M. A., Duncan, I. The roles of hedgehog and engrailed in patterning adult abdominal segments of Drosophila. Development. 124 (19), 3703-3714 (1997).
  11. Kopp, A., Blackman, R. K., Duncan, I. Wingless, decapentaplegic and EGF receptor signaling pathways interact to specify dorso-ventral pattern in the adult abdomen of Drosophila. Development. 126 (16), 3495-3507 (1999).
  12. Kopp, A., Duncan, I., Godt, D., Carroll, S. B. Genetic control and evolution of sexually dimorphic characters in Drosophila. Nature. 408 (6812), 553-559 (2000).
  13. Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134 (4), 610-623 (2008).
  14. Wittkopp, P. J., Williams, B. L., Selegue, J. E., Carroll, S. B. Drosophila pigmentation evolution: divergent genotypes underlying convergent phenotypes. Proc Natl Acad Sci Usa. 100 (4), 1808-1813 (2003).
  15. Brisson, J. A., De Toni, D. C., Duncan, I., Templeton, A. R. Abdominal pigmentation variation in drosophila polymorpha: geographic variation in the trait, and underlying phylogeography. Evolution. 59 (5), 1046-1059 (2005).
  16. Brisson, J. A., Templeton, A. R., Duncan, I. Population genetics of the developmental gene optomotor-blind (omb) in Drosophila polymorpha: evidence for a role in abdominal pigmentation variation. Genetics. 168 (4), 1999-2010 (2004).
  17. Dembeck, L. M. Genetic Architecture of Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 11 (5), e1005163(2015).
  18. Drapeau, M. D., Radovic, A., Wittkopp, P. J., Long, A. D. A gene necessary for normal male courtship, yellow, acts downstream of fruitless in the Drosophila melanogaster larval brain. J Neurobiol. 55 (1), 53-72 (2003).
  19. Hodgetts, R. B., O'Keefe, S. L. Dopa decarboxylase: a model gene-enzyme system for studying development, behavior, and systematics. Annu Rev Entomol. 51, 259-284 (2006).
  20. Marmaras, V. J., Charalambidis, N. D., Zervas, C. G. Immune response in insects: the role of phenoloxidase in defense reactions in relation to melanization and sclerotization. Arch Insect Biochem Physiol. 31 (2), 119-133 (1996).
  21. Kalmus, H. The Resistance to Desiccation of Drosophila Mutants Affecting Body Colour. Proc Roy Soc London B. 130 (859), 185-201 (1941).
  22. Rajpurohit, S., Gibbs, A. G. Selection for abdominal tergite pigmentation and correlated responses in the trident: a case study in Drosophila melanogaster. Biol J Linn Soc. 106 (2), 287-294 (2012).
  23. Pool, J. E., Aquadro, C. F. The genetic basis of adaptive pigmentation variation in Drosophila melanogaster. Mol Ecol. 16 (14), 2844-2851 (2007).
  24. Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Developmental constraints on an adaptive plasticity: reaction norms of pigmentation in adult segments of Drosophila melanogaster. Evol Dev. 2 (5), 249-260 (2000).
  25. Shakhmantsir, I., Massad, N. L., Kennell, J. A. Regulation of cuticle pigmentation in drosophila by the nutrient sensing insulin and TOR signaling pathways. Dev Dyn. 243 (3), 393-401 (2014).
  26. Struhl, G., Barbash, D. A., Lawrence, P. A. Hedgehog organises the pattern and polarity of epidermal cells in the Drosophila abdomen. Development. 124 (11), 2143-2154 (1997).
  27. Jeong, S., Rokas, A., Carroll, S. B. Regulation of body pigmentation by the Abdominal-B Hox protein and its gain and loss in Drosophila evolution. Cell. 125 (7), 1387-1399 (2006).
  28. Wittkopp, P. J., True, J. R., Carroll, S. B. Reciprocal functions of the Drosophila yellow and ebony proteins in the development and evolution of pigment patterns. Development. 129 (8), 1849-1858 (2002).
  29. True, J. R. Drosophila tan encodes a novel hydrolase required in pigmentation and vision. PLoS Genet. 1 (5), e63(2005).
  30. David, J. R., Capy, P., Gauthier, J. P. Abdominal pigmentation and growth temperature in Drosophila melanogaster: Similarities and differences in the norms of reaction of successive segments. J Evol Biol. 3 (5-6), (1990).
  31. Gibert, J. M., Peronnet, F., Schlotterer, C. Phenotypic plasticity in Drosophila pigmentation caused by temperature sensitivity of a chromatin regulator network . PLoS Genet. 3 (2), e30(2007).
  32. Gibert, P., Moreteau, B., Scheiner, S. M. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila: correlated variations between segments. Genet Sel Evol. 30 (2), 181(1998).
  33. Matute, D. R., Harris, A. The influence of abdominal pigmentation on desiccation and ultraviolet resistance in two species of Drosophila. Evolution. 67 (8), 2451-2460 (2013).
  34. Das, A., Mohanty, S., Parida, B. Abdominal pigmentation and growth temperature in Indian Drosophila melanogaster: Evidence for genotype-environment interaction. J Biosci. 19 (2), 267-275 (1994).
  35. Hollocher, H., Hatcher, J. L., Dyreson, E. G. Evolution of abdominal pigmentation differences across species in the Drosophila dunni subgroup. Evolution. 54 (6), 2046-2056 (2000).
  36. Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila melanogaster: genetic repeatability of quantitative parameters in two successive generations. Heredity. 92 (6), 499-507 (2004).
  37. Carbone, M. A., Llopart, A., deAngelis, M., Coyne, J. A., Mackay, T. F. Quantitative trait loci affecting the difference in pigmentation between Drosophila yakuba and D. santomea. Genetics. 171, 211-225 (2005).
  38. Kopp, A., Graze, R. M., Xu, S., Carroll, S. B., Nuzhdin, S. V. Quantitative trait loci responsible for variation in sexually dimorphic traits in Drosophila melanogaster. Genetics. 163 (2), 771-787 (2003).
  39. Bastide, H., Yassin, A., Johanning, E. J., Pool, J. E. Pigmentation in Drosophila melanogaster reaches its maximum in Ethiopia and correlates most strongly with ultra-violet radiation in sub-Saharan Africa. BMC Evol Biol. 14, 179(2014).
  40. Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326 (5960), 1663-1667 (2009).
  41. John, A. V., Sramkoski, L. L., Walker, E. A., Cooley, A. M., Wittkopp, P. J. Sensitivity of Allelic Divergence to Genomic Position: Lessons from the Drosophila tan Gene. G3. 6 (9), 2955-2962 (2016).
  42. Wittkopp, P. J. Local adaptation for body color in Drosophila americana. Heredity. 106 (4), 592-602 (2011).
  43. Wittkopp, P. J. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
  44. Edelstein, A. D. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), e10(2014).
  45. U. S. National Institutes of Health. ImageJ v.1.50i. , Bethesda, Maryland, USA. Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2016).
  46. Mims, F. M. How to Use LEDs to Detect Light. Make:. 36, 136-138 (2013).
  47. R: Language and Environment for Statistical Computing v.3.3.2. R Foundation for Statistical Computing. , Vienna, Austria. Available from: https://www.r-project.org/ (2016).
  48. Bates, D., Machler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting Linear Mixed-Effects Models Using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
  49. Shingleton, A. W., Estep, C. M., Driscoll, M. V., Dworkin, I. Many ways to be small: different environmental regulators of size generate distinct scaling relationships in Drosophila melanogaster. Proc Roy Soc Lond B Biol Sci. 276 (1667), 2625-2633 (2009).
  50. French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
  51. Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nat Rev Genet. 11 (12), 855-866 (2010).
  52. Kültz, D. New frontiers for organismal biology. BioSci. 63 (6), 464-471 (2013).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

124

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved