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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Diese Arbeit präsentiert eine Methode zur schnellen und präzisen Quantifizierung der Bauchpigmentierung von Drosophila melanogaster mittels digitaler Bildanalyse . Diese Methode rationalisiert die Vorgänge zwischen der Phänotyp-Erfassung und der Datenanalyse und umfasst die Probenmontage, die Bilderfassung, die Pixelwert-Extraktion und die Merkmalsmessung.

Zusammenfassung

Pigmentierung ist ein morphologisch einfaches, aber sehr variables Merkmal, das oft anpassungsfähige Bedeutung hat. Es hat vielmehr als Modell für das Verständnis der Entwicklung und Entwicklung von morphologischen Phänotypen gedient. Die Bauchpigmentierung in Drosophila melanogaster war besonders nützlich, so dass Forscher die Locus identifizieren können, die inter- und intraspezifischen Variationen in der Morphologie zugrunde liegen. Bisher wurde jedoch die D. melanogaster- Bauchpigmentierung weitgehend qualitativ durch Scoring statt quantitativ untersucht, was die Formen der statistischen Analyse begrenzt, die auf Pigmentationsdaten angewendet werden können. Diese Arbeit beschreibt eine neue Methodik, die die Quantifizierung verschiedener Aspekte des Bauchpigmentierungsmusters des erwachsenen D. melanogaster ermöglicht . Das Protokoll umfasst Probenmontage, Bildaufnahme, Datenextraktion und Analyse. Die gesamte Software, die für die Bildaufnahme und Analyse verwendet wird, verfügt über MakrosGeschrieben für Open-Source-Bildanalyse. Der Vorteil dieses Ansatzes ist die Fähigkeit, Pigmentierungsmerkmale präzise zu messen, wobei eine Methodik verwendet wird, die über verschiedene Abbildungssysteme hoch reproduzierbar ist. Während die Technik verwendet wurde, um die Variation in den tergischen Pigmentierungsmustern des erwachsenen D. melanogaster zu messen , ist die Methodik flexibel und breit auf Pigmentierungsmuster in unzähligen verschiedenen Organismen anwendbar.

Einleitung

Die Pigmentierung zeigt eine enorme phänotypische Variation zwischen Arten, Populationen und Individuen und sogar innerhalb von Individuen während der Ontogenese 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Obwohl es in einer Vielzahl von Tieren unzählige Pigmenttests gibt, ist die Pigmentierung am besten in Drosophila melanogaster untersucht worden , wo die volle Kraft der Molekulargenetik verwendet wurde, um die Entwicklungs- und physiologischen Mechanismen zu erforschen, die die Pigmentierung regulieren und wie sich diese Mechanismen entwickeln 1 , 6 Es ist viel über die Gene bekannt, die die biochemische Synthese von Pigmenten in D. melanogaster 7 , 8 und den Genen, die das zeitliche und räumliche di kontrollieren, regulierenVerteilung dieser Biosynthese 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Darüber hinaus hat die genetische Kartierung die genetischen Loci identifiziert, die intra- und interspezifischen Unterschiede in der Pigmentierung in D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 liegen . Auch die Beziehungen zwischen Pigmentierung und pleiotropen Merkmalen wie Verhalten 18 , 19 und Immunität 19 , 20 wurden ebenso erforscht wie die adaptive Bedeutung der Pigmentierungsmuster 15 , 21 , 22 . Als solches ist die Pigmentierung in D. melanogaster als eine mächtige und dennoch einfache m aufgetauchtOdel für die Entwicklung und Entwicklung von komplexen Phänotypen.

Pigmentierung im erwachsenen D. melanogaster zeichnet sich durch deutliche Melanisierungsmuster über den Körper, besonders an den Flügeln und dem dorsalen Thorax und Bauch. Es ist die Pigmentierung jeder cuticular Platte (tergite) auf dem dorsalen Abdomen, jedoch, die die meisten Forschung Aufmerksamkeit erhalten hat. Es gibt eine beträchtliche Variation in dieser Pigmentierung (Abbildung 1A- F ), weil sowohl genetische 17 , 23 und Umwelt 24 , 25 Faktoren. Die Nagelhaut eines abdominalen Tergits besteht aus vorderen und hinteren Entwicklungsfächern (Abbildung 1G ), die jeweils je nach Pigmentierung und Ornamentierung weiter unterteilt werden können. Das vordere Fach umfasst sechs NagelhautTypen (a1-a6), und das hintere Kompartiment enthält drei (p1-p3) (Abbildung 1G ). Von diesen werden die p1, p2 und a1 Nagelhaut typischerweise unter dem Tergit in ungedehnten Abdomen gefaltet, so dass sie verborgen sind. Die zuverlässig sichtbare Nagelhaut zeichnet sich durch eine Bande von schwerer Pigmentierung aus, die hier als "Pigmentband" bezeichnet wird und aus Nagelhauttypen a4 (haarig mit mäßigen Borsten) und a5 (behaart mit großen Borsten) mit dem hinteren Rand des Bandes besteht Intensiver pigmentiert als die vordere Kante (Abbildung 1G ). Anterior zu dieser Band ist eine Region von leicht pigmentierten behaarten Nagelhaut, die Borsten nach hinten (a3) ​​aber nicht anteriorly (a2) hat. Eine Variation der Pigmentierung zwischen Fliegen wird sowohl in der Intensität der Pigmentierung als auch in der Breite des Pigmentbandes beobachtet. Im Allgemeinen ist die Variation am stärksten in den hintersten Segmenten (Bauchsegmente 5, 6 und 7) und ist in den anterioren Segmenten niedriger (abdominal seGionen 3 und 4) 24 . Darüber hinaus gibt es einen sexuellen Dimorphismus in D. melanogaster Pigmentierung, wobei Männer im Allgemeinen vollständig pigmentierte fünfte und sechste Bauch-Tergite (Abbildung 4C ) haben.

In den meisten Untersuchungen der Bauchpigmentierung in D. melanogaster wurde die Pigmentierung als kategorisches oder ordinales Merkmal behandelt, wobei das Muster qualitativ 27 , 28 , 29 oder halbquantitativ auf einer Skala 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 gemessen wurde , 31 , 32 , 33 , 34 , 35, 36 , 37 . Diese Methoden leiden unweigerlich an einem Mangel an Präzision, und weil sie sich auf die subjektive Bewertung der Pigmentierung verlassen, ist es schwierig, die Daten über Studien zu vergleichen. Mehrere Autoren haben die räumlichen Dimensionen der Pigmentierung 38 , 39 , die Intensität der Pigmentierung eines bestimmten Häutchen Typ 23 , 25 , 39 , 40 oder die durchschnittliche Intensität der Pigmentierung über die Bauch-Tergit als Ganzes 41 , 42 , 43 quantifiziert. Dennoch messen diese Quantifizierungsmethoden nicht sowohl die Intensität als auch die räumliche Verteilung der Bauchpigmentierung gleichzeitig und erfassen daher nicht die Nuancen, wie sich die Pigmentierung über den Abd unterscheidetOminal tergite Weiterhin erfordern mehrere dieser Quantifizierungsverfahren 38 , 41 , 42 , 43 die Dissektion und Montage der Bauchhöhle. Dies ist sowohl zeitaufwändig als auch zerstört die Probe, so dass es für weitere morphologische Analysen nicht verfügbar ist. Als das Verständnis der Entwicklung und Entwicklung der Bauchpigmentierung vertieft, werden anspruchsvollere Werkzeuge zur schnellen und präzisen Messung sowohl der räumlichen Verteilung als auch der Intensität der Pigmentierung erforderlich sein.

Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, die digitale Bildanalyse zu nutzen, um eine replizierbare und präzisere Messung der Bauchpigmentierung in D. melanogaster zu erhalten . Die Methodik umfasst drei Stufen. Zuerst wird die erwachsene Fliege zerstörungsfrei montiert und ein digitales Bild des dorsalen Bauches genommen. Zweitens, mit einem ImageJ-Makro, der BenutzerDefiniert einen anterior-posterioren Streifen von Pixeln, der sich von der vorderen Seite der a2-Nagelhaut bis zum hinteren der a5-Nagelhaut (grüner Kasten, Abbildung 1G ) auf dem dritten und vierten Bauchsegment erstreckt. Der mittlere Pixelwert über die Breite dieses Streifens wird dann entlang seiner langen Achse extrahiert, wodurch ein Profil erzeugt wird, das die räumliche Verteilung und die Intensität der Pigmentierung einfängt, wenn es sich von der vorderen zur hinteren des Tergits ändert. Drittens wird ein R-Skript verwendet, um das Pigmentprofil mathematisch mit einem kubischen Spline zu beschreiben. Das R-Skript verwendet dann das Spline und seine erste und zweite Ableitung, um die Breite der a2-a5-Nagelhaut, die Breite des Pigmentbandes und die maximale und minimale Pigmentierung zu extrahieren. Die Methode quantifiziert daher sowohl die räumlichen Eigenschaften als auch die Tiefe der Bauchpigmentierung.

Diese Methodik quantifiziert die Pigmentierung der dritten und vierten Bauch-Tergite,Die im Fokus zahlreicher früherer Studien 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 waren , entweder ausschließlich oder in Kombination mit mehr posterioren Tergiten. Obwohl weniger variabel als die fünfte und sechste Bauch-Tergite, die dritte und vierte Tergite sind nicht vollständig pigmentiert bei Männern, so dass dieses Protokoll kann sowohl für Männer und Frauen angewendet werden. Dennoch kann, wie hier gezeigt, das Protokoll verwendet werden, um die Pigmentierung in der fünften und sechsten Bauch-Tergite bei Frauen zu messen. Darüber hinaus sollten kleinere Modifikationen der Skripte, die verwendet werden, um die Eigenschaften des Pigmentierungsprofils zu extrahieren, das Verfahren zur Quantifizierung der Variation der Pigmentierung in einer Vielzahl von anderen verwendenOrganismen

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Protokoll

1. Probenmontage

HINWEIS: Tote Fliegen in 70% Ethanol in Wasser vor der Bildgebung.

  1. Gießen Sie 10 ml 1,25% Agar in kochendem Wasser in einer 60 mm x 15 mm Petrischale aufgelöst und lassen Sie es einstellen.
  2. Unter einem Sektionsmikroskop verwenden Sie ein Paar Feinpinzetten, um eine ~ 20 mm ong, 2 mm breite, 1 mm tiefe Rille in der Oberfläche des Gels zu machen. Mit feinen Zangen, eingebettet die ventrale Seite einer erwachsenen Fliege in die Nut, wobei die dorsale Seite der Fliege über das Gel vorspringt.
    HINWEIS: Die Lockerheit des Gels ermöglicht eine einfache Neupositionierung ohne Beschädigung der Probe. Die gleiche Rille kann für mehrere Exemplare verwendet werden, obwohl es schmutzig, aufgebrochen und unbrauchbar mit der Zeit wird. Der Benutzer kann dann eine weitere Nut in demselben Gel machen. Jede Platte kann verwendet werden, um ~ 200 Fliegen abzubilden.
  3. Die Probe in 70% igem Ethanol vollständig in Wasser abdecken, um Lichtreflexionen aus der wachsartigen Nagelhaut zu reduzieren und die Flügelschäden zu verhindernProbekörpermanipulation.

2. Mikroskop-Setup

HINWEIS: Die Bilder werden unter Verwendung eines Sektionsbereichs, einer Durchlichtbasis, einer Digitalkamera und einer Schwanenhals-Kaltlichtquelle, die an einem Computer angeschlossen sind, der eine Bilderfassungssteuerungssoftware ausführt, aufgenommen. Software-Anweisungen sind spezifisch für Micro-Manager v1.4.20 44 , die eine Open-Source-Software ist, die ImageJ 45 enthält .

  1. Schalten Sie das Mikroskop, Digitalkamera, Doppel-Schwanenhals Kaltlichtquelle und Computer.
  2. Führen Sie die Bildaufnahme-Software aus, um ein Micro-Manager-Fenster und ein ImageJ-Fenster zu öffnen. Im ImageJ-Fenster klicken Sie auf "Image"> "Type"> "8-Bit", um alle Bilder als 8-Bit zu setzen. Klicken Sie im Mikro-Manager-Fenster auf "live", um ein Fenster "Snap / Live" zu öffnen, das eine Echtzeitvorschau von der Kamera zeigt.
    1. Maximieren Sie die Größe des "Snap / Live" -Fensters, wenn neCessary Wählen Sie im Pulldown-Menü "Display-Modus" im Register "Kontrast" des Micro-Manager-Fensters "Graustufen".
  3. Schalten Sie die kalte Lichtquelle auf ihre maximale Intensität ein und positionieren Sie die Spitzen jedes Schwanenhalses auf ca. 120 mm von der Bühne, eine auf der linken und eine auf der rechten Seite.
    HINWEIS: Die Benutzer können auch einen ringförmigen Illuminator verwenden, obwohl dies einen Ring von reflektiertem Licht um den Fliegenabdomen erzeugen kann.
  4. Manuelles Setzen der Mikroskopvergrößerung auf 60X, so dass das Gesichtsfeld eine Fläche von etwa 3 mm Durchmesser auf der Bühne einfängt.
  5. Legen Sie ein 2 mm Bühnenmikrometer auf die Bühne (Umschalten des Hintergrundes auf Weiß, wenn nötig). Beim Betrachten der Live-Vorschau konzentrieren Sie sich auf den Bühnenmikrometer und passen die Belichtung im Micro-Manager-Fenster an, indem Sie die Belichtungszeit in ms im Feld "Exposure" eingeben.
  6. Um die Kamera räumlich zu kalibrieren, wählen Sie das Werkzeug "Gerade" in tEr ImageJ Fenster und zeichne eine Linie die Länge der Bühnenmikrometer. Im ImageJ-Fenster klicken Sie auf "Analysieren"> "Set Scale", um das Fenster "Set Scale" zu öffnen, geben Sie die Länge des Mikrometers in μm in das Feld "Bekannte Distanz" ein und geben Sie "μm" in die "Längeneinheit" Box.
    1. Beachten Sie, dass das Fenster "Set Scale" dann die Skala in "Pixel / μm" anzeigt. Notieren Sie sich die Skala und klicken Sie auf "OK".
  7. Klicken Sie im Fenster "Snap / Live" auf "Stop" und dann "Snap", um ein Bild des Bühnenmikrometers zu erfassen.
  8. Speichern Sie das Bild als 8-Bit-Graustufen-TIFF, um die Möglichkeit zu gewährleisten, die Bilder bei Bedarf räumlich zu kalibrieren. Im ImageJ-Fenster klicken Sie auf "Datei"> "Speichern unter"> "Tiff ..." Geben Sie an, wo die Datei im Dateibrowser gespeichert werden soll, benennen Sie die Datei und klicken Sie auf "Speichern".
  9. Schalte die Bühne schwarz und platzEine Petrischale, die eine Fliege in Agar (Schritte 1.1-1.2) auf der Bühne montiert hat.
  10. Schauen Sie durch das Mikroskop und positionieren Sie die Fliege, um sicherzustellen, dass die dorsale Mittellinie gerade ist, um das Pigmentmuster am besten zu sehen. Bewegen Sie alle Flügel und Anhänge, um sicherzustellen, dass der Blick auf den Bauch ist ungehindert. Wenn die pigmentierte Nagelhaut (a2-a5) nicht sichtbar ist, quetschen Sie den Bauch seitlich, bis er ist (obwohl der Abdomen der Fliegen in 70% Ethanol in Wasser gespannt ist, so dass dies normalerweise nicht notwendig ist).
    HINWEIS: Bei der Positionierung der Fliege muss der Benutzer eine niedrigere Vergrößerung (20X) verwenden. Die Vergrößerung muss auf 60X zurückgesetzt werden, bevor Sie fortfahren.
  11. Manuell auf den dorsalen Abdomen der Fliege fokussieren Manuell die Spitzen der Lichtquelle einstellen, um die Schatten und die Reflexion auf dem Rückenabfall zu minimieren.
  12. Beim Betrachten der Live-Vorschau auf dem Computerbildschirm und mit dem Pixelwert-Histogramm auf der Registerkarte "Kontrast" des Micro-Manager-Fensters,Stellen Sie die Belichtung wie in Schritt 2.4 beschrieben ein, um den Bereich der Pixelwerte des Vorschaubildes zu maximieren.
  13. Entfernen Sie die Fliege und Petrischale und ersetzen Sie sie mit einer LED (spektrale Ausgabe von 430-660 nm), die an einen Spannungsmesser angeschlossen ist, der im Sichtfeld an der gleichen Position wie die Fliege zentriert ist. Verwenden Sie die LED und den Spannungsmesser als Lichtzähler 46 und notieren Sie die Spannung, die durch das auf die LED auftreffende Licht (~ 125 mV) erzeugt wird.
    HINWEIS: Der LED- und Spannungsmesser wird verwendet, um sicherzustellen, dass die Lichtwerte über mehrere Bildgebungssitzungen in einem einzigen Experiment konstant sind.
  14. Für die Dauer des Experiments darf die Position oder Intensität der Lichtquelle, die Vergrößerung des Mikroskops oder die Belichtung der Kamera nicht weiter verändert werden.

3. Probenbildgebung

  1. Legen Sie eine Petrischale mit einer Fliege in Agar (Schritte 1.1-1.3) auf dem schwarzen Mikroskopstadium montieren. Stellen Sie die Position der Fliege so ein, dass die dritte und vierteH Abdominalsegmente sind sichtbar und die dorsale Mittellinie ist gerade, wie in Schritt 2.9 beschrieben. Stellen Sie sicher, dass die Vergrößerung bei 60x ist, bevor Sie fortfahren.
  2. Manuell fokussieren Sie das Mikroskop so, dass die dritte und vierte dorsale Bauch-Tergite im Fokus sind. Verwenden Sie die Bildaufnahme-Software, um ein Bild als 8-Bit-Graustufen-TIFF zu erfassen, wie in Schritt 2.6 beschrieben.
    HINWEIS: Das Bild kann farbig aufgenommen und anschließend zur Analyse in Graustufen umgewandelt werden.
  3. Speichern Sie das Bild als "SESH000_sampleID.tiff", wie in Schritt 2.7 beschrieben.
    HINWEIS: Hier ist [SESH] konstant, [000] ist die Sitzungsnummer und ist variabel, muss aber drei Ziffern lang sein und [sampleID] ist was auch immer der Benutzer wünscht, obwohl er keine zusätzlichen Unterstrichzeichen (_) enthalten muss Muss eine konstante Länge haben. [SampleID] sollte Details der Faktoren enthalten, die bei der Analyse der Pigmentierungsdaten ( z. B. Temperatur oder Abstammung) verwendet werden, die durch ein unverwechselbares Nicht-Alphabeti getrennt sindCal-Charakter, wie ein Bindestrich (-). Dies ermöglicht es, diese Faktoren einfach aus [sampleID] unter Verwendung von standardisierter statistischer Software zu analysieren.
  4. Entfernen Sie die Petrischale von der Bühne und ersetzen Sie die Fliege mit dem nächsten Exemplar. Wiederholen Sie die Schritte 3.1-3.3, bis alle Exemplare abgebildet wurden, ohne die Beleuchtungsstärke, die Vergrößerung oder die Belichtung weiter einzustellen.

4. Imaging über mehrere Sessions

  1. Wenn Bilder über mehrere Sitzungen aufgenommen werden müssen, pflegen Sie die Lichtintensität, die Belichtung und die Vergrößerung über die Sitzungen. Prüfen Sie zu Beginn jeder Sitzung die räumliche Kalibrierung der Kamera (Schritt 2.4) und die Lichtintensität auf der Bühne (gemessen am LED / Spannungsmesser, Schritt 2.12).
  2. Erfassen und Speichern eines Bildes des Bühnenmikrometers (Schritte 2.5-2.7), um die Möglichkeit zu gewährleisten, die Bilder bei Bedarf räumlich zu kalibrieren.
  3. Verwenden Sie mindestens 15 Kontrollproben und geben Sie sie nach dem Zufallsprinzip in jeder Sitzung nach allo vorW für die Erkennung und Beseitigung von Session-Effekten. Stellen Sie sicher, dass doppelte Kontrollproben zwischen den Sitzungen die gleiche [sampleID] aber unterschiedliche [SESH000] haben.
    ANMERKUNG: Die Kontrollproben sind Fliegen, die gesammelt, gespeichert und identisch an experimentelle Exemplare angebracht werden, aber über Sessions neu abgebildet werden. Die genaue Anzahl der Kontrollproben hängt vom experimentellen Setup des Benutzers ab. Weitere Details finden Sie in der Diskussion.

5. Bildanalyse

HINWEIS: Die Bildanalyse wird in ImageJ 45 durchgeführt und verwendet das Makro "Measurement of Pigmentation.ijm", das als Ergänzungsdatei zur Verfügung gestellt wird.

  1. Platzieren Sie alle zu analysierenden Bilder im selben Ordner.
  2. Starten Sie ImageJ und führen Sie das Makro "Measurement of Pigmentation.ijm" durch Klicken auf "Plugins"> "Macro"> "Run", "Auswählen von" Pigmentation.ijm "im Dateibrowser und klicken Sie auf"öffnen."
    HINWEIS: Alle nachfolgenden Schritte befinden sich im Makro. Jeder Schritt ist ein einzelner Makrobefehl.
  3. Beachten Sie, dass ein Dialogfeld "Action Required" geöffnet wird, unter Angabe von "Wählen Sie den Ordner, in dem Bilder gespeichert sind". Klicken Sie auf "OK" und verwenden Sie den Dateibrowser, um den Ordner auszuwählen, der die Bilder enthält, und klicken Sie dann auf "Auswählen".
  4. Beachten Sie, dass ein Dialogfeld "Action Required" geöffnet wird, indem Sie "Wählen Sie den Ordner, in dem die Daten gespeichert werden sollen". Klicken Sie auf "OK" und wählen Sie mit dem Dateibrowser den gewünschten Ordner zum Speichern der Pigmentprofile aus. Klicken Sie auf "wählen".
  5. Beachten Sie, dass sich ein Dialogfeld öffnet und "Wie viele Zeichen in Ihrer Beispiel-ID?" Geben Sie im Eingabefeld Eingabe die Anzahl der Zeichen in [SampleID] ein, wie in Schritt 3.3 angegeben, und klicken Sie auf "OK".
  6. Beachten Sie, dass ein Dialogfenster geöffnet wird und fragt: "Wie weit ist dein ROI?" Geben Sie im Eingabefeld Eingabe die Pixelbreite des anterior-Posteriorer Streifen, entlang dem das Pigmentierungsprofil zu lesen ist (grünes Rechteck, Abbildung 1G , Abbildung 2A und 2A '). OK klicken;" Die Voreinstellung ist 20 Pixel.
    ANMERKUNG: Das Pigmentprofil wird über einen Streifensäge und nicht durch eine Linie gelesen, um Lärm durch Haare und Borsten zu reduzieren. Die Breite dieses Streifens hängt von der Auflösung des Bildes ab, aber es sollte ~ 1 / 20th der Breite des Bauches in Pixeln sein.
  7. Beachten Sie, dass das Makro das Bild der ersten Fliege öffnet und ein Dialogfenster fragt, ob die aktuelle Fliege zu messen ist (klicken Sie auf "Ja"), um zur nächsten Fliege zu gelangen (klicken Sie auf "Nein") oder um das zu verlassen Makro (klicken Sie auf "Abbrechen").
  8. Beachten Sie, dass sich ein Dialogfeld öffnet, unter Angabe von "Definieren Sie die Mittellinie des dorsalen Abdomens, von ANTERIOR bis POSTERIOR". Das Werkzeug "Gerade Linie" wird bereits ausgewählt. Zeichne eine Linie von vorne nach hintenUm die Mittellinie des dorsalen Bauches zu definieren. OK klicken;" Siehe Abbildung 2A und 2A ', gelbe Linie.
    HINWEIS: Dies wird verwendet, um das Bild neu auszurichten, so dass die dorsale Mittellinie horizontal über dem Bildschirm liegt, mit dem vorderen auf der linken Seite, wodurch die nachfolgenden Schritte erleichtert werden.
  9. Beachten Sie, dass sich ein Dialogfeld öffnet, unter Angabe von "Definieren Sie die POSTERIOR-Kante von Tergite 4 direkt hinter dem Pigmentband." Das Werkzeug "Gerade Linie" wird bereits ausgewählt. Zeichnen Sie eine Linie von der hinteren Mittellinienkante zur rechten Seitenkante, so dass die Mitte der Linie (markiert durch ein weißes Quadrat) gerade nach hinten zum hinteren Rand des Pigmentbandes (Nagelhaut a5) sitzt. OK klicken;". Siehe Abbildung 2A und 2A ', Magenta-Linie.
    HINWEIS: Das R- Skript erkennt automatisch die hintere Kante des Pigmentbandes aus dem Pigmentprofil.
  10. Beachten Sie, dass ein DialogKasten öffnet sich und sagt: "Definiere die ANTERIOR Kante von Tergite 4 an der vorderen Kante der pigmentierten Nagelhaut (a2)." Das Werkzeug "Gerade Linie" wird bereits ausgewählt. Zeichnen Sie eine Linie von der vorderen Mittellinie zur rechten Seitenkante, so dass die Mitte der Linie (markiert durch ein weißes Quadrat) am vorderen Rand der pigmentierten Nagelhaut (Nagelhaut a2) sitzt. OK klicken;". Siehe Abbildung 2A und 2A ' , Cyan-Linie.
    HINWEIS: Das R- Skript definiert diesen Punkt als die vordere Kante der pigmentierten Nagelhaut der Tergite. Auf dem Bild zeigt das Makro den interessierenden Bereich (ROI) an, entlang dem das Pigmentierungsprofil gelesen wird (grünes Rechteck, Fig. 2A und 2A ', vergrößert in Fig. 2B und 2B '). Das Makro öffnet auch ein zweites Fenster mit dem Pigmentprofil für den ROI ( Figur E 2C und 2C '), wobei die x-Achse die Position ist, ausgedrückt als Anzahl der Pixel von der hinteren Kante des Profils, und die y-Achse ist der durchschnittliche Pixelwert an jeder Position.
  11. Sehen Sie sich die Plots des Pigmentierungsprofils an, das vom Makro geöffnet wird. Wenn nötig, klicken Sie im Profilfenster auf "Live", um die Position des ROI so einzustellen, dass es keine Strukturen ( zB Borsten) enthält, die das Pigmentprofil beeinflussen würden. Sobald das Profil zufrieden stellend ist, klicken Sie auf "OK".
  12. Wiederholen Sie die Schritte 5.8-5.11 für Tergite 3.
    HINWEIS: Das Makro exportiert dann die Pigmentierungsprofile als zwei CSV-Dateien, die jeweils "SESH000_samplename_TX_profile.csv" genannt werden, wobei [SESH000_samplename] der Bildname ist und [TX] entweder T3 oder T4 für die dritte und vierte Tergite ist.
  13. Beachten Sie, dass das Makro das nächste Bild öffnet. Wiederholen Sie die Schritte 5.7-5.13, bis alle Bilder analysiert wurden.
Jove_title "> 6. Datenvorverarbeitung, Analyse und Sitzungskorrektur

HINWEIS: Alle Datenanalyse wird in R 47 durchgeführt und verwendet das Skript "Analyse von Pigmentation.R". Unten, "L ..." gibt an, welche Zeile (n) des Skripts für jeden Teil der Analyse laufen soll. Weitere Informationen darüber , wie die Analyse durchgeführt wird, finden Sie in den ergänzenden Informationen.

  1. Bearbeiten Sie das R- Skript, um das Arbeitsverzeichnis (L6) einzustellen und den Dateipfad in den Ordner zu definieren, der die .csv-Profile enthält (L11).
  2. Führen Sie L13-15 aus, um eine Liste der im Profilordner gespeicherten Pigmentierungsprofile zu erzeugen.
  3. Laden und führen Sie die Funktionen "Leser" und "addPrimaryKey" (L17-41), um die Profile in einem einzelnen Datenrahmen zu lesen.
  4. Bearbeiten Sie das Skript bei L43, um die räumliche Kalibrierung der Bilder in μm / Pixel anzugeben, wie in Schritt 2.5 bestimmt.
  5. Laden und führen Sie die "adjusTionen "-Funktion (L46-58), um die Profilposition (x-Achse, Abbildung 2C und 2C ') von Pixeln von-posterior-edge-of-ROI zu μm-von-anterior-edge-of-ROI und dem zu konvertieren Profilwert (y-Achse, Bild 2C und 2C ') vom Pixelwert (0 = schwarz, 255 = weiß) zum Pigmentierungswert (0 = kein Pigment, 255 = maximales Pigment).
  6. Laden Sie die Funktion "spline.der.er" (L60-71), um die kubische Spline der Pigmentierungsprofile und ihre ersten und zweiten Ableitungen zu erzeugen ( Abbildung 2D - 2F und 2D '- 2F ').
  7. Laden Sie die "coord" und "assmbly.coord" -Funktionen (L74-163), um zuerst die Position der hinteren (T 3 ) und anterior (T 2 ) Kanten des Pigmentbandes zu extrahieren (Abbildung 2D und 2D '(T1, Fig. 2D und 2D ') und dann die maximalen (P max ) und minimalen (P min ) Pigmentierungswerte, die bei T 3 bzw. T 1 aufgenommen wurden, extrahieren.
    HINWEIS: Die vordere Kante der a2-Nagelhaut wurde bereits in Schritt 5.9 definiert.
  8. Optional: Laden und starten Sie die Funktion "chek" (L165-175), um zu prüfen, ob die "Coord" -Funktion die Positionen T 1-3 für ein zufällig ausgewähltes Pigmentprofil korrekt identifiziert.
  9. Laden Sie die Index- und Metrikfunktionen (L178-193), um eine Datentabelle mit den Überschriften "Session", "Sample", "Tergite", "id" (eine Verkettung von Sample und Tergite), "P max ", zu erzeugen. "P min ", "W- Band " (Breite des Pigmentbandes, = T3 - T 2 ) und "W tergit " (Breite des pigmentierten cUticles a2-a5, = T 3 ).
  10. Laden und starten Sie die Funktion "Korrektur" (L196-234), um eine Datentabelle zu erzeugen, die P max und P min für irgendwelche Störungsfaktoren korrigiert, die durch Session-Effekte entstehen. Verwenden Sie die durchschnittliche Erhöhung (oder Abnahme) in P max oder P min von den Kontrollproben, die über die zeitlich benachbarten Sitzungen neu abgebildet wurden.

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Ergebnisse

Das Protokoll wurde verwendet, um die Wirkung der Aufzuchttemperatur auf die Bauchpigmentierung zu untersuchen. Frühere Studien haben gezeigt, dass eine Erhöhung der Entwicklungstemperatur zu einer Verringerung der Ausbreitung der Bauchpigmentierung bei mehreren Arten von Drosophila führt , einschließlich D. melanogaster 30 , 32 . Speziell bei den Bauch-Tergiten 3 und 4 nimmt das Ausmaß der Pigmentierung (B...

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Diskussion

Diese Methodik ermöglicht die präzise, ​​schnelle und wiederholbare Erfassung von Pigmentierungsdaten in quantitativer Form, die für mehrere nachgeschaltete Analysen geeignet ist. Die Methode wurde verwendet, um Daten über die Wirkung der Temperatur auf die Bauchpigmentierung in einer isogenen Linie von Fliegen zu erwerben. Allerdings könnte die Methodik in Forward-Genetics-Studien verwendet werden, um Gene zu identifizieren, die den Pigmentierungsunterschieden zwischen Individuen, Populationen oder Spezies zug...

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Offenlegungen

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Danksagungen

Diese Arbeit wurde gefördert von National Science Foundation gewährt IOS-1256565 und IOS-1557638 an AWS. Wir danken Patricia Wittkopp und drei anonymen Rezensenten für ihre hilfreiche Kommentare zu einer früheren Version dieses Artikels.

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Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Dumont #5 Biology ForcepsFST11252-30
AgarSigma-Aldrich5040
Dissecting ScopeLeicaMZ16FA
BaseLeicaMDG41
CameraLeicaDFC280
Gooseneck Cold Light SourceSchottACE 1
Image Acquisition Control SoftwareMicro-Manager v1.3.20https://micro-manager.org/
Image Analysis SoftwareImageJhttps://imagej.nih.gov/ij/
Data Analysis SoftwareR 3.3.2https://www.r-project.org/
LEDThor LabsLEDWE-15
MultimeterFlukeFluke 75 Series II
60 mm x 15 mm Petri dishCelltreat Scientific Products229663
Stage micrometerKlarman Rulings, Inc.KR-867

Referenzen

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