מערכת משולבת להפעיל מרחוק אותות תאיים על-ידי Photoactivation קינאז בתיווך Upconversion ננו-חלקיק

Summary

ב פרוטוקול זה, בכלובים קינאז A (PKA), bioeffector התמרה חושית אותות סלולריים, היה מרותק למיטה על משטח ננו-חלקיק microinjected לתוך ציטוזול, מופעל על ידי upconverted UV אור אינפרא אדום (ניר) הקרנה, גרימת מתח הזרם התפוררות סיבים ב ציטוזול.

Abstract

ננו-חלקיק Upconversion (UCNP)-photoactivation בתיווך היא גישה חדשה מרחוק שליטה bioeffectors עם הרבה פחות phototoxicity ועם חדירה לרקמות עמוקות יותר. עם זאת, המכשור הקיים בשוק אינה תואמת ברצון upconversion היישום. לכן, שינוי זמין מסחרית לכלי חיוני עבור מחקר זה. בנייר זה, אנו קודם ממחישים את השינויים של fluorimeter קונבנציונלי ו קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ כדי להפוך אותם תואם לניסויים upconversion פוטון. לאחר מכן נתאר את הסינתזה של-סגול (ניר)-עוררה בכלובים קינאז A קטליטי יחידת משנה של חלבונים (PKA) ותשמרו על מתחם UCNP. פרמטרים עבור microinjection ונהלים photoactivation ניר מדווחים גם. לאחר בכלוב PKA-UCNP הוא microinjected לתוך תאי פיברובלסט REF52, ההקרנות ניר, אשר עדיפה משמעותית על-קונבנציונאלי הקרנת UV, מפעיל ביעילות מסלול התמרה חושית אות PKA בתאים חיים. בנוסף, ניסויים בקרה חיובית ושלילית לאשר כי מסלול PKA-induced שמוביל התפוררות של סיבי סטרס המופעלת באופן ספציפי על-ידי ניר הקרנה. לפיכך, השימוש של חלבון-השתנה UCNP מספק גישה חדשנית לשלוט מרחוק מאופנן אור הסלולר ניסויים, שבה יש להימנע חשיפה ישירה לאור UV.

Introduction

חלבונים ששונו כימית זה יכול להיות photoactivated (למשל, חלבונים PKA בכלוב) פותחו כשדה המתעוררים בביולוגיה כימי לטיפול לא פולשני תהליכים ביוכימיים המערכת^{1,2 ,3}. באמצעות אור כמו גירוי מספק רזולוציה מעולה ייתכן בעת הפעלת אלה בכלוב חלבונים. אולם אור UV יכולה לגרום שינויים מורפולוגיים רצויה אפופטוזיס, נזק לדנ א תאים^4,5. לפיכך, ההתפתחויות האחרונות בעיצוב של קבוצות photocaging מתמקדים הפעלת photocleavage על עירור הגל או שני הפוטונים כדי להפחית את phototoxicity, כמו גם כדי להגביר את רקמות עמוק חדירה^6,7. קבוצות שכולאת המגיבות אורך גל ארוך יותר המאפשר לנו לבחור מתאימים אורכי של uncaging גל (קרי, ערוצי) באופן סלקטיבי להפעיל bioeffectors כאשר שני או יותר קבוצות caging נוכח⁷. בהינתן התכונות השימושיות הבאות, פיתוח קבוצות חדשות photocaging האורות האדומים היא עבודה מאד חשובה במעלה הזרם של מתודולוגיות פוטו אטמוספרי מחקרים ביולוגיים החל בודק את המנגנון של תגובות לשליטה פעילות הסלולר⁸. בכל זאת, קבוצת caging שני הפוטונים הוא בדרך כלל גם הידרופוביות בזכות מבנה הטבעת הארומטית מאוחה, קבוצה caging האור הוא בדרך כלל אורגנומתכתית, עם ליגנדים ארומטי. מאפיין זה הידרופובי/ארומטי אינה מתאימה כאשר bioeffector הוא חלבון או אנזים, כפי שהוא denatures באתר האקטיבציה של החלבון/האנזים גורם לאובדן של הפונקציה, אפילו אם ההטיה ואת פוטוליזה עדיין עובד ברמה הכימית^{2 ,9}.

UCNPs הם מתמרים יעיל זה להמיר את האור עירור ניר UV. מאפיין זה ייחודי ומרתק של UCNPs הציע רזולוציות מציאותי להתייחס לאתגרים הקשורים photoactivation ועורר שחרור מבוקר של מולקולות קטנות, כולל חומצה פולית¹⁰, ציספלטין נגזרים¹¹ , DNA/siRNA¹²קופולימר שלפוחית¹³, חלקיקים חלול¹⁴. עם זאת, לפי מיטב ידיעתנו, photoactivation UCNP בסיוע של אנזימים או חלבונים לא נבדקו עד כה. כי אין שום תיק מוצלח של שימוש באור אדום או ניר photoactive אנזים, לנו היו מתבקש לבצע את ההפעלה המופעלות ניר של מבנה חלבון/אנזים מורכב מתחמי ששונו כימית אנזים בכלוב עם סיליקה מצופים, לנתניד מסטול UCNP¹⁵. במחקר זה, היה UCNP מצומדת עם קינאז התמרה חושית מגיבים במהירות האות בצורה של PKA בכלובים. PKA שולט סינתזה הגליקוגן ורגולציה cytoskeletal המגיבה לגירויים חיצוניים באמצעות מחזורית אדנוזין פוספט (מחנה) תקנה ציטוזול¹⁶. למדנו את הכדאיות של הפעלת אנזים נימוסים הגיאופוליטיות והמרחביות טמפורלית בניסוי הסלולר לאחר הקרנה ניר. פלטפורמה זו בסיוע UCNP photoactivation הוא מתודולוגיה חדשה photoactivate אנזים באמצעות ניר ומונעת את התגובה התמרה חושית אות בלתי רצויה מתאי הנגרמת על ידי קונבנציונאלי UV הקרנה^2,4.

. זה קשה מאוד translocate גדול bioeffectors (למשל, חלבונים) על פני קרום התא כדי לשלוט פעילות תאית. למרות חלבון חלקיקים. מרותק למיטה עשוי להיות קל יותר translocate באמצעות אנדוציטוזה לתוך ציטוזול, ייתכן אנדוציטוזה פגום או מושפל באמצעות מלכודת endosomal ו-^2,את הסוגר השפלה lysosomal⁴. גם אם החלבון בכלוב הוא עדיין מתפקד לאחר רוברטסונית ממברנה, הכמויות translocated אולי לא יהיה מספיק כדי לעורר תגובת תאי ה-^2,17 בניגוד חריף, microinjection היא גישה ישירה ולא כמותיים כדי לספק bioeffectors גדולים אל הציטופלסמה של התא. יתר על כן, bioeffector UCNP. מרותק למיטה דורש אור upconverted להיות מופעל. לכן, מכשור אופטי דורש שינוי כדי למדוד באופן חזותי, לנצל את האור upconversion. בעבודה זאת, המסירה של מתחם PKA-UCNP בכלובים לתא באמצעות microinjection ו חיוניים ספקטרוסקופיה ו מיקרוסקופ השינויים הבאים עבור ניר photoactivation יתוארו בפרוטרוט.

Protocol

הערה: הפרוטוקול מתארת שינוי נתונים היסטוריים אינסטרומנטציה עבור photoactivation בסיוע upconversion, הליך סינתטיים כדי להפיק בכלוב PKA-UCNP, במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) של UCNP מצופה סיליקה ו בכלוב דגימות PKA-UCNP, UV ו ניר פוטוליזה, הכנה תא, PKA-UCNP microinjection, מחקר photoactivation הקמה מתח סיבים ההכתמה של תאים REF52.

1-Fluorimeter ההתקנה עבור מדידת ספקטרום Upconversion

1. להתקין עדשה המטרה X 4 ליד cuvette האוחז ספקטרומטר פלורסצנטיות כך הלייזר ממוקדת אמצע cuvette.
2. מקום tunable 0.5 - ל 8-W 980-ננומטר לייזר דיודה ב- 90° נגד העדשה המטרה.
   התראה: המפעיל צריך ידע בטיחות לייזר ולחבוש משקפי לייזר ניר-
3. יש להתקין מראה השתקפות מלאה בצומת נתיב האור של העדשה אובייקטיבי, לייזר. המקום שחור בציפוי אנודייז לוח מתכת כדי לחסום את החלון עירור של ספקטרוסקופיה וכדי להגן על החלקים הפנימיים.
4. המקום את cuvette של פתרון UCNP מצופה סיליקה (0.2 - 0.6 מ"ג/מ"ל) בהמחזיק cuvette כך קרן upconversion בהיר, ניתן לאבחן והוא יכול לשמש כדי להתאים את היישור אור הטוב ביותר עבור ההתקנה המראה.
5. למצב ספקטרוסקופיה של הפריה חוץ גופית עם הנמוכה מתח PMT (להסתגל הגדרה גבוהה יותר אם האות חלש מדי). להתאים את המראה היישור הטוב ביותר, כאשר הקרן הוא על אמצע cuvette ו- PMT מרים את האות החזק ביותר.
6. למדוד הקשת upconversion, לאחר יישור, עם הגדרת הכוח הרצוי. להשתמש מד כוח ערימת תרמית כדי לבנות את עקומת כיול של עוצמת הלייזר נגד הקריאה הנוכחית חשמל הזרם לייזר. כל הזמן לבדוק את ביצועי לייזר כדי לוודא הביצועים בטווח מכוילת.

2. מיקרוסקופ ההתקנה

הערה: ההתקנה הבאים מתאים מיקרוסקופים מצויד נתיב אופטי בשתי שכבות. אם המשתמש בכוונת התקן מתג מקור האור עירור היציאה האחורית כדי להפוך את הלייזר ניר את הליד לשתף אותה היציאה, קולימטור בנמל גב באופן משמעותי יחסום את ניר כי הוא נועד להפחית את הדגימה חימום. המשתמש חייב לעשות החלטה קשה: לשמור את קולימטור, סובלים יעילות upconversion נמוכה מאוד, או להסיר את קולימטור ולהקריב האינטנסיביות של עירור לאור epifluorescence.

הערה: דיאגרמה שוט הסחה מציג את שיטת נתיב האור ששונה מצלמות-דיגיטליות, מיקרוסקופיה עבור הפריה חוץ גופית upconversion ומצב פוטוליזה ניר ועבור epifluorescence UV פוטוליזה מצב, ואת את הגדרת הניסוי משמש את הניסוי הזה מומחשים איור 2-

מדריך

1. Equip המיקרוסקופ זריחה עם מטאל-הליד אור, ביים לחלק האחורי עם מסמרים
   הערה: בנתיב זה מהשכבה העליונה אור איפה יש צריח קוביה, תנוחה קוביה אחת להיות ריקה כדי לאפשר ניר בא שביל אור מהשכבה התחתונה
2. להתקין לייזר דיודה tunable מסוג nm W 980 0.5 ל- 8.0 בנמל צד ימין, עם קולימטור הצדדית פתוח-
   הערה: זה הגדלת מיקרומטר אור לייזר ספוט לבערך 500 בקוטר כאשר משתמשים בעדשה המטרה X 10. הסרת קולימטור זו יוצרת כתם אור מיקרומטר-טווח והופכת ניר תא הקרנה מעשית. קולימטור הזה הוא ניר-שקוף.
3. להתקין מראה ודיקרואיק זוהר (850 ננומטר קצר מעברים), מסנן עירור (950 nm זמן לעבור) בשביל אור מהשכבה התחתונה
4. להשתמש פתרון UCNP כדי להמחיש את נקודת האור ניר. להתאים את מיקום לייזר כדי למרכז את אלומת האור ניר, שדה הראייה כדי לסיים את היישור.

3. הכנה ולבנות אפיון של כלואים PKA-UCNP

1. Incubate PKA רקומביננטי (9 מיקרומטר) עם 0.5 מ מ 2-nitrobenzylbromide (NBB) ב שכולאת מאגר (20 מ מ טריס-HCl, MgCl של 100 מ מ NaCl, ו- 10 מ מ- ₂; pH 8.5) עבור h 1-2-25 ° C. דובדבני NBB עודף עם 10 מ מ dthiothreitol (DTT), אז dialyze נגד 4-(2-hydroxyethyl) מאגר חומצה piperazine-1-ethanesulfonic (HEPES) (10 מ מ, pH 7.5) כדי להסיר עודפי ריאגנטים ומלח.
   הערה: ה-pH של התמיסה caging היא יורדת מ- 8.5 7.5 במהלך דיאליזה עם HEPES pH 7.5 עבור התגובה הנייח עוקבות.
2. מיקס לנתניד מלחי-Y(CH₃CO₂) ₃ הידרוקסיד (99.9%, 0.4527 g, mmol 1.38 אינץ), י. ב (CH ₃ CO ₂) ₃ הידרוקסיד (99.9%, 0.2533 g, 0.60 mmol) ו- Tm (CH ₃ CO ₂) ₃ הידרוקסיד (99.9%, 0.0168 g, mmol 0.02 נקודות)-octadecene (30 מ ל), חומצה אולאית (12 מ ל), מחממים את התערובת עד 115 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, וניתן עד 50 מעלות צלזיוס. הבא, לפזר את תערובת התגובה בפתרון methanolic (20 מ ל) עם 0.2 גרם (5.0 mmol) של NaOH גלולה, 0.2964 גר' (8 mmol) אמוניום פלואוריד על ידי sonication במשך 15 דקות ולהגדיל את טמפרטורת התגובה עד 300 ° C כדי לקבל את ליבת UCNP (β-NaYF ₄ : Tm 1.0% ^{3 +} / י. ב 30% ^{3 +}) חלקיקים.
3. להמיס את ליבה חלקיקים (25 מ ג) עם CO-520 (0.5 מ"ל) בציקלוהקסאן (10 מ"ל). הוספת אמוניה (wt 30% v/v, 0.08 mL) ו tetraethylorthosilicate (הפנסיון, 0.04 mL) ולהחיל בחישה מתמדת במשך 12 שעות בטמפרטורת החדר, כדי לקבל את מצופה סיליקה β-NaYF ₄: 1.0%Tm ^{3 +} /30%Yb ^{3 +} הליבה חלקיקים.
4. דגירה של PKA (6 nmol) או בכלוב PKA (6 nmol) עם UCNP (מ ג 1) ¹⁵ מאגר HEPES (10 מ מ, pH 7.5) ב 4 ° C עבור 3 h כדי לשתק את PKA על מצופה סיליקה UCNP דרך אינטראקציות אלקטרוסטטית.
5. לסנן את התערובת באמצעות מסנן PVDF (0.45 מיקרומטר), צנטריפוגה-17,000 x g 10 דקות ב 4 ° C, ו- redisperse בגדר ב- HEPES (50 µL, 10 מ מ, pH 7.5) 0.1% המכיל חלבון מייצב להשיג המתחם PKA-UCNP מטוהרים. צנטריפוגה-17,000 g x 10 דקות ב 4 ° C ולאסוף את תגובת שיקוע עבור וזמינותו ברדפורד צינור 1.5-mL-
6. לנתח את PKA מאוגדות ב תגובת שיקוע הציל מכל שלב 3.5 עם שיטת ברדפורד הגב-לחשב את רמת החלפת PKA על החלקיקים UCNP, אשר בדרך כלל יש רמה החלפה של ~ nmol 4.5 של PKA לכל מ"ג של החלקיקים.
   הערה: וזמינותו ברדפורד חושף צבע כחול חזק על כדורי, אשר מרמז על הנייח חלבון ברמה ויציבה ללא desorption, בעוד חלק מהיממה supernatant בכלוב PKA-UCNP פתרון מראה בצבע דומה (מאגר HEPES איור 4 c-4e).

4. אפיון

הערה: וזמינותו קינאז משמש לכמת את הפעילות הספציפי של פירובט קינאז. בקצרה, זירחון של פפטיד, אשר זה משולב פירובט קינאז, לקטט דהידרוגנאז, תוצאות החמצון של NADH. היווצרות של האחרונים מנוטרת על ידי מדידה של הפחתת ספיגת של NADH-340 nm.

1. לקבוע הפעילות של PKA ו- PKA-UCNP ב- 60 µL הנפח הכולל של תערובת assay המכיל 4-morpholinepropanesulfonic חומצה (סחבות, 100 מ מ, pH 7.5), אשלגן כלורי (100 מ מ), phosphoenolpyruvate (עידוד, 1 מ מ), אדנוזין טריפוספט (ATP, 1 מ מ), β - nicotinamide אדנין dinucleotide, מופחתת טופס (NADH, 0.8 מ מ), מגנזיום כלוריד (MgCl ₂, 1 מ מ), kemptide (0.4 מ מ), תערובת דהידרוגנאז קינאז/לקטט פירובט (30-40 יחידות של PK/LDH).
2. למדוד של הפחתת ספיגת NADH לאורך זמן לאחר התוספת של PKA פתרון (2 µL) לתערובת וזמינותו. לחשב את השיפוע של קו שישקף את פעילות קינאז הנמדדים ישירות.
3. מודדים את הפעילות של PKA-UCNP ¹⁵, את הפעילות הכללית, אשר צריכים להיות תואמים את המוצר כפל של פעילות ספציפית PKA יליד ואת הסכום המחושב משטח מצופה PKA.

5. פוטוליזה ההתקנה

1. אותייור כל הכוח של האור מקורות באמצעות חיישן תרמי ערימת ולחשב כוח צפיפות (PD = כוח (W) / אזור (² ס מ)) ¹⁸ בהתבסס על האזור ספוט אור.
2. לבצע ניסויים במבחנה UV פוטוליזה על מערכת מסחרית עם 365 nm LED (200 mW/cm ²) ¹⁵-
3. Photoactivation עבור UV על הבמה מיקרוסקופ, להאיר את הפתרון PKA-UCNP עם עירור אור המסוננות לפי הקוביה מסחרי ¹⁵.
   הערה: צפיפות כוח היא ~ 15 mW/cm ², בלי מטרה העדשה למקד.
4. עבור במבחנה ניר photoactivation על הבמה מיקרוסקופ, להאיר את הפתרון PKA-UCNP באמצעות לייזר nm 980 עם הגדרות מסנן/ראי upconversion מותאם אישית מותקן על השביל אור מהשכבה התחתונה, מראה ודיקרואיק זוהר (850 ננומטר קצר-מעבר), ו מסנן עירור (950 nm ארוך מעברים).
   הערה: צפיפות כוח פלט הוא W/ס מ 5 ² לפני 4 X עדשה המטרה תוך התמקדות. צפיפות כוח מוערך ~ W/cm 68 ² אחרי 4 X עדשה המטרה תוך התמקדות.

6. התא הכנת הדוגמא Microinjection של מתחמי PKA-UCNP

1. מראש לסנן את הדגימות דרך מסנן מיקרומטר 0.45 לאחר PKA הנייח (שלב 3.5).
2. דגירה התאים ב- 10% סרום שור עוברית (FBS) המכילים L-15 בינוני במהלך תקופת microinjection לשליטה יציבה pH מחוץ החממה.
   הערה: כדי לוודא השלמת microinjection, שותף להחדיר את PKA מקורי-UCNP, UCNP-PKA בכלוב או PEGylated UCNP (7.5 מ"ג/מ"ל) ¹⁵ 5 (6)-carboxytetramethylrhodamine (טמרה) (10 מיקרומטר) ב לתאים.
3. להתאים את ריכוז החלקיקים PKA-UCNP כזה, לאחר microinjection, הריכוז cytosolic הוא 1-3 μM PKA - טווח הריכוז פיזיולוגי עבור PKA בתא, עם ההנחה כי אמצעי האחסון הזרקת הוא 1/10 של תאי האחסון .
4. לבצע את microinjection לתוך התאים (שלב 6.2) באמצעות מכשיר microinjector יחד עם micromanipulator הידראולי ציר אחד ( איור 3).
5. שימוש מד לחץ דיגיטלי לעקוב אחר למידת הלחץ המופעל על ידי microinjector נמצא טווח ההפעלה (~ 50-200 hPa) לאטום את השסתום מנפק בחדר לכאורה מותאמים אישית כדי לספק פיצוי לחץ microinjection. למשוך חזרה את המחט באמצעות של פולר.
6. לשמור על הלחץ הזרקת בין 50 ו 75 hPa, עם מועד ההזרקה של 200-300 ms והלחץ פיצוי-hPa 15 כדי למנוע התרבות בינוני זרם אחורי לתוך מחט על ידי נימיות.
7. לבחון את הפתחים עצה של המחטים כדי להבטיח כי יש להם קוטר חיצוני בין 1.3, 1.5 מיקרומטר, אשר יכול להיות מאושרות על ידי לקיחת תמונות באמצעות עדשה המטרה 40 x.
8. לרחוץ את התאים עם 2 מ"ל של מדיום L-15 המכיל 10% FBS לאחר microinjection. להתבונן ההדמיה פלורסצנטיות הסלולר מ 5 (6) - carboxytetramethyl - rhodamine (טמרה) כדי לאשר השלמה microinjection.

7. Photoactivation של כלואים PKA-UCNP באמצעות UV או ניר אור בתאים חיים

photoactivation

1. עבור UV לאחר microinjection PKA-UCNP, לגדל את התאים REF52 בצלחת מיקרומטר 3.5, למקם אותם על הבמה מיקרוסקופ, להאיר אותם באור UV מסוננת על-ידי הקוביה למשך 3 דקות בלי מטרה העדשה למקד.
   הערה: REF52 התאים היו בהשתתפות DMEM המכיל 10% FBS ב 37 מעלות צלזיוס 5% CO ₂, ואז התאים היו subcultured confluency הגיע ל- 90% כל 2-3 ימים.
2. Photoactivation עבור ניר לאחר PKA-UCNP microinjection, להאיר את התאים על לייזר 980-nm מההגדרות מהשכבה התחתונה מסנן/ראי, כפי שמתואר בשלב 5.4.
   הערה: הפלט צפיפות כוח הוא W/ס מ 5 ² לפני 10 X עדשה המטרה תוך התמקדות, מוערך W/cm 300 ² לאחר 10 x עדשה המטרה תוך התמקדות. Upconversion הוא תהליך הדורש צפיפות הפוטונים גבוהה, במיוחד כאשר משמרת anti-Stoke גדולה יותר יש צורך. לפיכך, תוך התמקדות נדרש במהלך photoactivation.
3. כאשר נקודת אור גדולה יותר (650 מיקרומטר x 520 מיקרומטר) נדרשת, לעורר תאים אלה עם ניר ממוקד על ידי עדשה המטרה 10 x עם קולימטור במשך 15 דקות אפשר עבור מרווח כהה 5 דקות לאחר כל הקרנה 5-מין כדי למנוע חימום.
   הערה: כאשר מרחבית-רזולוציה גבוהה (במקום אור subcellular) יש צורך, להשתמש העדשה המטרה X 40 עם הקדמוניות מותקן בסוף היציאה של המדריך אור כדי ליצור כתם אור subcellular-מימד (5 מיקרומטר x 4 מיקרומטר). במקרה זה, 1 s של הקרנה מספיקה ניר photoactivation עקב שטף גבוה של פוטונים.
4. פוטוליזה לאחר UV או ניר, לאפשר את התאים להתאושש ב CO 5% ₂ החממה ב 37 ° C עבור h 1 בינוני מלא ליצירת תגובות הסלולר. לאחר מכן, לתקן אותם ב- 1 מ ל תמיסת 4% paraformaldehyde/פוספט-buffered (PBS) כעשרים דקות לפני עוד יותר להכתים.
   התראה: Paraformaldehyde הוא רעיל מאוד; להימנע ממגע עם העור, העיניים או הקרומים הריריים. להימנע נושם את האבקה במהלך מדידת והכנות.

8. ויזואליזציה של התפוררות סיבים מתח נגרמת על ידי ניר Photoactivation

1. לאחר קיבוע, השתמש אלקסה 594-phalloidin (להוסיף µL 5 בפתרון מניות מיקרומטר 6.6 µL 200 ל- PBS עבור צביעת; תקופת דגירה של 25 דקות בטמפרטורת החדר) כתם ו דמיינו את סיבי סטרס. לדמיין את התמונות של אלקסה 594-phalloidin (לשעבר 581 nm/Em 609 ננומטר) באמצעות ערכת מסנן.
2. דגירה את התאים עבור 5 דקות 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (דאפי) בטמפרטורת החדר. לאחר צביעת, לשטוף את הדגימות עם PBS ולקחת בנפרד פלורסנט תמונות של סיבי סטרס, גרעינים.

תוצאות

העיצוב של הבונה אנזים בכלוב-UCNP מודגם באיור1. האנזים PKA היה תחילה הגיבו 2-nitrobenzyl ברומיד ליצירת של PKA בכלוב אינו פעיל, זה היה אז electrostatically ללא יכולת תנועה על פני השטח של UCNP. UCNPs פולטים אור upconverted, וכתוצאה מכך photolytically קליב הקבוצות o-nitrobenzyl על Cys 199 ואת Cys 343, יוצר את PKA ?...

Discussion

בעבר, הופמן ועמיתים מצא כי שינויים מורפולוגיים דרמטי נצפו בתאים REF52 לאחר microinjection של PKA חופשי¹⁹. במחקר אחר, קבוצת לורנס הוכיח כי PKA בכלוב יכול להיות מופעל ויוו, המוביל שינויים מורפולוגיים התפוררות של סיבי סטרס כאשר נתון UV פוטוליזה²⁰. מוקדם יותר דיווח על ניצול אור ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma	154563
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M9272
MOPS	Sigma	M1254
HEPES	Sigma	H4034
Sodium chloride	Sigma	31434
Potassium chloride	Sigma	12636
Yttrium acetate hydrate	Sigma	326046	Y(C2H3CO2)3 · xH2O
Thulium(III) acetate hydrate	Alfa Aesar	14582	Tm(CH3CO2)3 · xH2O
Ytterbium(III) acetate tetrahydrate	Sigma	326011	Yb(C2H3O2)3 · 4H2O
1-Octadecene	Sigma	O806
Oleic acid	Sigma	364525
Methanol	macron	304168
Sodium hydroxide	Sigma	30620
Ammonium fluoride	J.T.Baker	69804
IGEPAL CO-520	Sigma	238643
Cyclohexane	J.T.Baker	920601
Ammonium hydroxide (28% - 30%)	J.T.Baker	972101	Ammonia
Tetraethyl orthosilicate (TEOS)	Sigma	8658
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D0632
N-hydroxymaleimide (NHM)	Sigma	226351	PKA activity blocking reagent
Prionex protein stabilizer solution from hog collagen	Sigma	81662	Protein stabilizer solution
2-nitrobenzyl bromide (NBB)	Sigma	107794	PKA caging reagent
8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt	Sigma	C3912	8-CPT-cAMP
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle	Sigma	P0294	PK/LDH
Adenosine 5'-triphosphate disodium	Sigma	A2387	ATP
β-NADH reduced from dipotassium	Sigma	N4505
Phosphoenolpyruvate	Sigma	P7127	PEP
Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mL	Thermo Scientific	23200	Bradford assay reagent
cAMP-dependent protein kinase	Promega	V5161	PKA activity control
pET15b-PKACAT plasmid	Addgene	#14921
pKaede-MC1 plasmid	CoralHue	AM-V0012
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Thermo Scientific	10010023
DMEM, high glucose, pyruvate	Gibco	12800-017	Cell culture medium
Leibovitz L-15 Medium	Biological Industries	01-115-1A	Cell culture medium
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1A
Paraformaldehyde	ACROS	416785000
DAPI	Invitrogen	D1306	Nucleus staining dye
Alexa 594-phalloidin	Invitrogen	A12381	F-actin staining dye
5(6)-Carboxytetramethylrhodamine	Novabiochem	8.51030.9999
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23200
CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12,000 - 14,000 Da	Membrane Filtration Products, Inc.	1430-33	Dialysis membrane
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized	EMD Milipore	SLHVX13NL
Equipment
Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS	Malvern	M104
Transmission Electron Microscope	JEOL	JEM-1400
Fluorescence Spectrophotometer	Agilent Technologies	10075200	Cary Eclipse
UV-Vis Spectrophotometer	Agilent Technologies	10068900	Cary 50
Fluorescence Microscope	Olympus	IX-71
950 nm longpass filter	Thorlabs	FEL0950
850 nm dichroic mirror shortpass	Chroma	NC265609
RT3 color CCD system	SPOT	RT2520
Fluorescence Illumination	PRIOR	Lumen 200
980 nm Infra-red diode laser	CNI	MDL-N-980-8W
UV LED Spot Light Source	UVATA	UVATA-UPS412	With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2
Thermal pile sensor	OPHIR	12A-V1-ROHS
Picospritzer III	Parker Hannifin	052-0500-900	Intracellular Microinjection Dispense Systems
PC-10 Needle puller	Narishige	PC-10
MANOMETER Digital pressure gauge	Lutron	PM-9100
One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator	Narishige	MMO-220A
Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated	Thermo Scientific	75002421