원격으로 업 컨버전 나노 중재 니 Photoactivation에 의해 세포내 신호 변환 하는 통합된 시스템

요약

이 프로토콜에 갇힌된 단백질 키 니 아 제 A (PKA), 셀룰러 신호 변환 bioeffector 나노 입자 표면에 움직일, cytosol에 microinjected 이었고 upconverted 근처-적외선 (NIR) 방사선에서 자외선에 의해 활성화 유도 다운스트림 스트레스는 cytosol에서 섬유 분해.

초록

업 나노 (UCNP)-중재 photoactivation 원격 제어 bioeffectors 훨씬 적은 phototoxicity와 깊은 조직 침투 하는 새로운 접근입니다. 그러나, 시장에 기존 계측 쉽게 업 응용 프로그램과 호환 되지 않습니다. 따라서, 상업적으로 이용 가능한 악기 수정이 연구에 대 한 필수적입니다. 이 논문에서는, 우리가 먼저 기존의 fluorimeter와 광자 업 실험에 대 한 호환 수 있도록 형광 현미경의 수정을 보여 줍니다. 다음 우리는 근처-적외선 (NIR)의 합성을 설명-갇힌된 단백질 키 니 아 제 A 촉매 소 단위 (PKA) UCNP 복합물에 움직일 트리거. Microinjection 및 NIR photoactivation 절차에 대 한 매개 변수는 또한 보고 했다. 갇힌된 PKA UCNP REF52 fibroblast 세포에 microinjected는, 후는 기존의 UV 방사선에 상당히 우수한, NIR 방사선 살아있는 세포에서 PKA 신호 변환 통로를 효율적으로 트리거합니다. 또한, 긍정적이 고 부정적인 제어 실험 스트레스 섬유의 해체에 지도 하는 PKA 유도 통로 적외선 조사에 의해 트리거됩니다 구체적으로 확인 합니다. 따라서, 단백질 수정 UCNP 사용 하 여 빛 변조 세포 실험, 자외선에 직접 노출 피해 야 한다를 원격으로 제어 하는 혁신적인 접근 방식을 제공 합니다.

서문

Photoactivated (예를 들면, PKA 갇힌 단백질)을 될 수 있는 화학적 수정된 단백질 화학 생물학 세포 생화학 프로세스^{1,2 비 접촉 조작 하는 신흥 분야로 개발 되었습니다. 3}. 이 활성화할 때 우수한 spatiotemporal 해상도 제공 하는 자극으로 빛을 사용 하 여 단백질 갇힌. 그러나, UV 빛 원치 않는 형태학, apoptosis, 변화와 셀^4,5에 DNA 손상을 일으킬 수 있습니다. 따라서, photocaging 그룹의 최근 개발 디자인에 phototoxicity, 또한 깊은 조직 침투^6,7증가로 줄이기 위해 긴 파장 또는 2 광자 여기 시 photocleavage를 사용에 초점을. 배우면 그룹 있도록 적당 한 uncaging 파장 (즉, 채널)을 선택 하는 것을 선택적으로 더 긴 파장에 반응 활성화 bioeffectors 두 개 또는 더 배우면 그룹은 현재⁷. 이러한 유용한 기능을 감안할 때, 새로운 레드 라이트 photocaging 그룹 개발⁸세포 활동 제어 하는 반응의 메커니즘을 탐색에서 배열 하는 생물학 학문을 위한 광화학 방법론에서 매우 중요 한 상류 작업 이다. 그럼에도 불구 하 고, 2 광자 배우면 그룹 일반적으로 너무 소수 융합된 향기로운 반지 구조 때문 이며 가시광선 배우면 그룹은 일반적으로 유기, 향기로운 ligands. 이 소수 성/향기로운 속성은 bioeffector은 단백질 또는 효소, 효소/단백질의 활성화 사이트를 변성 하 고 활용 및 photolysis^{2 화학 수준에 아직도 작동 하는 경우에 함수의 손실이 발생 하는 경우 적합 하지 않습니다. ,9}.

UCNPs는 UV에 적외선 여기 빛을 변환 하는 효율적인 트랜스듀서. 과제를 해결 하기 위해 현실적인 해상도 photoactivation와 관련 된 및 작은 분자, 엽 산¹⁰를 포함 하 여 cisplatin 파생 상품^{11의 제어 릴리스 트리거 UCNPs의이 독특하고 매혹적인 속성 제공} , DNA/siRNA¹², 공중 합체의 소포¹³, 그리고 빈 입자¹⁴. 그러나, 우리의 지식의 최선을, 효소 또는 단백질의 UCNP를 이용한 photoactivation는 테스트 되지 지금까지. 사용 하 여 붉은 빛 또는 적외선 광 효소의 성공적인 경우 있기 때문에, 우리는 실리 카 코팅와 화학적 수정된 갇힌된 효소 복합물의 구성 하는 단백질/효소 구조의 NIR 트리거 활성화를 수행 하 라는 메시지가 표시 했다 란타넘족 실수로 UCNP¹⁵. 이 연구는 UCNP 갇힌된 PKA의 형태로 빠르게 반응 신호 변환 키로 활용 했다. PKA는 glycogen 합성 cytosol¹⁶순환 아데노신 인산 염 (야영지) 규제를 통해 외부 자극에 응답 하는 cytoskeletal 규칙을 제어 합니다. 우리는 적외선 방사선 조사 후 세포 실험에서 시간적, 공간적 매너에서 효소 활성화의 가능성을 공부 했습니다. 이 UCNP 기반 photoactivation 플랫폼 photoactivate에 새로운 방법론 NIR를 사용 하 여 효소 이며 기존의 UV 방사선 조사^2,4로 인 한 세포에서 원하지 않는 신호 변환 응답을 피 한다.

그것은 매우 어려운 큰 bioeffectors를 이동 (예를 들어, 단백질) 세포 활동을 제어 하는 세포 막에 걸쳐. 단백질 입자 움직일 수 있지만 쉽게 하는 cytosol로 endocytosis를 통해 이동, endocytosis 손상 또는 endosomal 함정 및 필연적인 lysosomal 저하^2,4통해 저하 수 있습니다. 갇힌된 단백질은 막 전 후 여전히 기능, 경우에 translocated 금액 세포질 응답^2,17를 일으킬 정도로 되지 않을 수 있습니다. 예리한 대조에서는, microinjection 세포의 세포질에 큰 bioeffectors를 제공 하는 직접적이 고 양적 접근 이다. 또한, UCNP 움직일 bioeffector upconverted 빛을 활성화 해야 합니다. 따라서, 광학 계측 해야 추가 측정, 시각화, 업 라이트를 활용 하는 수정을 합니다. 이 작품에서는, NIR photoactivation에 대 한 microinjection 및 다음 필수 분광학과 현미경 수정을 사용 하 여 셀에 갇힌된 PKA UCNP 복합물의 배달 자세히 설명 합니다.

프로토콜

참고: 프로토콜 업 기반 photoactivation에 대 한 자세한 계측 수정, 생성 하는 합성 절차 갇힌 PKA-UCNP, 실리 카 코팅 UCNP의 전송 전자 현미경 (TEM) 그리고 갇힌 PKA UCNP 샘플, 자외선과 NIR photolysis 설치, 셀 준비, PKA-UCNP microinjection, photoactivation 연구 및 REF52 세포의 스트레스 섬유 얼룩.

1. 업 스펙트럼 측정을 위한 Fluorimeter 설치

1. 레이저는 베트의 중간에 초점을 맞추고 형광 분석기의 베트 홀더 옆 4 X 객관적 렌즈 설치.
2. 가변 0.5-8 W 980 nm 레이저 다이오드는 렌즈에 대 한 90 ° 장소.
   주의: 연산자 레이저 안전 지식을 하 고 NIR 레이저 고글을 착용 해야.
3. 렌즈와 레이저의 빛 경로 교차점에 전체 반사율 거울을 설치합니다. 검은 anodized 금속 접시 분광학의 여기 창 차단 하 고 내부 부품을 보호 하기 위해 배치.
4. 실리 카 코팅 UCNP 솔루션 (0.2-0.6 mg/mL)의 멧을 베트 홀더 에서도 밝은 업 컨버전 빔 구상 될 수 있다 고 거울 설치에 대 한 최고의 빛 정렬을 조정 하는 데 사용할 수 있습니다.
5. 최저 PMT 전압 설정으로 발광 모드는 분광학 전환 (신호가 너무 약한 경우 더 높은 설정을 조정). 멧의 중간에 광속은 고는 PMT 강한 신호를 선택 최고의 맞춤 미러 조정.
6. 맞춤 원하는 전원 설정 후 업 스펙트럼을 측정합니다. 열 더미 전력 측정기를 사용 하 여 레이저 전력 공급에 전기 현재 독서에 대 한 레이저 파워의 보정 곡선을 건설. 끊임없이 성능 보정된 범위 안에 있는지 확인 하기 레이저 성능 확인.

2. 현미경 설치

참고: 다음 설치 현미경 2 계층 광학 경로 갖춘 작품. 사용자가 다시 포트 적외선 레이저와 같은 포트를 공유 하는 할로겐 램프를 여기 광원 스위치를 설치 하고자 하는 경우 샘플 난방을 감소 하도록 설계 되었습니다 때문에 다시 포트에 겨냥 틀에는 NIR 차단 크게 됩니다. 사용자는 어려운 선택을 해야 합니다:는 겨냥 틀을 계속 매우 낮은 업 효율성에서 고통 또는 제거는 겨냥 틀 하 고 여기는 epifluorescence에 대 한 빛의 강도 희생.

참고: 수정 된 spectrofluorometer, 업 발광 및 NIR photolysis 모드와 epifluorescence 및 UV photolysis 모드, 그리고 실험 설정에 대 한 현미경 검사 법에 대 한 가벼운 경로 체계를 보여주는 장면 전환 다이어그램 이 실험을 위해 사용 하는 그림 2에 나와 있습니다.

장비 금속 할로겐 빛과 형광 현미경

가이드, 뒤에 지시 포트
참고:이 상위 계층 빛 경로에서 큐브 포 탑은, 하나의 큐브 위치 NIR 낮은 계층 빛 경로에서 오는 수 있도록 비어 있어야
1. 오른쪽 포트를 오픈 사이드 포트 겨냥 틀에 가변 0.5 8.0 W 980 nm 레이저 다이오드 설치.
   참고:이 10 X 객관적 렌즈 사용 하는 경우는 레이저 빛 자리 약 500 µ m 직경에서 확대 합니다. 이 겨냥 틀 제거 마이크로미터 범위 빛 자리에 결과 그리고 NIR 셀 방사선을 허무 하 게. 이 겨냥 틀은 NIR-투명.
2. Dichroic 거울 (850 nm 짧은 패스)와 하위 계층 빛 경로에 여기 필터 (950 nm 긴 패스) 설치
3. 는 UCNP 솔루션을 사용 하 여 시각화 NIR 빛 자리. 가운데 맞춤을 완료 시야에서 NIR 광선에 레이저의 위치를 조정.

3. 준비 및 특성화의 갇힌 PKA UCNP 구성

1. 품 재조합 PKA (9 µ M)에 1-2 h 25에 대 한 버퍼 (20 mM Tris HCl, 100 mM NaCl, 그리고 10 mM MgCl ₂, pH 8.5)를 고른다면 2-nitrobenzylbromide (NBB) 0.5 m m와 ° C. 끄다 10 m m dthiothreitol (DTT)와 초과 NBB 다음에 대 한 4-(2-hydroxyethyl) dialyze 고 piperazine-1-ethanesulfonic 산 (HEPES) 버퍼 (10 m m, pH 7.5) 초과 시 약 및 염 분 제거.
   참고: 배우면 솔루션의 pH는 인하 8.5에서 7.5 HEPES ph 7.5 후속 동원 정지 반응에 대 한 투 석 중.
2. 믹스 란타넘족 소금-Y(CH₃CO₂) ₃ 수화물 (99.9%, 0.4527 g, 1.38 mmol), Yb (채널 ₃ CO ₂) ₃ 수화물 (99.9%, 0.2533 g, 0.60 mmol)과 Tm (채널 ₃ CO ₂) ₃ 수화물 (99.9%, 0.0168 g, 0.02 m m o l)-octadecene (30 mL), 올레산 (12 mL)에서 30 분 동안 115 ° C에 혼합물을가 열 하 고 50 ° c.에 멋진 다음, NaOH 펠 릿의 0.2 g (5.0 m m o l)와 methanolic 솔루션 (20 mL)에 반응 혼합물을 녹이 고 0.2964 g (8 mmol) 쥡니다 15 분 대에 의해 염화 불 화물의 증가 (β-NaYF ₄ UCNP 코어를 300 ° C에 반응 온도 : 1.0 %Tm ^{3 +} / 30 %Yb ^{3 +}) 나노.
3. 는 코어 나노 입자 (25mg) 공동-520 (0.5 mL)와 cyclohexane (10 mL)에 녹. 암모니아 (wt 30 %v / v, 0.08 mL)와 tetraethylorthosilicate (TEOS, 0.04 mL)을 추가 하 고 적용 하는 실리 카 코팅 β-NaYF ₄를 실 온에서 12 h에 대 한 지속적인 교 반: 1.0%Tm ^{3 +} /30%Yb ^{3 +} 코어 nanoparticles.
4. 는 PKA를 품 어 (6 nmol) 또는 갇힌 PKA (6 nmol) HEPES buffer (10 m m, pH 7.5) 3 h 정전기 상호 작용을 통해 UCNP 실리 카 코팅에 PKA 무력화를 위한 4 ° C에서에서 UCNP (1 mg) ¹⁵.
5. 는 PVDF 필터 (0.45 μ m), 4 ° C에서 10 분 동안 17000 x g에서 원심 분리기를 사용 하 여 혼합물을 필터 및 정화 PKA UCNP 복잡 한을 얻으려면 HEPES (50 µ L, 10 m m, pH 7.5) 포함 0.1% 단백질 안정제에 펠 릿을 redisperse. 4 ° C에서 10 분 동안 17000 x g에서 원심과 1.5 mL 튜브에 Bradford 분석 실험에 대 한 상쾌한 수집.
6. 분석 UCNP 입자에 PKA 대체 수준을 다시 계산을 상쾌한 단계 3.5 Bradford 분석 실험에서에서 저장에 무제한 PKA는 일반적으로의 대체 수준을 ~ 입자의 밀리 그램 당 PKA의 4.5 nmol.
   참고: Bradford 분석 실험 밝혀 탈 착 없이 높은 수준과 안정적인 단백질의 동원 정지를 건의 하는 펠 릿에는 강한 파란 색깔의 표면에 뜨는 분수 갇힌 PKA UCNP 솔루션 보여준다 색상 HEPES 버퍼 (비슷한 그림 4 c-4e).

4. 특성화

참고: 니 분석 결과 특정 pyruvate 키 니 아 제 활동을 계량 하는 데 사용 됩니다. 간단히, pyruvate 키 니 아 제 및 젖 산 효소를 결합 하 여 펩 티 드의 인 산화에서 NADH의 산화 결과. 후자의 형성은 340 NADH의 흡 광도 감소를 측정 하 여 모니터링 nm.

결정 4 morpholinepropanesulfonic 산 (MOPS, 100 m m, pH 7.5)를 포함 하는 분석 결과 혼합물의 60 µ L 전체 볼륨에서 PKA와 PKA UCNP의 활동

KCl (100mm), phosphoenolpyruvate (흠, 1 m m), 아데노신 3 인산 염 (ATP, 1 m m), β- 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드, 형태 (NADH, 0.8 m m), 염화 마그네슘 (MgCl ₂, 1 m m), kemptide (0.4 m m), 그리고 pyruvate 키 니 아 제/젖 산 효소 혼합물 (PK/LDH의 30/40 대) 감소.
1. 는 PKA 솔루션 (2 µ L) 분석 결과 혼합물을의 추가 후 시간이 지남에 NADH의 흡 광도 감소를 측정합니다. 직접 측정 되 고 키의 동작을 반영 하는 선의 기울기 계산.
2. PKA UCNP ¹⁵의 활동 및 네이티브 PKA 특정 활동 및 계산 PKA 표면 코팅의 곱셈 제품와 잘 일치 한다 전반적인 활동 측정.

5. Photolysis 설치

1. Measure는 빛의 모든 힘 열 더미의 센서를 사용 하 여 및 전력량 계산 (PD = 전력 (W) / 지역 (cm ²)) ¹⁸ 빛 반점 지역에 따라.
2. Photolysis 실험에서 체 외에 UV 365 nm LED (200 mW/cm ²) ¹⁵ 상업 시스템에 수행.
3. 현미경 스테이지에 대 한 UV photoactivation 조명 상업 큐브 ¹⁵ 필터링 여기 빛 PKA UCNP 솔루션.
   참고: 전원 밀도 ~ 15 mW/cm ², 렌즈 초점 없이.
4. 생체 외에서 NIR photoactivation 현미경 무대에,에 대 한 조명 아래 계층 빛 경로, dichroic 거울 (850 nm 짧은 패스)에 설치 사용자 지정된 업 컨버전 필터/미러 설정으로 980 nm 레이저를 사용 하 여 PKA UCNP 솔루션 및 여기 필터 (950 nm 긴 패스).
   참고: 출력 전력 밀도 4 X 렌즈 초점 전에 5 W/c m ²입니다. 전력 밀도 추정 됩니다 ~ 4 렌즈 초점 X 후 68 W/c m ².

6. 샘플 준비 및 Microinjection의 PKA UCNP 단지 셀

1. 0.45 μ m 필터를 통해 PKA 동원 정지 (3.5 단계) 후 샘플을 미리 필터링.
2. 품 어 L-15 매체를 포함 하는 인큐베이터에 밖에 서 안정적인 pH 컨트롤에 대 한 microinjection 기간 동안 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)에 셀.
   참고: microinjection 완료 확인, 공동 투입 네이티브 PKA-UCNP, UCNP-갇힌된 PKA, 또는 PEGylated UCNP (7.5 mg/mL) ¹⁵ 5 (6)-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA)와 (10 µ M)에 셀.
3. 조정 PKA UCNP 입자의 농도, microinjection, 후 cytosolic 농도 1-3 μ M PKA-PKA 셀, 가정 주사 볼륨 세포 볼륨의 1/10에에서 대 한 생리 적인 농도 범위 .
4. 셀 (6.2 단계)로 microinjection를 수행 1 축 유압 micromanipulator ( 그림 3)와 결합 하는 microinjector 장치를 사용 하 여.
5. 사용 디지털 압력 게이지는 microinjector에 의해 적용 압력을 모니터링 하는 동작 범위 (~ 50-200 hPa) microinjection에 대 한 보상 압력을 제공 하기 위해 사용자 지정 된 압박 챔버에 분배기 밸브를 봉인. 철수는 끌어당기는 사람을 사용 하 여 바늘.
6. 50 및 75 hPa, 200-300 ms와 모 세관 작용에 의해 바늘으로 문화 매체 역류를 방지 하기 위해 15 hPa에서 보상 압력 주입 시간 사이 사출 압력 유지.
7. 있도록 그들은 40 x 객관적 렌즈를 사용 하 여 이미지를 복용 하 여 확인 될 수 있는 1.3 및 1.5 µ m, 외부 직경 바늘의 팁 채용 검사.
8. L-15 매체 포함 하는 10%의 2 mL로 세포 세척에서 microinjection 후 FBS. 5 (6)-carboxytetramethyl-rhodamine (TAMRA) microinjection 완료 확인에서 세포 형광 이미징 관찰.

7. Photoactivation의 갇힌 PKA UCNP를 사용 하 여 UV 또는 생활 세포에서 NIR 빛

PKA UCNP microinjection 후

1. UV에 대 한 photoactivation 3.5 µ m 접시 REF52 셀 성장 하 고 현미경 스테이지에 배치 하 고, 자외선에 의해 필터링과 그들을 비추는 렌즈 초점 없이 3 분에 대 한 큐브.
   참고: 셀에 10% 포함 된 DMEM 유지 되었다 REF52 5% CO ₂ 배양 기 및 셀에서 37 ° C에서 FBS 했다 subcultured는 confluency에 도달 하면 90%를 2-3 일 마다.
2. PKA UCNP microinjection 후에 NIR photoactivation 조명 낮은 계층 필터/미러 설정에서 980 nm 레이저에 셀 5.4 단계에서 설명한 대로.
   참고: 출력 밀도 5 W/c m ² 렌즈 초점 X 10 전에 이며 렌즈 초점 x 10 후 300 W/c m ²을 것으로 추정 된다. 업은 anti-Stoke 교대 큰 필요한 경우에 특히 높은 광자 밀도 요구 하는 프로세스입니다. 따라서, photoactivation 동안 필요한 초점.
3. 큰 백색 반점 (650 µ m x 520 µ m) 필요한 경우, NIR을 난방을 피하기 위해 모든 5 분 방사선 조사 후 5 분 어두운 간격 15 분 허용에 대 한 겨냥 틀을 10 배 대물 렌즈에 의해 집중 된 이러한 셀을 비추는.
   참고: 때 높은 공간 해상도 (subcellular 백색 반점) 필요, 라이트 가이드의 출구 끝에 설치 된 작은 구멍으로 40 X 객관적 렌즈를 사용 하 여 subcellular 차원 빛 자리 (5 µ m x 4 µ m)를 생성 합니다. 이 경우, 1 s 방사선의 NIR photoactivation 광자의 높은 유출 때문에 충분 하다.
4. 후 자외선 또는 적외선 photolysis는 5% CO ₂ 인큐베이터에서 37 ° C에서 1 h 세포 응답을 생성 하는 완전 한 매체에 대 한 복구를 셀 수 있습니다. 그 후, 4 %paraformaldehyde / 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) 20 분의 1 mL에 추가 얼룩이 지기 전에 수정.
   주의: Paraformaldehyde은 매우 독성; 피부, 눈, 또는 점 막과의 접촉을 피하십시오. 측정 하 고 준비 하는 동안 분말을 호흡 하지 마십시오.

8. 스트레스 섬유 해체 기인 NIR Photoactivation의 시각화

1. 고정, 후 알 렉 사 594-phalloidin 사용 (얼룩에 대 한 PBS의 200 µ L를 6.6 µ M 재고 솔루션의 5 µ L를 추가, 실내 온도에 25 분 동안 품 어) 얼룩과 스트레스 섬유를 시각화 합니다. 필터 집합을 사용 하 여 알 렉 사 594-phalloidin (전 581 nm/Em 609 nm)의 이미지를 시각화.
2. 4에서 5 분에 대 한 셀을 품 어 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 실내 온도에. 얼룩, 후 PBS로 샘플을 세척 하 고 스트레스 섬유와 핵의 형광 이미지를 별도로 받아.

결과

갇힌된 효소 UCNP 구조물의 디자인은 그림 1에 나와 있습니다. PKA 효소는 먼저 비활성 갇힌된 PKA를 생성 하기 위해 2-nitrobenzyl 브 로마 이드와 반응 하 고 UCNP의 표면에 정전 움직일 다음 이었다. UCNPs는 upconverted 빛을 방출 하 고 결과적으로 photolytically o nitrobenzyl 그룹 199 Cys Cys 343, 활성화 된 PKA를 생성에 쪼개 다. 가장 이미지와 Bradford 분석 실험 확인 PKA?...

토론

이전에 호프만 및 동료 발견 극적인 형태 변화 무료 PKA¹⁹의 microinjection 후 REF52 세포에서 관찰 되었다. 또 다른 연구에서는 로렌스 그룹 갇힌된 PKA 형태학 변화 및 스트레스 섬유 때 UV photolysis²⁰의 해체를 활성화 vivo에서, 될 수 있는 시연 했다. 이전 이용 upconverted 자외선은 photoactivation 여러 UCNP 지원, 감 금, 작은 분자 bioeffectors^21,

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagent
Tris(hydroxymethyl)aminomethane	Sigma	154563
Magnesium chloride hexahydrate	Sigma	M9272
MOPS	Sigma	M1254
HEPES	Sigma	H4034
Sodium chloride	Sigma	31434
Potassium chloride	Sigma	12636
Yttrium acetate hydrate	Sigma	326046	Y(C2H3CO2)3 · xH2O
Thulium(III) acetate hydrate	Alfa Aesar	14582	Tm(CH3CO2)3 · xH2O
Ytterbium(III) acetate tetrahydrate	Sigma	326011	Yb(C2H3O2)3 · 4H2O
1-Octadecene	Sigma	O806
Oleic acid	Sigma	364525
Methanol	macron	304168
Sodium hydroxide	Sigma	30620
Ammonium fluoride	J.T.Baker	69804
IGEPAL CO-520	Sigma	238643
Cyclohexane	J.T.Baker	920601
Ammonium hydroxide (28% - 30%)	J.T.Baker	972101	Ammonia
Tetraethyl orthosilicate (TEOS)	Sigma	8658
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	D0632
N-hydroxymaleimide (NHM)	Sigma	226351	PKA activity blocking reagent
Prionex protein stabilizer solution from hog collagen	Sigma	81662	Protein stabilizer solution
2-nitrobenzyl bromide (NBB)	Sigma	107794	PKA caging reagent
8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt	Sigma	C3912	8-CPT-cAMP
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle	Sigma	P0294	PK/LDH
Adenosine 5'-triphosphate disodium	Sigma	A2387	ATP
β-NADH reduced from dipotassium	Sigma	N4505
Phosphoenolpyruvate	Sigma	P7127	PEP
Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mL	Thermo Scientific	23200	Bradford assay reagent
cAMP-dependent protein kinase	Promega	V5161	PKA activity control
pET15b-PKACAT plasmid	Addgene	#14921
pKaede-MC1 plasmid	CoralHue	AM-V0012
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4	Thermo Scientific	10010023
DMEM, high glucose, pyruvate	Gibco	12800-017	Cell culture medium
Leibovitz L-15 Medium	Biological Industries	01-115-1A	Cell culture medium
Fetal Bovine Serum	Biological Industries	04-001-1A
Paraformaldehyde	ACROS	416785000
DAPI	Invitrogen	D1306	Nucleus staining dye
Alexa 594-phalloidin	Invitrogen	A12381	F-actin staining dye
5(6)-Carboxytetramethylrhodamine	Novabiochem	8.51030.9999
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit	Thermo Scientific	23200
CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12,000 - 14,000 Da	Membrane Filtration Products, Inc.	1430-33	Dialysis membrane
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized	EMD Milipore	SLHVX13NL
Equipment
Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS	Malvern	M104
Transmission Electron Microscope	JEOL	JEM-1400
Fluorescence Spectrophotometer	Agilent Technologies	10075200	Cary Eclipse
UV-Vis Spectrophotometer	Agilent Technologies	10068900	Cary 50
Fluorescence Microscope	Olympus	IX-71
950 nm longpass filter	Thorlabs	FEL0950
850 nm dichroic mirror shortpass	Chroma	NC265609
RT3 color CCD system	SPOT	RT2520
Fluorescence Illumination	PRIOR	Lumen 200
980 nm Infra-red diode laser	CNI	MDL-N-980-8W
UV LED Spot Light Source	UVATA	UVATA-UPS412	With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2
Thermal pile sensor	OPHIR	12A-V1-ROHS
Picospritzer III	Parker Hannifin	052-0500-900	Intracellular Microinjection Dispense Systems
PC-10 Needle puller	Narishige	PC-10
MANOMETER Digital pressure gauge	Lutron	PM-9100
One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator	Narishige	MMO-220A
Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated	Thermo Scientific	75002421