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要約

このプロトコルではケージ プロテインキナーゼ A (PKA)、細胞信号伝達 bioeffector ナノ粒子表面に固定化した細胞質に microinjected、アップ コンバートされる紫外線近赤外線 (NIR) 照射からによって活性化を誘導します。細胞質の下流圧力繊維崩壊。

要約

アップコン バージョン ナノ粒子 (UCNP)-仲介された光はリモート コントロール bioeffectors はるかに少ない光毒性とより深いティッシュの浸透への新しいアプローチ。ただし、市場で既存のインストルメンテーションは容易にアップコン バージョンのアプリケーションとの互換性ではありません。したがって、市販の計測器を変更することは本研究のために不可欠です。この稿では、まず従来の蛍光の蛍光顕微鏡光子アップコン バージョン実験の互換性のために変更を示します。その後、近赤外線 (NIR) の合成について述べる-トリガー ケージ蛋白質キナーゼの触媒サブユニット (PKA) UCNP 複合体に固定化しました。マイクロインジェクションおよび近赤外光プロシージャのパラメーターも報告されています。ケージの PKA UCNP REF52 線維芽細胞に microinjected が、した後従来の UV 照射によりかなり優秀で、近赤外照射は効率的に細胞 PKA シグナル伝達経路をトリガーします。さらに、正と負の制御実験は、ストレスファイバーの崩壊につながる PKA 誘導経路が特に近赤外照射によってトリガーされることを確認します。したがって、蛋白質変更 UCNP の使用は、リモート光変調細胞実験、紫外線への直接露出を回避する必要がありますを制御する革新的なアプローチを提供します。

概要

センサー (PKA ケージ蛋白質など) をすることができます化学修飾されたタンパク質は細胞の生化学的なプロセス1,2 を非侵襲的操作する化学生物学の新たな分野として開発されています。、3。タンパク質をケージ使用光刺激はこれらの活性化と優れた時空間解像度を提供します。ただし、紫外線は、望ましくない形態学的変化、アポトーシスおよび細胞4,5への DNA 損傷を引き起こす可能性が。それ故に、photocaging グループの設計の最近の動向は、深部組織浸透6,7を増大させるため、同様の光毒性を軽減する長波長または 2 光子励起による電子スピンダイナミクスの有効化に焦点を当てます。私たちは適切な uncaging 神経波長 (すなわちチャンネル) を選択できるようにする選択的に波長が長く対応ケージのグループは bioeffectors 2 つをアクティブにしますより多くのケージ グループは、現在7。これらの便利な機能を与え、細胞活動8を制御するための反応のメカニズムを調査に至る生物学研究光化学的方法論で非常に重要な上流作業は、赤色光 photocaging の新しいグループを開発します。しかし、2 光子ケージ グループは縮合芳香環構造のためあまりにも疎水性通常、可視光ケージ グループは通常有機金属、芳香族配位子を。この疎水性/芳香族プロパティは適していません、bioeffector は蛋白質や酵素、酵素/タンパク質の活性化サイトを変化し、たとえ抱合と光分解はまだ2 の化学のレベルで動作、機能の損失が発生するとき ,9。

UCNPs は、近赤外励起光を UV に変換効果的なトランスデューサーです。UCNPs のこのユニークで魅力的なプロパティは、課題に対応する現実的な解像度 photoactivation に関連付けられているし、小分子、葉酸10シスプラチン誘導体11 の制御放出をトリガーに提供しています。、DNA/siRNA12、共重合体膜小胞13、および中空粒子14。ただし、我々 の知識の限り、酵素やタンパク質の UCNP シスト photoactivation 未テストところ。シリカ コーティングと化学修飾されたケージの酵素複合体から成るタンパク質/酵素コンストラクトの NIR トリガー活性化を実行する求められる私達を使って赤い光や近赤外光活性酵素の成功例がないので希土類をドープした UCNP の15。本研究では、UCNP は、ケージの PKA の形で急速に反応シグナル伝達キナーゼと共役だった。PKA は、グリコーゲン合成と細胞質16環状アデノシン リン酸 (キャンプ) 調節することによる外部からの刺激に応答する細胞骨格の調節をコントロールします。近赤外照射後の細胞実験で時空のマナーで酵素活性化の可能性を検討した.この光の UCNP 支援プラットフォーム NIR を使用して酵素 photoactivate する新しい方法であるし、従来 UV 照射2,4による細胞から不要な信号伝達応答を回避できます。

若し大 bioeffectors に非常に困難だ(例えば、蛋白質) 細胞の活動を制御する細胞膜を挟んだ。粒子を固定化したタンパク質は細胞質にエンドサイトーシスを介して若しやすくもありますが、エンドサイトーシスを破損やエンドソームわなに掛ける事とそれに伴うライソゾームの分解2,4を介して低下可能性があります。ケージのタンパク質が膜後まだ機能している場合でも転量が細胞応答2,17をトリガーするため十分ではないです。対照的に、マイクロインジェクションは細胞の細胞質に大規模な bioeffectors を提供する直接および定量的アプローチです。また、UCNP 固定化 bioeffector は、アクティブにするアップ コンバートされる光を必要とします。したがって、光学機器用はさらに変更を計測、可視化、およびアップコン バージョン光を利用する必要があります。この作品は、近赤外光用マイクロインジェクションと次の必須の分光法と顕微鏡の変更を使用してセルにケージ PKA UCNP 複合体の配信詳細に表示されます。

プロトコル

注: プロトコル記述 photoactivation のアップコン バージョン アシストの詳細な計測修正、合成手順を生成するケージ PKA UCNP、シリカ被覆 UCNP の透過型電子顕微鏡 (TEM)やケージの PKA UCNP サンプル、UV ・近赤外の光分解セットアップ、セル準備、PKA UCNP マイクロインジェクション、photoactivation 研究、REF52 細胞のストレスの繊維染色します

。

1 蛍光アップコン バージョン スペクトル測定装置の

  1. レーザーは、キュベットの中に焦点を当てて、蛍光分光計のキュベット ホルダーの横に 4 X 対物レンズをインストールします。
    2. 。
  2. 対物レンズに対して 90 ° 0.5-8 W 980 nm レーザ ダイオードを配置します
    。 注意: オペレーターは、レーザー安全知識を持ち、近赤外レーザーのゴーグルを着用する必要があります
    3. 。
  3. は、対物レンズとレーザーの光路交差点で完全反射ミラーをインストールします。分光法の励起ウィンドウをブロックし、内部パーツを保護するために黒アルマイト メタル プレートを配置します
    4. 。
  4. キュベット ホルダーにシリカ被覆 UCNP 溶液 (0.2 - 0.6 mg/mL) のキュベットを置いて、明るいアップコン バージョン ビーム可視化することができます、ミラー インストールに対して最高の光の調整に使用することができます
    5. 。
  5. は、分光学を PMT 電圧設定で最低発光モードに切り替える (信号が弱すぎる場合より高い設定を調整)。最高の配置、ここでビームはキュベットの中に、最も強力な信号を拾って、PMT にミラーを調整します
    6. 。
  6. は後、所望の電力設定でアップコン バージョン スペクトルを測定します。熱杭のパワーメータを使用して、レーザ電源の電気の現在の読みに対するレーザー力の検量線を構築します。パフォーマンスが校正の範囲内にあるかどうかを確認するレーザーの性能を常に確認します
    7. 。

2。顕微鏡のセットアップ

注: 次のセットアップは、2 層光パス搭載顕微鏡。ユーザーが近赤外レーザー、ハロゲン ランプは同じポートを共有する背面ポートの励起光源スイッチをインストールしようとすると場合、は、サンプルの発熱を低減するためのものですので、背面のポートにコリメータは大幅 NIR がブロックされます。ユーザーは、難しい選択を行う必要があります: コリメータをおいて、アップコン バージョンの非常に低い効率に苦しむ、コリメータを削除や励起、落射蛍光の光の強度を犠牲します

。

注: 変更された蛍光、アップコン バージョン発光と近赤外光分解モードおよび実験装置と UV 光分解モード、落射蛍光顕微鏡の光路方式を示す断面図の図この実験に使われて 図 2 に示します

。 背面に監督
  1. 装備金属のハロゲン化物ライトと蛍光顕微鏡ガイド ポート
    注: この上位層の光パスの 1 つのキューブの位置は低階層光パスから来る NIR ように空でなければなりませんキューブ砲塔がある
  2. は、オープン側ポートのコリメータで、右側のポートに可変 0.5 から 8.0 W 980 nm のレーザー ダイオードをインストールします
    。 注: これは 10 倍の対物レンズを使用するレーザー光スポット約 500 μ m の直径を拡大します。このコリメータを取り外し、マイクロ メートルの範囲のスポット ライトの結果し、NIR 細胞照射ができなくなります。このコリメータは近赤外透過的です
    3. 。
  3. ダイクロイック ミラー (850 nm ショートパス) と低層の光パスの励起フィルター (950 nm 長いパス) をインストール
  4. では、UCNP ソリューションを使用して、近赤外光スポットを視覚化します。配置を完了するためのビューのフィールドで近赤外光ビームの中央にレーザーの位置を調整します
    5. 。

3。調製とキャラクタリゼーションのケージ PKA UCNP 構築

  1. 加温組換え PKA (9 μ M) ケージング バッファー (20 mM トリス塩酸、10 mM と 100 mM の NaCl、MgCl 2; pH 8.5) 25 で 1-2 時間で 0.5 mM 2-nitrobenzylbromide (NBB) と ° c. 焼入10 mM dthiothreitol (DTT) と過剰な NBB、4-(2-ヒドロキシエチル) dialyze、ピペラジン-1-ethanesulfonic 酸 (HEPES) バッファー (10 mM, pH 7.5) 余分な試薬と塩を削除する
    。 注: ケージの溶液の pH が下がる 8.5 7.5 HEPES pH 7.5 以降の固定化反応のための透析中です
    2. 。
  2. ミックス、ランタノイド塩 Y(CH3CO2) 3 水和物 (99.9%、0.4527 g、1.38 ミリ モル)、Yb (CH 3 CO 2) 3 水和物 (99.9%、0.2533 g、0.60 モル)、および Tm (CH 3 CO 2) 3メタンハイド レート (99.9%、0.02 モル 0.0168 g)-octadecene (30 mL)、オレイン酸 (12 mL)、115 ° C、30 分の混合物を熱し、50 ° C にそれらを冷却次に、NaOH ペレット 0.2 g (5.0 m モル) とメタノール溶液 (20 mL) で反応混合物を溶解し、0.2964 g (8 モル) で 15 分間超音波処理によるフッ化アンモニウムの増加反応温度は 300 ° C まで (β NaYF 4 UCNP コアを取得するには: 1.0 %tm 3 +/30 %yb 3 +) ナノ粒子。
  3. は、シクロヘキサン (10 mL) 中の CO-520 (0.5 mL) のコア粒子 (25 mg) を溶解します。アンモニア (重量 30 %v/v、0.08 mL) とオルトケイ酸エチル (TEOS、0.04 mL) を追加し、シリカ被覆 β NaYF 4 を得るため室温で 12 時間一定の攪拌の適用: 1.0%Tm 3 +/30%Yb 3 + コア粒子
    4. 。
  4. PKA を孵化させなさい (6 nmol) または PKA をケージ (6 nmol) HEPES 緩衝液 (pH 7.5、10 mM) 静電相互作用 経由 での UCNP のシリカ被覆の PKA を固定する 3 h の 4 ° c で UCNP (1 mg) 15 と
    5. 。
  5. は、PVDF フィルター (0.45 μ m)、17,000 x g で 4 ° C で 10 分間遠心を使用して混合物をフィルター処理し、精製の PKA UCNP 複合体を取得する HEPES (pH 7.5、10 mM、50 μ L) 含む 0.1% 蛋白質安定剤でペレットを redisperse します。4 ° C で 10 分間 17,000 × g で遠心し、1.5 mL チューブのブラッドフォードの試金の上澄みを集めします
    6. 。
  6. 分析バック計算 UCNP 粒子の PKA 置換レベルに清のブラッドフォードの試金のステップ 3.5 から保存無制限の PKA の置換レベルが通常ある 〜 粒子の mg 当たり PKA の 4.5 nmol
    。 注: ブラッドフォードの試金を明らかに脱着することがなく高いレベルで安定したタンパク質固定化を示唆しているペレットに強く青い色、PKA UCNP ソリューションは HEPES バッファー (に似た色を表示の上清分画ケージ中 図 4c 4e).

4。特性

注: キナーゼ試金はピルビン酸キナーゼの特定の活動を定量化するために使用します。簡単に言えば、ピルビン酸キナーゼ、乳酸脱水素酵素に結合は、ペプチドのリン酸化は、NADH の酸化の結果します。340 NADH の吸光度の減少を測定することにより後者の形成を監視 nm

。
  1. 60 μ L 総量がアッセイ混合 4 morpholinepropanesulfonic 酸 (モップ、100 ミリメートル、pH 7.5) の PKA と PKA UCNP の活動を決定する KCl (100 mM)、(PEP、1 mM) はホスホエノールピルビン酸、アデノシン三リン酸 (ATP、1 mM)、β-ニコチン酸アミドアデニンジヌクレオチド形態 (NADH, 0.8 mM)、塩化マグネシウム (MgCl 2、1 mM)、kemptide (0.4 mM)、およびピルビン酸キナーゼ/乳酸脱水素酵素混合物 (PK/LDH の 30/40 単位) を削減します
    2. 。
  2. は、アッセイ混合物に PKA ソリューション (2 μ L) の付加の後で時間をかけて NADH の吸光度の減少を測定します。直接測定対象キナーゼの活性を反映するように直線の傾きを計算します
    3. 。
  3. PKA UCNP 15 の活動と PKA 固有のネイティブ アクティビティおよび計算される PKA 表面被覆量の乗算製品にもマッチする必要があります全体の活性を測定します
    4. 。

5。光分解セットアップ

  1. 測定ure 光のすべての電源熱杭センサーを用いた源そして電力密度を計算する (PD = 電力 (W)/(cm 2)) 光スポット エリアに基づいて 18
    2. 。
  2. 365 nm の LED (200 mW/cm 2) 15 の商業システム の in vitro UV 光分解実験を実行します
    3. 。
  3. 顕微鏡ステージ上の UV 光を照らす商業キューブ 15 によってフィルター処理された励起光による PKA UCNP ソリューションです
    。 注意: 電力密度は 〜 15 mW/cm 2、対物レンズ焦点なし
    4. 。
  4. 培養 顕微鏡段階の photoactivation、NIR の照らすダイクロイック ミラー (850 nm 短い-パス)、低階層光パスにインストールされているカスタマイズされたアップコン バージョン フィルター/ミラー設定で 980 nm のレーザーを使用して PKA UCNP ソリューションと励起フィルター (950 nm 長いパス).
    注: 出力電力密度は 4 X 対物レンズ焦点を当て前に 5 W/cm 2 です。電力密度と推定される 〜 68 W/cm 2 X 対物レンズ焦点 4 後
    5. 。

6。細胞試料調製と PKA UCNP 錯体のマイクロインジェクション

  1. PKA 固定 (ステップ 3.5) 後、0.45 μ m のフィルターを通してサンプルをプレフィルターします
    2. 。
  2. インキュベート マイクロインジェクション インキュベーター外で安定した pH 制御期間 L-15 媒体を含む 10% 牛胎児血清 (FBS) にセルです
    。 注: 顕微注入完了を確認する共同注入ネイティブ PKA UCNP、ケージ PKA-UCNP、またはペグインターフェロン UCNP (7.5 mg/mL) 15 5 6-carboxytetramethylrhodamine (耽羅) (10 μ M) のセルに
    3. 。
  3. は PKA UCNP 粒子の濃度を調整して、マイクロインジェクション後、ゾル性細胞質の濃度は 1-3 μ M PKA - 注入量は細胞容積の 1/10 であるという前提で、セルの PKA の生理的濃度範囲.
  4. 実行 (ステップ 6.2) 細胞へのマイクロインジェクション一次元油圧マイクロマニピュレーター ( 図 3) と相まってマイクロインジェクター デバイスを使用します
    5. 。
  5. ガラスシリンジによって適用される圧力を監視するデジタル圧力計が動作範囲内での使用 (50 〜 200 hPa) マイクロインジェクションの補正圧力を提供するためにカスタマイズされた加圧チャンバーにディスペンサー バルブのシール。引き手を使用して針を引いています
    6. 。
  6. 50 と 75 hPa、200-300 ms と毛管作用によって針に培養液の逆流を防ぐために 15 hpa 補正圧力の噴射時間の間注入圧力を維持します
    7. 。
  7. 外径 1.3 と 1.5 μ m、40 倍の対物レンズを用いて撮影によって確認することができます間があるように針の先端の開口部を確認します
    8. 。
  8. 10% を含む L-15 培地 2 mL でセルを洗浄して、インジェクション後 FBS。5 (6) - carboxytetramethyl - ローダミン (タムラ) マイクロインジェクション完了の確認をから細胞の蛍光イメージングを観察
    9. 。

7。Photoactivation のケージ PKA UCNP を使用して紫外線や生体細胞の近赤外光

PKA UCNP マイクロインジェクション後
  1. UV の photoactivation 3.5 μ m の皿 REF52 細胞を成長、顕微鏡ステージ上に配置、によってフィルター UV 光照射条件対物レンズの焦点なし 3 分キューブ
    。 注: セルが 10% を含む DMEM で維持された REF52 37 ° c 5% CO 2 インキュベーターとセルで FBS が継、confluency に 90% に達すると 2-3 日毎
    2. 。
  2. PKA UCNP インジェクション後の近赤外光低層フィルター/ミラーの設定から 980 nm レーザーで細胞を照らすは、ステップ 5.4 で説明したようします
    。 注: 出力密度 10 × 対物レンズ焦点を当て前に 5 W/cm 2 は、対物レンズの中心 x 10 後 300 W/cm 2 と推定されています。アップコン バージョンは、大きな anti-Stoke シフトが必要な場合に特に高光子密度を必要とするプロセスです。Photoactivation の間に中心の必要したがって、.
  3. 大きいスポット ライト (650 μ x 520 μ m) が必要な場合は、NIR 毎 5 分照射後 5 分暗い間隔 15 分許可コリメータと 10 倍の対物レンズで焦点を当てて加熱を避けるために、これらの細胞を照射します
    。 注: 高の分解能 (細胞内光スポット) が必要な場合使用 40 X 対物レンズとピンホールを導べ光の出口の端に取り付けられている細胞次元光スポット (5 μ x 4 μ m) を生成します。この場合は 1 照射の s は、光子の高フラックスによる近赤外光のために十分
    4. 。
  4. 後紫外線や近赤外の光分解は、細胞応答を生成するための完全な媒体で 1 h の 37 ° C で 5% CO 2 インキュベーターで回復する細胞を許可します。その後、さらに染色する前に 4% パラホルムアルデヒド/リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 20 分の 1 mL でそれらを修正します
    。 注意: パラホルムアルデヒドは猛毒です。皮膚、目、粘膜との接触を避けます。測定と準備の中に粉を吸い込まないようにします
    5. 。

8。近赤外光活性化によって引き起こされるストレス繊維崩壊の可視化

  1. 固定後、使用 Alexa 594 ファロイジン (6.6 μ M 原液の 5 μ L 200 μ L の PBS を加える染色; 室温で 25 分間インキュベート) 染色して繊維の応力を視覚化します。フィルタ セットを使用 Alexa 594 ファロイジン (Ex 581 nm/Em 609 nm) のイメージを視覚化します
    2. 。
  2. インキュベート 4 で 5 分間細胞 '、6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) 室温で。染色後サンプルは PBS を洗浄し、ストレスファイバーと核の蛍光画像を別々 に取ます
    3. 。

結果

ケージ酵素 UCNP の構造の設計は、図 1に示すです。PKA 酵素は、まず、使用頻度の低いケージの PKA を生成する 2-ニトロベンジル ブロマイドと反応したし、UCNP の表面に静電固定だったし。UCNPs は、アップ コンバートの発光し、その結果 photolytically o-ニトロベンジル基 Cys 199 と生成活性化 PKA システイン 343 を切断します。TEM 像とブラッドフォー?...

ディスカッション

以前は、ホフマンと同僚が見つかりました無料 PKA19のマイクロインジェクション後 REF52 細胞における劇的な形態学的変化を認めたこと。別の研究では、ローレンス グループは、ケージ PKA 活性化使用される体内形態学的変化とストレスファイバー UV 光分解20に服従させたときの崩壊につながるを示した。以前のいくつかの UCNP シスト、ケージ、小さ...

開示事項

著者は、彼らは競合する金銭的な利益があることを宣言します。

謝辞

資金調達 (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2) ありがとうナノ科学と技術学院プログラムと科学省台湾の技術。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Reagent
Tris(hydroxymethyl)aminomethaneSigma154563
Magnesium chloride hexahydrateSigmaM9272
MOPSSigmaM1254
HEPESSigmaH4034
Sodium chloride Sigma31434
Potassium chlorideSigma12636
Yttrium acetate hydrateSigma326046Y(C2H3CO2)3 · xH2O
Thulium(III) acetate hydrateAlfa Aesar14582Tm(CH3CO2)3 · xH2O
Ytterbium(III) acetate tetrahydrateSigma326011Yb(C2H3O2)3 · 4H2O
1-OctadeceneSigmaO806
Oleic acidSigma364525
Methanol macron304168
Sodium hydroxideSigma30620
Ammonium fluorideJ.T.Baker69804
IGEPAL CO-520Sigma238643
CyclohexaneJ.T.Baker920601
Ammonium hydroxide (28% - 30%)J.T.Baker972101Ammonia
Tetraethyl orthosilicate (TEOS)Sigma8658
DL-Dithiothreitol (DTT)SigmaD0632
N-hydroxymaleimide (NHM)Sigma226351PKA activity blocking reagent
Prionex protein stabilizer solution from hog collagenSigma81662Protein stabilizer solution
2-nitrobenzyl bromide (NBB)Sigma107794PKA caging reagent
8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium saltSigmaC39128-CPT-cAMP
Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscleSigmaP0294PK/LDH
Adenosine 5'-triphosphate disodiumSigmaA2387ATP
β-NADH reduced from dipotassiumSigmaN4505
PhosphoenolpyruvateSigmaP7127PEP
Coomassie Protein Assay Reagent, 950 mLThermo Scientific23200Bradford assay reagent
cAMP-dependent protein kinasePromegaV5161PKA activity control
pET15b-PKACAT plasmidAddgene#14921
pKaede-MC1 plasmidCoralHueAM-V0012
Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4Thermo Scientific10010023
DMEM, high glucose, pyruvateGibco12800-017Cell culture medium
Leibovitz L-15 MediumBiological Industries01-115-1ACell culture medium
Fetal Bovine SerumBiological Industries04-001-1A
ParaformaldehydeACROS416785000
DAPIInvitrogenD1306Nucleus staining dye
Alexa 594-phalloidinInvitrogenA12381F-actin staining dye
5(6)-Carboxytetramethylrhodamine Novabiochem8.51030.9999
Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay KitThermo Scientific23200
CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12,000 - 14,000 DaMembrane Filtration Products, Inc.1430-33Dialysis membrane
Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilizedEMD MiliporeSLHVX13NL
Equipment
Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZSMalvernM104
Transmission Electron MicroscopeJEOLJEM-1400
Fluorescence SpectrophotometerAgilent Technologies10075200Cary Eclipse 
UV-Vis SpectrophotometerAgilent Technologies10068900Cary 50 
Fluorescence MicroscopeOlympusIX-71
950 nm longpass filter ThorlabsFEL0950
850 nm dichroic mirror shortpassChromaNC265609
RT3 color CCD systemSPOTRT2520
Fluorescence IlluminationPRIORLumen 200
980 nm Infra-red diode laserCNIMDL-N-980-8W
UV LED Spot Light SourceUVATAUVATA-UPS412With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2
Thermal pile sensorOPHIR12A-V1-ROHS
Picospritzer IIIParker Hannifin052-0500-900Intracellular Microinjection Dispense Systems
PC-10 Needle pullerNarishigePC-10
MANOMETER Digital pressure gaugeLutronPM-9100
One-axis Oil Hydraulic MicromanipulatorNarishigeMMO-220A
Heraeus Fresco 17 Centrifuge, RefrigeratedThermo Scientific75002421

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