JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מיליוני אנשים סובלים ממחלות ניוונית של הרשתית הגורמות עיוורון בלתי הפיך. מרכיב נפוץ של רבים ממחלות אלה הוא אובדן תאי הגנגליון ברשתית (RGCs). פרוטוקול מפורט זה מתאר את הבידוד של RGCs Murine העיקרי על ידי בחירה חיובית ושלילית עם cytometry הזרימה.

Abstract

מחלות ניווניות לעיתים קרובות יש השפעה הרסניות על אלה שנפגעו. תא גנגליון התא (RGC) הפסד הוא מעורב במערך של מחלות, כולל רטינופתיה סוכרת וגלאוקומה, בנוסף להזדקנות נורמלית. למרות החשיבות שלהם, RGCs כבר מאוד קשה ללמוד עד עכשיו בין השאר בשל העובדה שהם מהווים רק אחוז קטן של מגוון רחב של תאים ברשתית. בנוסף, שיטות בידוד הנוכחי להשתמש סמנים תאיים כדי לזהות RGCs, אשר מייצרים תאים שאינם קיימא. טכניקות אלה כוללות גם פרוטוקולי בידוד ארוכים, ולכן יש חוסר שיטות מעשיות, סטנדרטי, אמין כדי להשיג ולבודד RGCs. עבודה זו מתארת ​​שיטה יעילה, מקיפה ואמינה לבידוד RGCs ראשוניים מעכברים retinae באמצעות פרוטוקול המבוסס על קריטריונים לבחירה חיובית ושלילית. השיטות המוצגות מאפשרות את המחקר העתידי של RGCs, במטרה להבין טוב יותר את העיקרוןירידה בחדות הראייה הנובעת מאובדן RGCs תפקודית במחלות ניווניות.

Introduction

RGCs הם נוירונים מובחנים סופנית, ולכן, תאים ראשוניים נדרשים לצורך ניסויים. הפיתוח של פרוטוקול לבידוד והעשרה של תאים ראשוניים של תאית גנגליון Murine (RGCs) הוא היסוד לחשוף את המנגנונים של בריאות RGC וניוון במבחנה . זה חשוב במיוחד עבור מחקרים המבקשים ליצור טיפולים פוטנציאליים כדי לקדם את הפונקציה RGC כדי למזער את מותם. התנוונות של RGCs קשורה למחלות ניווניות של הרשתית, כגון גלאוקומה, רטינופתיה סוכרתית והזדקנות נורמלית. למרות שהמנגנונים הסלולריים הספציפיים שבבסיס אובדן RGC אינם ברורים, זוהתה סדרה של גורמי סיכון. חוסר חמצון בראש עצב הראייה 1 , 2 , 3 גורם מוות RGC 4 ופועל כהפרעה של הומאוסטזיס בין ההפעלה של exitatory ואניקולטנים nititory בתוך RGCs בודדים 5 , 6 . שורה של אתגרים מעכבים את ההתקדמות לקראת השימוש בתאים אלה ללימודים מעמיקים. ראשית, מספר RGCs הנוכחי ברשתית Murine הוא קטן. RGCs חשבון עבור פחות מ 1% מכלל תאים הרשתית 7 , 8 , 9 . שנית, רוב RGC ספציפיים סמנים הם תאיים חלבונים 10 , 11 , 12 . הבחירה מבוססת על סמנים אלה משאיר את התאים שאינם קיימא, אשר מונע ניתוח במורד הזרם. לבסוף, הפרוטוקולים הקיימים כיום הם ארוכים וחסרים סטנדרטיזציה 13 , 14 . מוקדם פרוטוקולים בידוד RGC התבססו על שיטות immunopanning. Barres et al. 15 התאימו את החסימה הקלאסיתטכניקה anning והוסיף צעד שני, אשר כלל מונוציטים ותאי האנדותל מהחלק הארי של תאים רשתית לפני הבחירה החיובית המבוססת על אימונוספיטיביות לאנטיגן אנטי תימוציטים (aka Thy1), סמן משטח התא. שנים לאחר מכן, הונג et al. בשילוב טכניקות בידוד מגנטי חרוז עם אסטרטגיות מיון תאים לבודד RGCs עם טוהר 16 . השימוש חרוזים מגנטיים עדיין בשימוש ביישומים מדעיים רבים. יחד, חרוזים מגנטיים ו cytometry זרימת פרוטוקולים שיפרה את הטוהר של תאים בודדים. עם זאת, מערכות טיהור אלה עדיין לא תוקנו לבידוד של RGCs Murine מ Retinae מנותק.

זרימת cytometry היא שיטה אנליטית חזקה המודד את המאפיינים אופטיים פלואורסצנטי של השעיות התא. תאים ניתוחים הן כמותית והן איכותית עם רמה גבוהה של רגישות, מתן ניתוח רב מימדי של התא populAtion. האפליה הסלולארית מתבססת על שני מאפיינים פיזיים עיקריים: גודל התא או שטח הפנים והפרשנות או המורכבות הפנימית 17 . ניתוח רב מימדי ניתן לבצע על ידי שילוב של נוגדנים מתוייגים עם fluorochromes כי יש אורכי גל דומים ו פליטות שונות. זרימת cytometry הוא מהיר, לשחזור, ורגיש. לייזרים multitpe היתר אפילו רב יותר מימדי מנתח של תאים בודדים על ידי cytometry הזרימה. לפיכך, זוהי מתודולוגיה אטרקטיבית לחקר דגימות ציטולוגיות. פלואורסצנטי מופעלת תא מיון (FACS) משתמשת הבדלים פנוטיפי רב מימדי מזוהים על ידי cytometry הזרימה למיין תאים בודדים לתוך subpopulations נפרד.

בעשור האחרון, משטח מרובה חלבונים תאיים זוהו כסמנים ביולוגיים פוטנציאליים עבור הבחירה של תאים, כולל נוירונים. מחקרים ראשוניים שביקשו לבודד RGCs של חולדות השתמשו Thy1 כמו cel גנגליוןסמן. למרבה הצער, Thy1, aka CD90, יש מספר איסופורמים במינים אחרים מכרסם 18 , 19 , 20 והוא בא לידי ביטוי על ידי מספר סוגי תאים ברשתית 19 , 20 , מה שהופך אותו סמן שאינו ספציפי עבור RGCs. סמן נוסף, CD48, נמצא על אוכלוסיות מונוציטיות ברשתית, כולל מקרופאגים ומיקרוגליאה. באמצעות שני אלה סמנים פני השטח, שונה RGC חתימה- Thy1 + ו CD48 Neg תאים - פותחה 15 , 16 , 21 , 22 . למרבה הצער, אלה שני קריטריונים לבחירה אינם מספיקים כדי לבחור עבור האוכלוסייה RGC מועשר מאוד. כדי לענות על צורך זה unmet, פרוטוקול cytometry זרימה פותחה 23 מבוסס על רב שכבתית בחירה חיובית ושלילית קריטריונים usiNg ידוע סמנים משטח התא כדי להעשיר ולטהר RGCs Murine העיקרי.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל הפרוצדורות המפורטות בפרוטוקול הבא אושרו על ידי המועצה לטיפול בבעלי חיים מוסדיים ושימוש ועדת (IACUC) סקירה מועצת המנהלים של אוניברסיטת טנסי למדעי הבריאות מרכז (UTHSC) ו בעקבות האגודה לחקר חזון ורפואת עיניים (ARVO) הצהרות לשימוש של בעלי חיים בחקר עיניים וחזון, בנוסף להנחיות ניסויים בבעלי חיים במעבדה (המכון למעבדות בעלי חיים, מדיניות שירותי בריאות הציבור בנושא טיפול הומאני ושימוש בחיות מעבדה).

1. הכנת מכשירים, פתרונות ומדיה

הערה: כל המידע על חומרים, ריאגנטים, כלים, מכשירים המדווחים בפרוטוקול המפורטים בטבלה של חומרים .

  1. החיטוי כל כלי לנתיחה ולאחסן אותם באזור סטרילי. השתמש בכלים הבאים: 4 מלקחיים סטנדרטיים (2 אורך ו 2 קצר) ו 2 מספריים,כמו גם 2 מלקחיים (1 ארוך 1 קצר) 1 מספריים לנתיחה; לשמור קבוצה נוספת כגיבוי.
  2. הכן 100 מ"ל של תמיסת PBS סטרילית / 1% FBS להשתמש במהלך שוטף, נהלים immunolabeling, ואת התא מיון השלבים. שמור על פתרון צונן על 4 מעלות צלזיוס.
    הערה: אל תוסיף Azide נתרן (NaN 3 ) לפתרון, כפי שהוא יכול להיות רעיל לתאים חיים.
    1. הכן 100 מ"ל של PBS / 1% FBS עם 99 מ"ל של PBS ו 1 מ"ל של FBS.
  3. הכן 100 מ"ל של המדיום העצבתי סטרילי סטרילי בתוספת 3% FBS (ראה טבלה של חומרים ) לשימוש כאוסף אוסף תרבות. שמור על התרבות התא סטרילי בינוני ב 4 מעלות צלזיוס. רק לחמם אותו לטמפרטורת החדר (RT) לפני השימוש.
    1. הכן 100 מ"ל של המדיום תא עצביים בתוספת 3% FBS באמצעות 97 מ"ל של המדיום התא עצביים 3 מ"ל של FBS.
  4. טרום צינון צינורות אוסף (15-צינורות מ"ל) מראש מצופה 5 מ"ל של המדיום אוסף ידי הנחת tשולי בדלי קרח. השתמש רק צינורות פוליפרופילן כדי למנוע את התאים מן היצמדות אל פני השטח של הצינור.
  5. מקום 40 מ"מ מנות, 70-מיקרומטר ניילון strainers, מזרקים, העלי עבור מסננת התא, צינורות פוליפרופילן סטרילית בארון biosafety. לעקר את כל הפריטים לפני ההליכים ולשמור אותם בצורה סטרילית לאורך כל ההליכים.
    הערה: כל השלבים לאחר איסוף של הרשתית תתבצע בארון biosafety.

2. Anucleation

הערה: סך של 10 צעירים (5-7 שבועות) C57BL / 6J עכברים שימשו בניסוי זה כדי לבודד 1.0 x 10 6 RGCs עם CD90.2 CD +

  1. להרדים את העכברים באמצעות שאיפה CO 2 ואחריו נקע צוואר הרחם. תמיד להשתמש בשיטת המתת חסד משנית כדי להבטיח כי החיה מורדמים הוא מת.
    הערה: Isofluorane יכול לשמש כחלופה CO 2 . קטמין אינו מומלץ, כפי שהוא מזוהה עם עלייה בלחץ תוך עיני (IOP) כאשר נעשה שימוש inducer של הרדמה 24 , 25 .
  2. הכנס מלקחיים מתחת לגלובוס של העין, לאחוז בעצב אופטי, למשוך למעלה; הגלובוס יהיה enucleated, עם העצב אופטי שלם. מקום שנאספו העיניים בקבוקון המכיל PBS ולשמור את הבקבוקון על הקרח עד השלב הבא.
    הערה: כל אדם יכול לבצע את שלב זה לאחר קבלת הכשרה מתאימה מן המעבדה טיפול בבעלי חיים (LACU).

3. הכנה של השערת תא הרשתית

  1. מניחים את העין שנאספו על צלחת הבסיס של מיקרוסקופ לנתיחה להתחיל לנתיחה הקרנית. לנתח כל עין בנפרד.
  2. בזהירות להחזיק את הגלובוס על בסיס עצב הראייה באמצעות מלקחיים. עבור שלב זה, השתמש אחד lonG, ו מלקחיים סטנדרטי קצר אחד.
  3. השתמש 30-מד (30G) מחט חדה לנקב את הקרנית כדי לאפשר הומור מימית לפנות מן העין, מה שהופך אותו קל יותר להחזיק את העין עם מלקחיים.
  4. החזק את הקרנית עם מלקחיים להשתמש במספריים לעשות חתך קטן הקרנית. בעדינות לקלף את הקרנית ואת sclera באמצעות מלקחיים. כאשר העולם הוא קילוף באמצע הדרך, לגלגל את הרשתית ואת העדשה החוצה באמצעות מלקחיים. מחק את הקרנית, סקלרה, ואת העדשה.
    הערה: שיטה זו מבטיחה הרשתית לחלוטין מנותקת משאר העין.
  5. מניחים את הרשתית בתוך צלחת פטרי 40 מ"מ קטן המכיל PBS / 1% FBS.
    הערה: כחלופה לצלחת פטרי, צלחת תרבות התא יכול לשמש. הקפד תמיד לשמור על הרשתית לח, כמו בתנאים פיזיולוגיים.
    1. לשטוף כל הרשתית שלוש פעמים עם טרי סטרילי PBS / 1% FBS בתוך ארון biosafety.
  6. מקום עד 12 retinae בסטרילית 70-מיקרומטר ניילון מסננת לחה עם PBS / 1% FBS. באמצעות back-end של מזרק 10 מ"ל, בעדינות לקרוע את הרשתית באמצעות תנועה מעגלית לנתק את התאים.
    1. לחלופין, השתמש העלי עבור מסננת מסירציה או להשתמש בעיכול אנזימטי עם שילוב של 15 IU / מ"ל ​​papain, 5 מ"מ L- ציסטאין, ו 200 U / מ"ל ​​DNase אני במשך 15 דקות ב 37 ° C, ואחריו אי פעילות עם PBS / 10% FBS.
      הערה: לא נצפו שינויים באחוז התאים שנמצאו, כאשר העיכול האנזימטי הושווה למציצה עם הקצה האחורי של המזרק או העלי.
  7. כדי להעביר את התאים מבודדים, במקום סטרילית 70-מיקרומטר מסננת ניילון מעל צינור איסוף פוליפרופילן. להעביר את התאים שנאספו באמצעות מסננת באמצעות פיפטה P1000. שוטפים את מסננת ( שלב 3.6 ) עם PBS / 1% FBS לשחרר את כל התאים הנותרים ולהעביר אותם אל צינור איסוף.
  8. הוסף PBS / 1% FBS כדי achIeve נפח סופי של 1 מ"ל לכל הרשתית. צנטריפוגה ההשעיה התא 7 דקות ב 200 xg ו RT.
    הערה: בהתאם למספר reterne retroe (<6 retinae), גלולה התא עשוי להיות קטן מדי כדי להיות גלוי.
    1. מחק supernatant התא resuspend תא גלולה ב PBS / 1% FBS באמצעות יחס של 1 מ"ל לכל 5 retinae.
  9. ספירת התאים באמצעות hemocytometer.
    1. נקי hemocytometer זכוכית coverslip עם אלכוהול 70%. מערבולת בעדינות את הצינור המכיל את התאים כדי להבטיח כי ההשעיה תא הרשתית מופץ באופן שווה. מקום 20 μL של 0.4% trypan כחול בצינור microcentrifuge ומערבבים עם 20 μL ההשעיה התא.
    2. מערבבים בעדינות וליישם 10 μL של 0.4% trypan כחול / תערובת ההשעיה התא כדי hemocytometer, מילוי שני החדרים; פעולה נימית ימשוך 0.4% trypan כחול / תערובת ההשעיה תא תחת coverslip. באמצעות מיקרוסקופ, לספור את כל התאים trypan כחול שלילי; ThiS מייצג את התאים החיים.
    3. קביעת כדאיות התא באמצעות הנוסחה הבאה: ספירת תאים חיים / ספירת תאים סה"כ =% כדאיות.
      הערה: אם הכדאיות של התאים הוא פחות מ 95%, השימוש בצבע פלואורסצנטי עבור אפל הכדאיות התא נדרש במהלך FACS.
  10. השתמש צבע חיוניות פלואורסצנטי כי הוא לא חדיר לתאים חיים. שטפו את התאים עם PBS כדי להסיר כל עקבות של נסיוב. הוסף 1 μL של צבע פלואורסצנטי עבור אפליית התא הכדאיות לכל 5.0 x 10 6 תאים בנפח סופי 100 μL. דגירה ב RT במשך 15 דקות, מוגן מפני האור. הוסף 10x את עוצמת הקול של PBS / 1% FBS. צנטריפוגה 5 דקות ב 200 xg ו RT.
  11. דגירה ההשעיה תא לילה ב 4 ° C, במידת הצורך. אם זה נעשה, למלא את הצינור ההשעיה תא עם בינוני תאים עצביים ולא PBS / 1% FBS. מניחים את הצינור אופקית ולשמור אותו 4 מעלות צלזיוס.

4. Immunolabeling Reתאים

  1. השתמש בהמרה הבאה כדי לקבוע את עוצמת הקול של נוגדנים לכל מספר תאים: 2 μL של נוגדנים לכל 5.0 x 10 6 תאים בנפח 100 μL.
  2. לשטוף את התאים ולשמור אותם PBS / 1% FBS. קח aliquot קטן של תאים (5.0 x 10 6 תאים) להשתמש כביקורת שלילית (ללא תווית) בזמן ההתקנה של המיון.
    הערה: שליטה שלילית זו היא קריטית לכיול הנכון של סדרן התא.
  3. כדי למזער את מחייב הלא ספציפי של נוגדנים לתאים המבטאים את הקולטנים Fcγ II ו- III, להוסיף 1 μL של נוגדן CD16 / 32 נגד העכבר לכל 1.0 x 10 6 תאים בנפח סופי 50 μL באמצעות PBS / 1% FBS. דגירה של 10 דקות ב RT.
  4. מוסיפים את הקוקטייל נוגדן למדגם ומערבבים בעדינות על ידי pipetting. דגירה במשך 30 דקות בתוך דלי קרח. ודא כי דלי הקרח מכוסה, כמו האור יכול לסכן את הניסוי בשל photobleaching של פלואור מתויגPhores.
    1. הכן את קוקטייל נוגדנים באמצעות fluorescently מתוייגים נוגדי עכברים מתויגים: CD90.2 AF-700, CD48 PE-Cyanine7, CD15 PE, ו- CD57 מתויג.
      הערה: עבור כל נוגדנים, השתמש בריכוז הבא לכל 5.0 x 10 6 תאים: CD90.2 AF700, 1 מיקרוגרם; CD48 PE-Cyanine7, 0.4 מיקרוגרם; CD15 PE, 0.02 מיקרוגרם; ו-מתויג CD57, 0.4 מיקרוגרם.
      1. השתמש כרכים לפי החישובים הבאים (על בסיס נוגדנים זמינים מסחרית המפורטים בטבלה של חומרים ): סך של 5.0 x 10 7 תאים להיות מתויג; 2 μL לכל 5.0 x 10 6 תאים = 20 μL של נוגדן כל; 4 נוגדנים שונים = 80 μL של קוקטייל נוגדן; נפח סופי = [(5.0 x 10 7 תאים סה"כ) /5.0 x 10 6 תאים] x 100 = 1000 μL; 80 μL Abs + 50 μL של CD נגד העכבר CD16 / 32 + 870 μL PBS / 1% FBS = 1000 μL.
        הערה: שילוב זה סיפק אתשילוב אופטימלי של fluorochromes עבור תצורת המכשיר. הפרמטרים הבאים מסכמים את הפליטה ואת עירור: AF-700, פליטה של ​​719 ננומטר כאשר מתרגש עם לייזר דיודה אדום 638 ננומטר; PE-Cyanine7, פליטה של ​​767 ננומטר כאשר מתרגש עם 488 ננומטר לייזר כחול דיודה; ו PE, פליטה של ​​575 ננומטר כאשר מתרגש עם לייזר 488 ננומטר כחול דיודה.
  5. לאחר הדגירה 30 דקות, להביא נפח של עד 5 מ"ל באמצעות PBS / 1% FBS. שטפו את הדגימות על ידי centrifuging אותם במשך 7 דקות ב 200 xg ו RT. חזור על הנוהל פעם אחת כדי להסיר את כל הנוגדן unbound.
  6. הוסף 2 μL של נוגדן משני (0.1 מיקרוגרם), אשר יחייב את CD57 של 5.0 x 10 6 תאים. דגירה במשך 30 דקות בתוך דלי קרח, כמו בשלב 4.4 . שטפו את התאים פעמיים, כמו בשלב 4.5 .
    1. תווית התאים עם נוגדנים משני אם נוגדנים ראשוני לא מתויג שימש בשלב 4.4 .
      הערה: השנינוגדן של בחירה עבור תצורה זו מופיע בטבלה של חומרים ; יש לו אורך גל פליטה של ​​421 ננומטר. השתמש בו עם מסנן bandpass של ננומטר 450/50 כאשר מתרגש עם לייזר דיודה סגול ב 405 ננומטר.
    2. השתמש כרכים לפי החישובים הבאים (על בסיס נוגדן זמין מסחרית המפורטים בטבלה של חומרים ): 2 μL לכל 5.0 x 10 6 תאים = 20 μL של נוגדנים משני; נפח סופי = [(5.0 x 10 7 תאים סה"כ) /5.0 x 10 6 תאים] x 50 = 500 μL; 20 μL של ABS + 480 μL PBS / 1% FBS = 500 μL.
  7. שמור את התאים שכותרתו PBS / 1% FBS. ספירת התאים באמצעות hemocytometer; להשתמש ריכוז התא הרשתית הסופי של 3.0 - 4.0 x 10 7 תאים / מ"ל.
    הערה: אין להשתמש במדיום תרבית בינוני לדלל את התאים כי אדום פנול יכול להגדיל את autofluorescence, ובכך להפחית את הרזולוציה בין negatIve ותאים חיוביים. ריכוז התא הסופי לכל נפח מאוד תלוי בקצב הזרימה של קצב תצורת המכשיר.
  8. השתמש בבקרות צבע יחיד במהלך ההתקנה כדי למזער את הזרימה הקרינה.
    הערה: צעד זה, הידוע גם בשם פיצוי, מוחל על תיקון הרעש שנוצר על ידי שילוב של fluorophores. פוליסטירן microspheres ב PBS / 0.1% BSA / 2 מ"מ NaN 3 עם היכולת לאגד אימונוגלובולינים מתויגים fluorescently (Ig) isotypes ממספר מינים לספק שולטת חיובית לקבוע את הפיצוי.
    1. מקום 3 טיפות של microspheres פוליסטירן צינורות FACS סטרילי, להקצות אחד לכל fluorophore. הוסף 1 מיקרוגרם של fluorophore בהתאמה לכל צינור. דגירה במשך 15 דקות ב RT, מוגן מפני האור. הוסף 3 מ"ל של PBS / 1% FBS על צינורות מדגם. צנטריפוגה 5 דקות ב 200 xg ו RT. בזהירות להסיר את supernatant ו resuspend μL 250 של PBS / 1% FBS.
    2. כדי להגדיר את contr השליליOls, להשתמש פוליסטירן microspheres כי לא להיקשר Ig. בצע את הצעד הזה יום קודם לכן, במידת הצורך.

5. תא מיון אסטרטגיה

הערה: הוראות ספציפיות להגדרת מכשיר עבור FACS עם 355 ננומטר, UV; 405 ננומטר, סגול; 488 ננומטר, כחול; ו 640 ננומטר, לייזרים אדומים עם 2, 2, 5, ו 3 הפצה ערוץ הקרינה, בהתאמה. תוכנת ההפעלה הייתה DIVA גרסה 8.0.1. מיון תאים בוצע עם זרבובית 70 מיקרומטר, 70 psi הלחץ נדן, 87.5 תדר, 48.6 משרעת עם הפסקה הראשונה ירידה ב 333, אבחנה ההפרש של 6, דיוק מיון להגדיר טוהר ארבע דרך עם ברירת מחדל (32) מסכת טוהר, ושחרור עיכוב מותאם ל 42.98 באמצעות חרוזים.

  1. השתמש 15 מ"ל צינורות פוליפרופילן חרוטי כמו כלי איסוף. הוסף 5 מ"ל של המדיום אוסף (בינוני תרבות התא) לכל צינור ולסובב את הצינור כדי לקשט את הקירות.
    הערה: צעד זה מונע את התאים דבק לצדדים של tהוא צינור. כחלופה, צינור יכול להיות מצופה FBS מזוקק.
  2. קח בחשבון את היעילות של סדרן התא להעריך את התשואה הסופית של תאים.
    הערה: היעילות של המיון משתנה על בסיס cytometer זרימת בשימוש. RGCs עם CD90.2 + CD48 Neg CD15 Neg CD57 שלבים פנוטיפ מהווים כ 1% מכלל התאים ברשתית.
  3. יש את מיון התא מבוצע על ידי מפעיל מאומן (בדרך כלל במתקן הליבה). ודא כי המכשיר הוא ניקה ו מעוקרים עם אתנול 70% לפני רכישת מדגם. בזהירות לנגב את החיצוני של צינורות איסוף עם אתנול 70% גם כן.
  4. אם התאים התיישבו או מצטברים, פיפטה התאים למעלה ולמטה ולסנן את ההשעיה באמצעות מסננת סטרילית 40 מיקרומטר סטרילי לפני הרכישה. הקפד לשלוט על הטמפרטורה ולשמור אותו על 4 מעלות צלזיוס בזמן מיון התא מתבצעת; כשל לעשות זאת תפחית את celאני מניב.
  5. לדון את הפרטים של המיון עם מפעיל סדרן התא לפני ביצוע הניסויים.
    הערה: בזמן הניסוי, מפעיל סדרן התא ילחץ על שורה של לחצנים מסרגל הכלים של סביבת העבודה של תוכנת הרכישה עבור הציטומטר. אלה הם דפדפן , Cytometer , מפקח , גליון עבודה , רכישת לוח המחוונים . האסטרטגיה של מיון תאים בשימוש כאן ידוע בתור מיון דו סטרי. שתי אוכלוסיות נאספות: RGCs מועשר וכל סוגי תאים אחרים. אם יש לאסוף אוכלוסיות נוספות, ניתן לבודד עד שתי אוכלוסיות נוספות כאחת. אם אוכלוסיות נוספות ייאספו, סדרן התא דורש אוסף צינורות שונים ההתקנה.
  6. לבצע פיצוי לתקן חפיפה רפאים מן fluorophores.
    הערה: ניתן לבצע תהליך זה באופן ידני באמצעות כוונוןIng כל הגדרה, או שזה יכול להיעשות באופן אוטומטי כחלק התוכנה בשימוש. רוב התוכנה עבור התא מיון ציוד יש אפשרות של פיצוי אוטומטי. זה נחשב תקן הזהב ואת סוג המדויק ביותר של פיצוי. מדגם שלילי (ללא fluorophore) ואת הפקדים יחיד מוכן עם polysterene microspheres (פיצוי חרוזים) המיוצרים במיוחד כדי לכבול את כל נוגדנים חד שבטיים הרלוונטיים המשמשים את הניסוי ישמש בשלב זה.
    1. בחר ניסוי> הגדרת פיצויים> יצירת בקרי פיצויים . הוסף את הפקדים הספציפיים ל- fluorophore מהרשימה המוצגת במסך. לחץ על אישור .
      הערה: צינור פיצוי לכל אחד מהבקרות יוצג.
      1. השתמש בפקד ללא תווית (ללא fluorophore, שלב 4.2 ) כדי לאמת את האור מפוזר קדימה (FSC), את האור מפוזרים בצד (SSC), ואת השער האוכלוסייה הראשונית (P1).
    2. התקן את הצינור שליטה שלילית על cytometer ולחץ על טען. ודא שאוכלוסיית העניין מוצגת ולבחור אותה. זוהי אוכלוסייה 1 (P1). לחץ לחיצה ימנית על שער P1 ובחר Apply אל All Compensation Controls . לחץ על נתוני שיא . לאחר ההקלטה, לחץ על בטל והסר את הצינור.
    3. התקן את הצינור הבא על הציטומטר, כפי שמוצג על המסך. חזור על שלב 5.6.2 עד שכל נתוני הבקרות נרשמו.
    4. בחר ניסוי> הגדרת פיצויים> חישוב פיצויים . שמור את ההגדרה ואת שם הניסוי. לחץ על קישור ושמור .
      הערה: פיצוי הוא צעד הכרחי, שכן הוא מסיר את החפיפה בין הספקטרום בין הגלאים.
    5. אם נדרש פיצוי ידני, לעשות זאת על ידי התאמת האמצעים של האותות החיוביים כך שהם שווים את הנגטיבים עבור eacשעה של fluorochromes בשימוש.
      הערה: שלב זה נעשה על ידי המבצע סדרן התא עשוי לקחת 30 דקות.
  7. Gating אסטרטגיה ( איור 3 א ).
    1. הגדרת P1 על ידי זומם FSC לעומת SSC; ה- FSC מעיד על הגודל וה- SSC מציין את המורכבות הפנימית של התאים. ראה איור 3 א .
    2. ציור חלקה pseudocolor של SSC-H (גובה) לעומת SSC-W (רוחב) באמצעות האוכלוסייה הנבחרת בשלב 5.7.1 (P1); העלילה pseudocolor מאפשר ייצוג חזותי של צפיפות תאים יחסית אחד לשני.
      הערה: צפיפות תאים נמוכה מיוצגת על ידי כחול וירוק, ואילו אזורים אדומים וכתומים מייצגים צפיפות תאים גבוהה.
      1. בצע שלב זה כדי לאסוף תאים בודדים בלבד; שער תא בודד נקרא P2. ראה איור 3 א .
    3. חזור על שלב 5.7.2 אלהעלילה FSC-H לעומת FSC-W באמצעות P2. ודא כי הבחירה של תאים בודדים כמו "זוגות" או גושי התא מכיל גם סימן חיובי שלילי, מתן חיוביות שקר.
    4. צייר חלק pseudocolor של CD90.2 לעומת CD48. בחר את כל התאים CD90.2 + CD48 Neg לחסל מונוציטים מעשרת RGC; התקשר לשער CD90.2 + CD48 שלילי , או P3. ראה איור 3 א .
    5. באמצעות CD90.2 + CD48 הנבחר האוכלוסייה או שער P3, לצייר חלק pseudocolor של CD57 לעומת CD15 לחסל מזהמים תא Amacrine מן העשרת RGC. שער CD15 Neg CD57 האוכלוסייה. ראה איור 3 א .
  8. הגדרת אוכלוסיות להיות שנאספו עבור המדגם בחלון "מיון פריסה" ולהמשיך עם מיון התא; המדגם לאסוף הוא CD90.2 + CD48 נג CD15 נג CD57 שלילית P>.
    הערה: האוכלוסייה שתמוין נבחרה מהתפריט הנפתח הוסף בחלון המיון. לאחר הוספת האוכלוסייה, היא תבקש אירועי יעד או כמה אירועים יש לאסוף. בכל עת, ניתן לערוך את פריסת המיון על ידי לחיצה על השדה מיקום מיקום המכיל את האוכלוסייה. 0.9% ± 0.3 של RGCs עם הפנוטיפ CD90.2 + CD48 Neg CD15 נג CD57 שלילית מתקבלים מגיל צעיר (5-7 שבועות) ו 0.5% ± 0.3 ו ישן (> 12 חודשים) C57BL / 6J עכברים 23 .
  9. באמצעות 25,000 תאים, לבצע בדיקת טוהר 23 . ראה איור 3 ב-א .
    הערה: בדיקת הטוהר היא תהליך לנתח מחדש את התאים מיון כדי לאמת את הדיוק של מיון התא. Aliquot קטן של תאים ממוינים יהיה נטען על cytometer לאמת את האפקטיביות של המיון.
6) אישור על RGC סמנים תאיים

  1. תיוג תאיים.
    1. תקן תאים מיון עבור 1 שעות ו permeabilize ב 4 ° C כדי להפוך את התאים מטבולית בלתי פעיל כדי לאפשר את החדירה של נוגדנים תאיים.
    2. לדלל את הנוגדנים הבאים לפתרון permeabilization: אנטי רנ"א מחייב חלבון עם שחבור מרובות (RBPMS) בדילול 1: 100 במלאי 100 מיקרוגרם / מ"ל; אנטי-סינולאין גמא (SNCG), 1: 100 במלאי של 1 מ"ג / מ"ל; המוח ספציפי homeobox / POU תחום חלבונים 3A (BRN3A), 1: 100 במלאי 200 מיקרוגרם / מ"ל; ו אנטי נוירון ספציפי בכיתה III בטא טובולין (TUJ1), 1: 100 במלאי 1 מ"ג / מ"ל. דגירה התאים ופתרונות נוגדן במשך 1 שעה דלי קרח מכוסה.
    3. שטפו את הדגימות פעמיים עם PBS / 1% FBS.
    4. Resuspend התאים המתאימים AF488 שתייגת נוגדנים משני ב דילול 1: 200 במשך 30 דקות בתוך דלי קרח.
    5. שטפו את הדגימות כמו בשלב 6.1.3. שמור את התאים בפניםPBS / 1% FBS (250 μL) עד מוכן לנתח.

7. אימות של תא מיון לפי ניתוח qPCR

הערה: ראה איור 4 .

  1. מיצוי רנ"א 23 .
    1. חלץ את ה- RNA מ 5.0 x 10 5 תאים מיון על ידי תמוגה התא homogenization ואחריו תוספת של כלורופורם.
    2. מעבירים את השלב העליון, חסר צבע כדי microtube נקי עבור משקעים אלכוהול ואחריו תמצית תמצית בעמודה ספין. לבצע עיכול DNAse על העמודה.
    3. שטפו את הטור עם מים חינם RNase עבור אלוטיון RNA.
    4. להעריך את הריכוז RNA ידי spectrophotometry.
  2. CDNA סינתזה מראש הגברה.
    1. השתמש 100 ng של חומר RNA ומערבבים עם פתרון המכיל אנזים transcriptase הפוך, מעכב ribonuclease רקומביננטי (כדי למנוע השפלה RNA), מגנזיום כלורי (MgCL 2 ), וכן deoxynucleotides.
    2. מערבבים את תוכן הצינור דגירה במשך 10 דקות על 25 מעלות צלזיוס ואחריו 60 דקות על 42 מעלות צלזיוס. לסיים את התגובה עם הדגירה 5 דקות ב 85 מעלות צלזיוס. חנות cDNA וכתוצאה מכך ב -20 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.
      הערה: החומר cDNA ניתן לאחסן ב -20 מעלות צלזיוס למשך חודש עד אם צעד הגברה מראש לא יכול להתבצע באופן מיידי.
  3. טרום הגברה של cDNA.
    1. טרום להגביר חומר cDNA באמצעות סדרה של primers ספציפיים עבור סוגי תאים ברשתית רבים כולל: תאים גנגליון ברשתית, תאים amacrine, astrocytes, Müller, דו קוטבית, אופקי, photoreceptors, ותאי אפיתל פיגמנט ברשתית, כמפורט ב הפניה 23 בטבלה של חומרים .
      הערה: התגובה מראש הגברה מוכן להגדיל את הרגישות של זיהוי לכימות. התגובה טרום הגברה מכיל תערובת של פריימרמתערבב משולחן החומרים ; 2.5 μL של cDNA, אשר נכתבו ב 100 ng של RNA; אנזים transcriptase הפוך; ו nuclease ללא מים בנפח סופי של 10 μL.
    2. לבצע את שלב ההפעלה האנזים ב 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, ואחריו 14 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס במשך 15 שניות, ואחריו 60 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות. לדלל את החומר המוגבר מראש 1:10 במאגר EDIS Tris ולשמור אותו ב -20 מעלות צלזיוס עד מוכן לשימוש.
  4. 7.4 qPCR תגובה.
    1. הכן את כל התגובות qPCR בנפח 10 μL הסופי באמצעות מדולל, מראש מוגבר cDNA (2.5 μL), primers (המפורטים בטבלה של חומרים ), מים ללא nuclease, וכן להתרכז עם פולימראז DNA ו deoxynotides.
    2. השתמש בתנאי המכשיר הבאים כדי להפעיל את qPCR: צעד אחיזה של 50 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, ואחריו 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. הפעל סך של 40 מחזורים ב 95 מעלות צלזיוס במשך 15 שניות ואחריו 60 מעלות צלזיוס למשך 1 דקות. בצע את כל המדידהEments משכפל של שלושה.
    3. בצע כימות יחסית באמצעות סף ההשוואה (C T ) לאחר קביעת ערכי C T עבור הגן משק הבית ואת הגנים היעד בכל מדגם. לחשב את שינוי הקפל היחסי (R q ) באמצעות המשוואה הבאה: R = q = 2 T -ΔC , כאשר ΔC T = C T גן היעד - C T התייחסות הגן 23 .
      הערה: C C מוגדר מחזור PCR שבו האות ניאון של צבע הכתב חוצה סף להציב באופן שרירותי 26 . C T קשורה הפוך לכמות amplicon (מוצר PCR) בתגובה.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

המחקר מעמיק של RGCs מונע על ידי גורמים רבים, כולל תדירות נמוכה שלהם ואת חוסר מתודולוגיה חזקה ומתוקננת לבידוד שלהם. איור 1 מציג את המתודולוגיה המשמשת לבידוד retinae. וריאציות בהליך enucleation קיימות על סמך סוג הניתוח, כגון אם האנקלאציה היא ח?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

FACS היא טכניקה של בחירה כדי לטהר אוכלוסיות תאים. שיטות בידוד אחרות כוללות immunopanning, חרוזים מגנטיים, ואת ההשלמה קיבעון משלים. היתרון של FACS על פני מתודולוגיות אחרות אלה מבוסס על זיהוי סימולטני של סמנים פני השטח עם דרגות שונות של אינטנסיביות. עוצמת הניאון של המולקולה פרופו...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים פיננסיים מתחרים.

Acknowledgements

המחברים מבקשים להודות למר טים היגינס, מאייר בכיר מהמחלקה למיקרוביולוגיה, אימונולוגיה וביוכימיה, לסיוע טכני טכני; ד"ר מתיו ווילסון לדיונים ולחברי המעבדות של ג'בלונסקי ומוראלס-טיראדו על הערותיהם המועילות. עבודה זו נתמכה על ידי מכון המחקר Alcon Research Young Investigator Award (VMM-T), אוניברסיטת Tennessee Research Foundation (VMM-T), המכון הלאומי Eye EY021200 (MMJ), אחוות Gerwin (VMM-T); את אחוות גרובין לפני הדוקטורט (ZKG), את מחלקת המחקר הרפואי של צבא ההגנה ואת פקודת המטען (VMM-T) ואת המענק הבלתי מוגבל ממחקר למניעת עיוורון.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-mouse CD15 PEBioLegend125606Clone MC-480
Anti-mouse CD48 PE-Cy7BioLegend103424Clone HM48-1
Anti-mouse CD57Sigma AldrichC6680-100TSTClone VC1.1
Anti-mouse CD90.2 AF700BioLegend105320Clone 30-H12
Brilliant Violet 421 Goat Anti-mouse IgGBioLegend405317Clone Poly4053
Purified Anti-mouse CD16/32BioLegend101302FcgRII/III block, Clone 93
Zombie Aqua BioLegend423102Live cell/ Dead cell discrimination
Fetal Bovine SerumHycloneSH30071.03U.S. origin
AbC Total Antibody Compensation Bead KitThermo Fisher ScientificA10497Multi-species Ig
Neurobasal MediumThermo Fisher Scientific21103049Add serum to media prior to culture.
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific10010049Saline solution
Dissection MicroscopeOlympusSZ-PT ModelStereo Microscope
Sorvall CentrifugeThermo ScientificST 16RAll centrifugation performed  at RT
Base Plate – Dissection PanFisher ScientificSB15233FIMA wax plate can also be used
ForcepsAesculap5002-74 ½ inches
Iris Scissors, StraightAesculap13605 ½ inches
Falcon 15 mL conical tubesFisher Scientific352097Polypropylene tubes
Falcon 50 mL conical tubesFisher Scientific352098Polypropylene tubes
BD FACS TubesFisher Scientific352003Polypropylene tubes
40 mm dishesMidSciTP93040Tissue culture treated
70 μm nylon strainerMidSci70ICSsterile
40 μm nylon strainerMidSci40ICSsterile
 BD 10 mL syringeFisher Scientific301604Disposable Syringe without needle
PestlesMidSciPESTsterile
Wheaton VialsFisher Scientific986734No Liner
BD 30 G needleFisher Scientific3051281 inch
Hausser Scientific Bright-Line Glass Counting ChamberFisher Scientific0267151BHemocytometer
Gibco Trypan blue 0.4% SolutionFisher Scientific15250061Viability Dye
Eppendorf tubesFisher Scientific05-402-251.5mL
EVOS Floid Cell ImagingThermo Fisher Scientific447113Fluorescence Imaging with a 20X objective
100% EthanolFisher Scientific04-355-452Used to make 70% Ethanol
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+Rainin17014282LTS Pipette
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+Rainin17014391LTS Pipette
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+Rainin17014392LTS Pipette
Rack LTS 1000 mL – GPS-L1000SRainin17005088Blue Rack Sterile Tips
Rack LTS 250 mL – GPS-L250SRainin17005092Green Rack Sterile Tips
Rack LTS 20 mL – GPS-L10SRainin17005090Red Rack Sterile Tips
FACSAria II Cell SorterBD BiosciencesN/ACustom order
LSR II CytometerBD BiosciencesN/ACustom order
Abca8aThermo Fisher ScientificMm00462440_m1Müller cells
Aldh1alThermo Fisher ScientificMm00657317_m1Müller cells
Aqp4Thermo Fisher ScientificMm00802131_m1Astrocytes
Calb2Thermo Fisher ScientificMm00801461_m1Amacrine, Horizontal
Cd68Thermo Fisher ScientificMm03047340_m1Retinal Pigment Epithelial Cells
Gad2Thermo Fisher ScientificMm00484623_m1Amacrine
HprtThermo Fisher ScientificMm01545399_m1House keeping gene
Lhx1Thermo Fisher ScientificMm01297482_m1Horizontal
Lim2Thermo Fisher ScientificMm00624623_m1Horizontal
NrlThermo Fisher ScientificMm00476550_m1Photoreceptors
Ntrk1Thermo Fisher ScientificMm01219406_m1Horizontal
Pcp4Thermo Fisher ScientificMm00500973_m1Bipolar, Amacrine
Pou4f1Thermo Fisher ScientificMm02343791_m1Retinal Ganglion Cells
Prdx6Thermo Fisher ScientificMm00725435_s1Astrocytes
PrkcaThermo Fisher ScientificMm00440858_m1Bipolar
Prox1Thermo Fisher ScientificMm00435969_m1Horizontal
PvalbThermo Fisher ScientificMm00443100_m1Amacrine
RbpmsThermo Fisher ScientificMm02343791_m1Retinal Ganglion Cells
Rom1Thermo Fisher ScientificMm00436364_g1Photoreceptors
Rpe65Thermo Fisher ScientificMm00504133_m1Retinal Pigment Epithelial cells
Slc1a3Thermo Fisher ScientificMm00600697_m1Astrocytes
Slc6a9Thermo Fisher ScientificMm00433662_m1Amacrine
SncgThermo Fisher ScientificMm00488345_m1Retinal Ganglion Cells
Tubb3Thermo Fisher ScientificMm00727586_s1Retinal Ganglion Cells
VimThermo Fisher ScientificMm01333430_m1Müller cells
Taqman Universal Master MixThermo Fisher Scientific4440047qPCR Reagent
miRNeasy Mini KitQiagen217004RNA Isolation
SuperScript VILO cDNA Synthesis KitThermo Fisher Scientific11754250cDNA synthesis
Taqman PreAmp Master MixThermo Fisher Scientific4391128Pre-Amplification step
BD Cytofix/ CytopermBD Biosciences554714Fixation/ Permeabilization Buffer
BD Perm/ WashBD Biosciences554723Permeabilization Solution
RBPMSSanta Cruz Biotechnologysc-86815intracellular antibody
SNCGGene TexGTX110483intracellular antibody
BRN3ASanta Cruz Biotechnologysc-8429intracellular antibody
TUJ1BioLegend801202intracellular antibody

References

  1. Flammer, J., Orgul, S. Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).
  2. Bathija, R. Optic nerve blood flow in glaucoma. Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).
  3. Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma. Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).
  4. Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye (Lond). 18 (11), 1089-1095 (2004).
  5. Tian, N., Hwang, T. N., Copenhagen, D. R. Analysis of excitatory and inhibitory spontaneous synaptic activity in mouse retinal ganglion cells. J Neurophysiol. 80 (3), 1327-1340 (1998).
  6. Schmidt, K. G., Bergert, H., Funk, R. H. Neurodegenerative diseases of the retina and potential for protection and recovery. Curr Neuropharmacol. 6 (2), 164-178 (2008).
  7. Dreher, B., Sefton, A. J., Ni, S. Y., Nisbett, G. The morphology, number, distribution and central projections of Class I retinal ganglion cells in albino and hooded rats. Brain Behav Evol. 26 (1), 10-48 (1985).
  8. Williams, R. W., Strom, R. C., Rice, D. S., Goldowitz, D. Genetic and environmental control of variation in retinal ganglion cell number in mice. J Neurosci. 16 (22), 7193-7205 (1996).
  9. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  10. Surgucheva, I., Weisman, A. D., Goldberg, J. L., Shnyra, A., Surguchov, A. Gamma-synuclein as a marker of retinal ganglion cells. Mol Vis. 14, 1540-1548 (2008).
  11. Nadal-Nicolas, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3860-3868 (2009).
  12. Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (2), 1052-1058 (2010).
  13. Van Bergen, N. J., et al. Recharacterization of the RGC-5 retinal ganglion cell line. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (9), 4267-4272 (2009).
  14. Wood, J. P., Chidlow, G., Tran, T., Crowston, J. G., Casson, R. J. A comparison of differentiation protocols for RGC-5 cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (7), 3774-3783 (2010).
  15. Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1 (9), 791-803 (1998).
  16. Hong, S., Iizuka, Y., Kim, C. Y., Seong, G. J. Isolation of primary mouse retinal ganglion cells using immunopanning-magnetic separation. Mol Vis. 18, 2922-2930 (2012).
  17. Julius, R. S. The sensitivity of exponentials and other curves to their parameters. Comput Biomed Res. 5 (5), 473-478 (1972).
  18. Reif, A. E., Allen, J. M. The Akr Thymic Antigen and Its Distribution in Leukemias and Nervous Tissues. J Exp Med. 120, 413-433 (1964).
  19. Watanabe, M., Noguchi, T., Tsukada, Y. Regional, cellular, and subcellular distribution of Thy-1 antigen in rat nervous tissues. Neurochem Res. 6 (5), 507-519 (1981).
  20. Haeryfar, S. M., Hoskin, D. W. Thy-1: more than a mouse pan-T cell marker. J Immunol. 173 (6), 3581-3588 (2004).
  21. Sahagun, G., Moore, S. A., Fabry, Z., Schelper, R. L., Hart, M. N. Purification of murine endothelial cell cultures by flow cytometry using fluorescein-labeled griffonia simplicifolia agglutinin. Am J Pathol. 134 (6), 1227-1232 (1989).
  22. Shoge, K., et al. Rat retinal ganglion cells culture enriched with the magnetic cell sorter. Neurosci Lett. 259 (2), 111-114 (1999).
  23. Chintalapudi, S. R., et al. Isolation and Molecular Profiling of Primary Mouse Retinal Ganglion Cells: Comparison of Phenotypes from Healthy and Glaucomatous Retinas. Front Aging Neurosci. 8, 93(2016).
  24. Nagdeve, N. G., Yaddanapudi, S., Pandav, S. S. The effect of different doses of ketamine on intraocular pressure in anesthetized children. J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 43 (4), 219-223 (2006).
  25. Ding, C., Wang, P., Tian, N. Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model. Exp Eye Res. 92 (6), 512-520 (2011).
  26. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  27. Aerts, J., Nys, J., Arckens, L. A highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening. J Vis Exp. (92), e51936(2014).
  28. Li, X., et al. Loss of AP-2delta reduces retinal ganglion cell numbers and axonal projections to the superior colliculus. Mol Brain. 9 (1), 62(2016).
  29. Moshiri, A., et al. Near complete loss of retinal ganglion cells in the math5/brn3b double knockout elicits severe reductions of other cell types during retinal development. Dev Biol. 316 (2), 214-227 (2008).
  30. Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12), 5151-5162 (2003).
  31. Jakobs, T. C., Ben, Y., Masland, R. H. CD15 immunoreactive amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 465 (3), 361-371 (2003).
  32. Uusitalo, M., Schlotzer-Schrehardt, U., Kivela, T. Ultrastructural localization of the HNK-1 carbohydrate epitope to glial and neuronal cells of the human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (3), 961-964 (2003).
  33. Jackson, C. J., Garbett, P. K., Nissen, B., Schrieber, L. Binding of human endothelium to Ulex europaeus I-coated Dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium. J Cell Sci. 96 ( Pt 2), 257-262 (1990).
  34. Pennartz, S., Perraut, M., Pfrieger, F. Purification of retinal ganglion cells from postnatal rats by magnetic cell sorting. MACSmore. 12 (2), 16-18 (2010).
  35. Nadal-Nicolas, F. M., et al. Displaced retinal ganglion cells in albino and pigmented rats. Front Neuroanat. 8, 99(2014).
  36. Nadal-Nicolas, F. M., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo-Barriuso, M. Two methods to trace retinal ganglion cells with fluorogold: from the intact optic nerve or by stereotactic injection into the optic tract. Exp Eye Res. 131, 12-19 (2015).
  37. Barnstable, C. J., Drager, U. C. Thy-1 antigen: a ganglion cell specific marker in rodent retina. Neuroscience. 11 (4), 847-855 (1984).
  38. Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. (16), (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

125RGCcytometryneurodegeneration

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved