JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Milyonlarca insan irreversibl körlüğe neden olan retinal dejeneratif hastalıklardan muzdarip. Bu hastalıkların birçoğunun ortak bir unsuru retinal gangliyon hücrelerinin kaybıdır (RGC'ler). Bu ayrıntılı protokol, primer murin RGC'lerin akış sitometrisi ile pozitif ve negatif seçilim yoluyla izole edilmesini açıklar.

Özet

Nörodejeneratif hastalıklar genellikle etkilenenler üzerinde yıkıcı bir etkiye sahiptir. Retinal gangliyon hücresi (RGC) kaybı, normal yaşlanmaya ek olarak diyabetik retinopati ve glokom da dahil olmak üzere bir dizi hastalıkta rol oynar. RGC'lerin önemine rağmen, bugüne kadar, retina içindeki çok çeşitli hücrelerin yalnızca küçük bir yüzdesini oluşturmaları nedeniyle kısmen çalışmak son derece zor olmuştur. Buna ek olarak, mevcut izolasyon yöntemleri canlı olmayan hücreler üreten RGC'leri belirlemek için hücre içi işaretleyicileri kullanır. Bu teknikler aynı zamanda uzun izolasyon protokollerini de içerdiğinden, RGC'leri elde etmek ve izole etmek için pratik, standartlaştırılmış ve güvenilir yöntemlerin eksikliği vardır. Bu çalışma, hem pozitif hem de negatif seçim kriterlerine dayanan bir protokol kullanarak, farelerin retinasından birincil RGC'lerin izole edilmesi için etkili, kapsamlı ve güvenilir bir yöntem açıklamaktadır. Sunulan yöntemler, RGC'lerin ilerideki çalışmalarına olanak tanır;Nörodejeneratif hastalıklarda fonksiyonel RGC kaybından kaynaklanan görme keskinliğinde azalma.

Giriş

RGC'ler terminal olarak diferansiye edilmiş nöronlardır ve bu nedenle deney için birincil hücreler gerekir. Birincil sıçangil retinal gangliyon hücrelerinin (RGC'lerin) izolasyonu ve zenginleştirilmesi için bir protokol geliştirilmesi, RGC'nin sağlık ve dejenerasyon mekanizmalarını in vitro ortaya koymak için temel teşkil etmektedir. Bu, RGC işlevini desteklemek ve ölümlerini en aza indirmek için potansiyel terapiler üretmek isteyen araştırmalar için özellikle önemlidir. RGC'lerin dejenerasyonu, glokom, diyabetik retinopati ve normal yaşlanma gibi retinal dejeneratif hastalıklarla ilişkilidir. RGC kaybına neden olan spesifik hücresel mekanizmalar belirsiz olmasına rağmen, bir dizi risk faktörü tanımlanmıştır. Optik sinir başındaki oksijenasyon yetersizliği 1 , 2 , 3 RGC ölümüne 4 neden olur ve uyarıcı ve ben aktivasyonu arasındaki homeostazın bozulması gibi davranırBireysel RGC'lerde nhibitor reseptörler 5 , 6 . Bir dizi zorluk, derinlemesine çalışmalar için bu hücrelerin kullanımına yönelik ilerlemeyi engeller. İlk olarak, bir sıçangil retinasında bulunan RGC sayısı azdır. RGC'ler toplam retinal hücrelerin% 1'inden azını oluşturmaktadır 7 , 8 , 9 . İkincisi, RGC'ye özgü belirteçlerin çoğunda hücre içi proteinler 10 , 11 , 12'dir . Bu işaretleyicilere dayanan seçim, hücreleri canlı olmamakla birlikte, işlevsel analizlerin yapılmasını engellemektedir. Sonunda, mevcut protokoller uzun sürmektedir ve standardizasyon eksikliği 13,14'tür. Erken RGC izolasyon protokolleri bağışıklama yöntemlerine dayanıyordu. Barres ve ark. 15 Klasik bağışıklığı uyarladıAnasyon tekniğiyle birleştirildi ve bir hücre yüzeyi markörü olan anti-timosit antijenine (aka Thy1) immünopozitifliğe dayalı pozitif seçilimden önce retin hücrelerinin hacminden monositleri ve endotel hücrelerini hariç tutan ikinci bir adım ekledi. Yıllar sonra, Hong ve ark. RGC'leri yüksek saflıkta izole etmek için hücre ayırma stratejileri ile manyetik boncuk izolasyon teknikleri kombine edilmiştir 16 . Manyetik boncukların kullanımı halen birçok bilimsel uygulamada kullanılmaktadır. Birlikte, manyetik boncuklar ve akış sitometri protokolleri izole edilmiş hücrelerin saflığını geliştirdi. Bununla birlikte, bu saflaştırma sistemleri henüz ayrılmış retinadan sıçangiller RGC'lerin izolasyonu için standardize edilmemiştir.

Akış sitometresi, hücre süspansiyonlarının optik ve floresans özelliklerini ölçen güçlü bir analitik yöntemdir. Hücreler hem niceliksel hem de niteliksel olarak yüksek duyarlılıkla analiz edilir ve hücre halkının çok boyutlu bir analizini sağlartirme. Hücresel ayrımcılık, iki ana fiziksel özellik üzerine kuruludur: hücre boyutu veya yüzey alanı ve taneciklilik veya iç karmaşıklık 17 . Benzer uyarılma dalga boylarına ve farklı emisyonlara sahip olan florokromlarla etiketlenmiş antikorları birleştirerek çok boyutlu bir analiz yapılabilir. Akış sitometrisi hızlı, tekrarlanabilir ve hassas. Multitpe lazerler, akış sitometrisiyle tek hücrelerin çok boyutlu analizlerine izin verir. Bu nedenle, sitolojik örneklerin incelenmesi için çekici bir metodoloji. Floresan aktive hücre ayırma (FACS), bireysel hücreleri farklı alt popülasyonlara ayırmak için akış sitometrisi ile tanımlanan çok boyutlu fenotipik farklılıkları kullanır.

Son on yılda, nöronlar da dahil olmak üzere hücre seçimi için potansiyel biyolojik belirteç olarak çoklu yüzey ve hücre içi proteinler tespit edilmiştir. RGC'leri sıçanlardan ayırmaya çalışan ilk çalışmalar, Thy1'i ganglion celi olarak kullandıL işaretleyici. Ne yazık ki Thy1, diğer CD90, diğer kemirgen türleri 18 , 19 , 20'de birden fazla izoforma sahiptir ve çoklu retinal hücre tipleri 19 , 20 tarafından ifade edilir, bu da RGC'ler için spesifik olmayan bir belirteç yapar. CD48 adlı bir diğer yüzey markörü makrofajlar ve mikroglialar da dahil olmak üzere retinanın monositik popülasyonlarında bulunur. Bu iki yüzey markörünü kullanarak, modifiye edilmiş bir RGC imza-Thy1 + ve CD48 negatif hücreleri- 15 , 16 , 21 , 22 geliştirildi . Maalesef, bu iki seçim ölçütü, oldukça zenginleştirilmiş bir RGC popülasyonu seçmek için yeterli değildir. Bu karşılanmamış ihtiyacı gidermek için, çok tabakalı pozitif ve negatif seçim kriterlerine dayanan bir flow sitometri protokolü geliştirildi.Primer murin RGC'leri zenginleştirmek ve saflaştırmak için bilinen hücre yüzeyi belirteçleri.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

Aşağıdaki protokolde detaylandırılan bütün prosedürler, Tennessee Sağlık Bilimleri Merkezi (UTHSC) Üniversitesinde Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) gözden geçirme kurulu tarafından onaylanmış ve Kullanım İçin Vizyon ve Oftalmoloji Araştırma Derneği (ARVO) Beyannamesini takip etmiştir (Laboratuar Hayvanları Enstitüsü Enstitüsü, Hayvan Bakımı ve Laboratuar Hayvanları Kullanımına Yönelik Kamu Sağlığı Hizmet Politikası) ek olarak, oftalmik ve Vizyon Araştırmalarında Hayvanlar Üzerine Etkileri.

1. Araçların, Çözümlerin ve Medyanın Hazırlanması

Not: Protokolde rapor edilen malzemeler, reaktifler, aletler ve aletlerle ilgili tüm bilgiler Tablo Materyallerinde belirtilmiştir.

  1. Tüm diseksiyon aletlerini otoklavda tutun ve steril bir alanda saklayın. Aşağıdaki enstrümanları kullanın: 4 standart forseps (2 uzun ve 2 kısa) ve 2 makas,Aynı zamanda 2 forseps (1 uzun ve 1 kısa) ve diseksiyon için 1 makas; Yedek olarak yedek olarak tutun.
  2. Yıkamalar sırasında kullanılacak 100 mL steril PBS /% 1 FBS solüsyonu hazırlayın, immünolojik işaretleme prosedürleri ve hücre sıralama adımları. Solüsyonu 4 ° C'de soğumaya devam edin.
    Not: Çözeltiye sodyum azid (NaN 3 ) ilave etmeyin, çünkü canlı hücreler için toksik olabilir.
    1. 99 mL PBS ve 1 mL FBS ile 100 mL PBS /% 1 FBS hazırlayın.
  3. Toplama ve kültür ortamı olarak kullanılmak üzere% 3 FBS ile takviye edilmiş 100 mL steril sinir hücresi ortamı hazırlayın (Malzeme Listesine bakın). Hücre kültürü ortamını 4 ° C'de steril tutun. Kullanmadan önce oda sıcaklığına (RT) ısıtın.
    1. 97 mL nöral hücre ortamı ve 3 mL FBS kullanarak% 3 FBS ile takviye edilmiş 100 mL sinir hücresi ortamı hazırlayın.
  4. 5 mL toplama ortamı ile önceden kaplanmış ön soğutmalı toplama tüpleri (15 mL tüpler), tBuz kovasında etek Hücrelerin boru yüzeyine yapışmasını önlemek için yalnızca polipropilen tüpler kullanın.
  5. Biyolojik güvenlik kabininde 40 mm'lik tabaklar, 70 μm'lik naylon süzgeçler, şırınga, hücre süzgeci için paçallar ve steril polipropilen tüpler yerleştirin. Prosedürlerden önce tüm maddeleri sterilize edin ve prosedür boyunca steril bir şekilde muhafaza edin.
    Not: Retinanın toplanmasından sonraki tüm basamaklar biyogüvenlik kabininde yapılacaktır.

2. Enükleasyon

Not: Bu deneyde 1.0 x 106 RGC'yi fenotip CD90.2 + CD48 negatif CD15 negatif CD57 negatif ile izole etmek için toplam 10 genç (5-7 haftalık) C57BL / 6J faresi kullanılmıştır.

  1. Fareleri, CO 2 inhalasyonunu takiben servikal dislokasyonu kullanarak euthanize edin. Ötenazede kalan hayvanın öldüğünden emin olmak için her zaman ikinci bir ötanazi yöntemi kullanın.
    Not: İsoflüoran, CO2'ye alternatif olarak kullanılabilir. Anestezinin indükleyicisi olarak kullanıldığında göz içi basıncında (GİB) bir artış ile ilişkili olduğu için Ketamin önerilmez 24 , 25 .
  2. Gözün altına forseps yerleştirin, optik siniri tutun ve çekin; Optik sinir bozulmadan, dünyanın enükleasyonu yapılacaktır. Toplanan gözleri PBS içeren bir şişeye yerleştirin ve bir sonraki adıma kadar şişeyi buzda tutun.
    Not: Herhangi bir personel, Laboratuar Hayvan Bakım Ünitesi'nden (LACU) uygun eğitimi aldıktan sonra bu adımı gerçekleştirebilir.

3. Retinal Hücre Süspansiyonunun Hazırlanması

  1. Korneal diseksiyonu başlatmak için toplanan gözü diseksiyon mikroskopunun taban plakasına yerleştirin. Her gözü tek tek ayırın.
  2. Forseps kullanarak dikkatle dünya optik sinir tabanı tutun. Bu adım için bir lon kullanınG ve bir kısa standart forseps.
  3. Sulu mizahın gözlerden çıkmasını sağlamak için kornea delmek için 30-gauge (30G) keskin bir iğne kullanın, bu sayede forseps ile göz tutulmasını kolaylaştıracaktır.
  4. Korneayı forsepsle tutun ve korneada küçük bir kesi yapmak için makas kullanın. Forseps kullanarak korneayı ve sklerayı hafifçe soyun. Dünya yarıya kadar soyulduğunda, forseps kullanarak retinayı ve lensi yuvarlayın. Korneayı, sklerayı ve objektifi atın.
    Not: Bu yöntem, retinanın gözün geri kalan kısmından tamamen ayrılmasını sağlar.
  5. Retinayı, PBS /% 1 FBS içeren küçük bir 40 mm'lik Petri kabına yerleştirin.
    Not: Petri kabına alternatif olarak bir hücre kültürü çanağı kullanılabilir. Retinayı fizyolojik koşullarda olduğu gibi nemli tutmaya dikkat edin.
    1. Her retinayı biyogüvenlik kabini içinde üç kez taze steril PBS /% 1 FBS ile yıkayın.
  6. Üzerine 12 retina yerleştirinPBS /% 1 FBS ile nemlendirilmiş steril bir 70-μm naylon süzgeç. 10 mL'lik şırınganın arka ucunu kullanarak, hücreleri ayırmak için retinaayı yavaşça dairesel bir hareketle macerante edin.
    1. Alternatif olarak, hücre süzgeç macerası için bir havan tozu kullanın veya 15 IU / mL papain, 5 mM L-sistein ve 200 U / mL DNaz I kombinasyonu ile enzimatik sindirimi 37 ° C'de 15 dakika boyunca kullanın ve ardından PBS ile inaktive edin /% 10 FBS.
      Not: enzimatik sindirim, makarna ile karşılaştırıldığında ya şırınganın ya da havanının arka ucunda iyileşen hücrelerin yüzdesinde herhangi bir değişiklik gözlenmemiştir.
  7. İzole hücreleri aktarmak için steril 70-μm naylon süzgeci polipropilen toplama tüpünün üzerine yerleştirin. Toplanan hücreleri P1000 pipet kullanarak süzgeçten geçirin. Geriye kalan hücreleri serbest bırakmak için toplama tüpüne aktarmak için süzgeci ( adım 3.6 ) PBS /% 1 FBS ile durulayın.
  8. Ach için PBS /% 1 FBS ekleyinRetina başına 1 mL'lik nihai bir hacim var. Hücre süspansiyonunu 200 xg ve RT'de 7 dakika boyunca santrifüjleyin.
    Not: Macerasyonlu retinaların sayısına (<6 retina) bağlı olarak, hücre peleti görünür olamayacak kadar küçük olabilir.
    1. Hücre süpernatantı atın ve 5 retina başına 1 mL'lik bir oran kullanarak PBS /% 1 FBS'de hücre topağını tekrar süspansiyon haline getirin.
  9. Hemocytometer kullanarak hücreleri sayın.
    1. Bir cam hemocytometer ve lamel% 70 alkol ile temizleyin. Retina hücre süspansiyonunun eşit olarak dağıldığından emin olmak için hücreleri içeren tüpü yavaşça döndürün. Mikro santrifüj tüpüne 20 μL% 0.4 tripan mavisi yerleştirin ve hücre süspansiyonunun 20 μL'si ile karıştırın.
    2. Nazikçe karıştırın ve her iki hazneyi de doldurarak hemositometrede% 0.4 tripan mavisi / hücre süspansiyonu karışımı 10 mcL uygulayın; Kılcal etki, lamelin altında% 0.4 tripan mavisi / hücre süspansiyonu karışımı çekecektir. Mikroskop kullanarak tripan mavisi negatif hücreleri sayın; thiS sayısı canlı hücreleri temsil eder.
    3. Aşağıdaki formülü kullanarak hücre yaşayabilirliğini belirleyin: canlı hücre sayısı / toplam hücre sayısı = canlılık.
      Not: Hücrelerin yaşayabilirliği% 95'ten düşükse, FACS sırasında hücre canlılığı ayrımı için floresan boyanın kullanılması gereklidir.
  10. Canlı hücreler için geçirgen olmayan flüoresan yaşamsal boya kullanın. Herhangi bir serum izini kaldırmak için hücreleri PBS ile yıkayın. 100 uL'lik son hacimde 5.0 x 10 6 hücre başına hücre canlılığı ayrımcılığı için 1 μL floresan boya ekleyin. Isıdan korunan, oda sıcaklığında 15 dakika inkübe edin. 10x hacimde PBS /% 1 FBS ekleyin. 200 xg ve RT'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin.
  11. Gerekirse, hücre süspansiyonu gece boyunca 4 ° C'de inkübe edin. Bu yapılırsa, hücre süspansiyon tüp yerine PBS /% 1 FBS sinir hücresi orta doldurun. Tüpü yatay konuma getirin ve 4 ° C'de tutun.

4. Yeniden bağışıklık kazandırmaTinal hücreler

  1. Hücre sayısı başına antikor hacmini belirlemek için aşağıdaki dönüşüm kullanın: 100 uL hacimdeki 5.0 x 10 6 hücre başına 2 uL antikor.
  2. Hücreleri yıkayın ve PBS /% 1 FBS'de muhafaza edin. Sıralama kurulumunda negatif bir kontrol (etiketsiz) olarak kullanmak için küçük bir hücre parçasını (5.0 x 10 6 hücre) alın.
    Not: Bu negatif kontrol, hücre sıralayıcının doğru şekilde kalibre edilmesi için kritik öneme sahiptir.
  3. Fcγ reseptörlerini II ve III ifade eden hücrelere karşı antikorların spesifik olmayan bağlanmasını en aza indirgemek için, PBS /% 1 PBS kullanılarak 50 uL'lik bir nihai hacim içinde 1.0 x 10 6 hücre başına bir anti-fare CD16 / 32 antikoru 1 uL ekleyin. FBS. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin.
  4. Antikor kokteyli numuneye ekleyin ve pipetle hafifçe karıştırın. 30 dakika buz kovasında inkübe edin. Etiketlenmiş fluoro'nun foto-ağartılması nedeniyle ışığın deneyden ödünç alabileceğinden, buz kovasının kapalı olduğundan emin olunphores.
    1. Aşağıdaki floresan etiketli anti-fare antikorlarını kullanarak antikor kokteyli hazırlayın: CD90.2 AF-700, CD48 PE-Siyanin7, CD15 PE ve etiketlenmemiş CD57.
      Not: Her bir antikor için 5.0 x 106 hücre başına aşağıdaki konsantrasyonları kullanın: CD90.2 AF700, 1 μg; CD48 PE-Siyanin 7, 0.4 μg; CD15 PE, 0.02 ug; Ve etiketsiz CD57, 0.4 μg.
      1. Ciltleri aşağıdaki hesaplamalara göre kullanın (Malzeme Tablosunda listelenen piyasada bulunan antikorlara göre): etiketlenecek toplam 5.0 x 107 hücre; 5.0 x 10 6 hücre başına 2 mcL = her bir antikorun 20 uL'si; 4 farklı antikor = 80 uL antikor kokteyli; Nihai hacim = [(5.0 x 10 7 toplam hücre) /5.0 x 106 hücre] x 100 = 1,000 uL; 80 μL Abs + 50 μL anti-fare CD16 / 32 + 870 μL PBS /% 1 FBS = 1000 μL.
        Not: Bu kombinasyon,Enstrüman konfigürasyonu için florokromların optimum kombinasyonu. Aşağıdaki parametreler emisyon ve uyarılmayı özetler: AF-700, 638 nm'lik kırmızı diyot lazerle uyarıldığında 719 nm'lik emisyon; PE-Cyanine7, 488 nm mavi diyot lazer ile uyarıldığında 767 nm emisyon; Ve PE, 488 nm mavi diyot lazer ile uyarıldığında 575 nm emisyon.
  5. 30 dakika inkübasyondan sonra, PBS /% 1 FBS kullanarak hacmi 5 mL'ye getirin. Numuneleri 200 xg ve RT'de 7 dakika santrifüjleyerek yıkayın. Bağlanmamış tüm antikorları kaldırmak için işlemi bir kez tekrarlayın.
  6. 5.0 x 10 6 hücrelerinin CD57'sini bağlayacak 2 uL ikincil antikor (0.1 μg) ekleyin. Adım 4.4'te olduğu gibi bir buz kovasında 30 dakika inkübe edin. Adım 4.5'te olduğu gibi hücreleri iki kez yıkayın.
    1. Adım 4.4'te etiketlenmemiş birincil antikor kullanılmışsa, ikincil antikorla hücreleri işaretleyin.
      Not: İkinciBu konfigürasyon için seçilen bir artı antikor , Malzeme Tablosu'nda listelenmiştir; 421 nm'lik bir emisyon dalga boyuna sahiptir. 405 nm'de menekşötik diyot lazeriyle uyarıldığında 450/50 nm'lik bir bant geçiren filtreyle kullanın.
    2. Aşağıdaki hesaplamalara göre hacim kullanın (Malzeme Tablosunda listelenen ticari olarak temin edilebilir antikora dayanılarak): 5.0 x 10 6 hücre başına 2 μL = ikincil antikorun 20 uL'si; Nihai hacim = [(5.0 x 10 7 toplam hücre) /5.0 x 106 hücre] x 50 = 500 uL; 20 μL Abs + 480 μL PBS /% 1 FBS = 500 μL.
  7. Etiketli hücreleri PBS /% 1 FBS'de tutun. Bir hemocytometer kullanarak hücreleri sayın; 3.0 - 4.0 x 107 hücre / mL son retinal hücre konsantrasyonunu kullanın.
    Not: Hücre kültürü ortamını hücreleri inceltmek için kullanmayın, çünkü fenol kırmızısı otofloresansı artırabilir, böylece negat arasındaki çözünürlüğü düşürebilirIve ve pozitif hücreler. Her bir hacim için nihai hücre yoğunluğu, cihaz konfigürasyonunun hacim akış oranına büyük ölçüde bağlıdır.
  8. Floresan yayılımı en aza indirgemek için kurulum sırasında tek renkli kontrolleri kullanın.
    Not: Dengeleme olarak da bilinen bu adım, florofor kombinasyonunun yarattığı gürültüyü düzeltmek için uygulanır. PBS /% 0.1 BSA / 2 mM NaN 3 içerisindeki , birden fazla türe ait floresan etiketli immünoglobülin (Ig) izotiplerini bağlama kapasitesine sahip polistiren mikro küreleri, dengelemeyi ayarlamak için pozitif kontroller sağlar.
    1. Florofor başına bir tane ayırarak steril FACS tüplerine 3 damla polistiren mikrosfer yerleştirin. Her bir tüpe ilgili flüorofordan 1 μg ekleyin. Oda sıcaklığında 15 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. Örnek tüplerine 3 mL PBS /% 1 FBS ekleyin. 200 xg ve RT'de 5 dakika boyunca santrifüjleyin. Yüzen maddeyi dikkatlice çıkarın ve 250 μL PBS /% 1 FBS içinde tekrar süspanse edin.
    2. Negatif kontrölü oluşturmak içinOls, Ig'ye bağlanmayan polistiren mikro küreler kullanın. Gerekirse, bir önceki güne kadar bu adımı uygulayın.

5. Hücre Sıralama Stratejisi

Not: 355 nm, UV ile FACS için enstrüman kurulumu için özel talimatlar; 405 nm, menekşe; 488 nm, mavi; Ve sırasıyla 2, 2, 5 ve 3 floresan kanalı dağılımı ile 640 nm, kırmızı lazerler. İşletim yazılımı DIVA 8.0.1 sürümü idi. Hücre ayıracı, 70 psi kılıf basıncı, 70 psi kılıf basıncı, 87.5 frekans, 333'te ilk damla kırılma ile 48.6 genlik, 6'lık aralık atlaması, sıralama hassaslığı varsayılan (32) saflık maskesiyle dört yönlü saflığa ayarlanmış ve damla damlası ile gerçekleştirildi Boncuk kullanarak gecikme 42.98'e ayarlandı.

  1. Toplama gemileri olarak 15 mL'lik polipropilen konik tüpleri kullanın. Her tüpe toplama ortamı (hücre kültürü ortamı) 5 mL ekleyin ve duvarları kaplamak için tüp döndürün.
    Not: Bu adım, hücrelerin t yanlarına yapışmasını önler.Koleksiyon tüpü. Alternatif olarak, boru seyreltilmemiş FBS ile kaplanabilir.
  2. Hücrenin son verimini hesaplamak için hücre ayırıcı etkinliğini göz önünde bulundurun.
    Not: Bu tür etkinlik, kullanılan akış sitometresine göre değişir. CD90.2 + CD48 negatif CD15 negatif CD57 neg fenotipi olan RGC'ler, tüm retinal hücrelerin yaklaşık% 1'ini oluşturur.
  3. Hücre ayırımını, eğitilmiş bir operatör tarafından gerçekleştirin (genellikle çekirdek bir tesiste). Numunenin alınmasından önce cihazın% 70 etanol ile temizlendiğinden ve steril edildiğinden emin olun. Toplama tüplerinin dışını dikkatli bir şekilde% 70 etanol ile silin.
  4. Hücreler çöktükten veya bir araya getirildiyse, hücreleri yukarı ve aşağı pipetle alın ve süspansiyonu edinmeden önce steril bir 40-μm naylon süzgeçle filtreleyin. Hücre ayıracı yapılırken sıcaklığı kontrol ettiğinizden ve 4 ° C'de tuttuğunuzdan emin olun; Bunu yapmakta başarısızlık cel oranını düşürürVerim.
  5. Deneyleri gerçekleştirmeden önce sıralama ayrıntılarını hücre sıralayıcı operatörüyle tartışın.
    Not: Deney sırasında hücre ayırıcı operatörü, sitometre için edinme yazılımının Çalışma Alanı araç çubuğundan bir dizi düğme tıklatmış olacaktır. Bunlar Tarayıcı , Sitometre , Müfettiş , Çalışma Sayfası ve Edinme Gösterge Tablosu'dur . Burada kullanılan hücre ayırma stratejisi 2 yönlü bir sıralama olarak bilinir. İki popülasyon toplanır: zenginleştirilmiş RGC'ler ve diğer tüm hücre türleri. Ek popülasyonlar toplanacaksa, en çok iki popülasyon 4 yönlü bir şekilde ayrılabilir. Ek popülasyonlar toplanırsa, hücre ayırıcı farklı toplama tüpleri ve kurulum gerektirir.
  6. Floroforlardan spektral örtüşme için düzeltme gerçekleştirin.
    Not: Bu işlem manuel olarak ayarla yapılabilirHer ayarı yaparsınız veya kullanımdaki yazılımın bir parçası olarak otomatik olarak yapılabilir. Hücre ayırma ekipmanları için kullanılan çoğu yazılım otomatik bir tazminat seçeneğine sahiptir. Altın standart ve en doğru tazminat türüdür. Negatif (floresofor içermeyen) numune ve deneyde kullanılan tüm ilgili monoklonal antikorları bağlamak için spesifik olarak üretilen polysterene mikrokürelerle hazırlanan tek kontroller (basamaklarda) bu aşamada kullanılacaktır.
    1. Deneme> Tazminat Ayarları> Tazminat Kontrolleri Oluştur'u seçin. Ekranda görüntülenen listeden fluorophore'a özgü kontrolleri ekleyin. Tamam'ı tıklayın.
      Not: Kontrollerin her biri için bir kompanzasyon tüpü görüntülenir.
      1. Ön dağınık ışığı (FSK), yan saçılmış ışığı (SSC) doğrulamak ve başlangıç ​​popülasyonunu (P1) kontrol etmek için etiketsiz bir kontrol kullanın (hiçbir fluorofor, adım 4.2 ).
    2. Negatif kontrol tüpünü sitometrenin üzerine yerleştirin ve Yükle'yi tıklayın. İlgi çeken popülasyonun gösterildiğinden emin olun ve seçin. Bu nüfus 1 (P1). P1 kapısını sağ tıklayın ve Tüm Telafi Kontrollerine Uygula'yı seçin. Veri Kaydet'i tıklayın. Kayıt tamamlandıktan sonra, Kaldır'ı tıklayın ve boruyu çıkarın.
    3. Ekranda gösterildiği gibi bir sonraki tüp sitometrenin üzerine yerleştirilir. Kontrollerden gelen tüm veriler kaydedilinceye kadar 5.6.2. Adımı tekrarlayın.
    4. Deneme> Tazminat Ayarları> Telafiyi Hesapla'yı seçin . Kurulumu kaydedin ve denemeyi adlandırın. Bağla ve Kaydet'i tıklayın .
      Not: Dedektörler arasındaki spektrum örtüşmesini ortadan kaldırdığı için telafi gerekli bir adımdır.
    5. Manuel telafi gerekiyorsa, pozitif sinyaller vasıtalarını eac için negatiflere eşit olacak şekilde ayarlayarak bunu yapınKullanılan florokromlardan saat.
      Not: Bu adım, hücre ayırıcı işlemi tarafından gerçekleştirilir ve 30 dakika sürebilir.
  7. Geçiş stratejisi ( Şekil 3A ).
    1. FSC'yi SSC'ye göre çizerek P1'i kurun; FSC büyüklüğün göstergesidir ve SSC, hücrelerin dahili karmaşıklığını gösterir. Bkz. Şekil 3A .
    2. 5.7.1 . Adımda (P1) seçilen popülasyonu kullanarak SSC-H (yükseklik) ile SSC-W (genişlik) arasında bir sahte renk şeması çizin; Yalancı renk çizimi, hücrelerin yoğunluğunun birbirine göre görsel olarak gösterilmesini sağlar.
      Not: Düşük hücre yoğunluğu mavi ve yeşil ile gösterilirken, kırmızı ve turuncu bölgeler yüksek hücre yoğunluğunu temsil eder.
      1. Yalnızca tek hücreleri toplamak için bu adımı uygulayın; Tek hücreli kapı P2 olarak adlandırılır. Bkz. Şekil 3A .
    3. Adım 5.7.2'yi tekrarlamakP2 kullanarak FSC-H'ye karşı FSC-W'yi çizin. Tek hücrelerin "çiftler" ya da hücre yığınları olarak seçilmesinin, yanlış pozitiflik sağlayan pozitif ve negatif bir işaretleyici içerdiğinden emin olun.
    4. CD48'e karşı CD48'e karşı bir sahte renk şeması çizin. RGC zenginleşmesinden monositleri yok etmek için tüm CD90.2 + CD48 negatif hücrelerini seçin; Bu kapıyı CD90.2 + CD48 negatif veya P3 olarak adlandırın. Bkz. Şekil 3A .
    5. Seçilen CD90.2 + CD48 negatif popülasyonunu veya P3 kapısını kullanarak, RGC zenginleşmesinden amacinal hücre kontaminantlarını ortadan kaldırmak için CD15'e karşı CD57 pseudocolor bir komutu çizin. CD15 negatif CD57 negatif popülasyonunu kapayın. Bkz. Şekil 3A .
  8. "Sort Layout" penceresinde örnek için toplanacak popülasyonları tanımlayın ve hücre sıralama işlemine devam edin; Toplamak için örnek CD90.2 + CD48 negatif CD15 negatif CD57 negatif p>.
    Not: Sıralama yapılacak popülasyon, sıralama penceresindeki açılan Ekle menüsünden seçilir. Nüfusu ekledikten sonra, hedef olayları veya kaç olay toplanacağını sorar. Herhangi bir zamanda, sıralama düzenini, nüfusu içeren Sıralama Konumu alanını tıklayarak düzenleyebilirsiniz. Genç (5-7 haftalık) ve% 0.5 ± 0.3 ve yaşlı (> 12 aylık) C57BL / 6J farelerden, CD90.2 + CD48 negatif CD15 negatif CD57 negatif fenotipi olan RGC'lerin% 0.9 ± 0.3'ü elde edildi 23 .
  9. 25.000 hücre kullanarak, saflık kontrolü yapın 23 . Bakınız Şekil 3B- E.
    Not: Saflık kontrolü, hücre sıralamasının doğruluğunu doğrulamak için sıralanmış hücreleri yeniden analiz etme işlemi olur. Sıralamış hücrelerin küçük bir bölümü, sitometrenin üzerine yüklenerek etkinliğinin doğrulanması sağlanır.
_title "> 6. RGC Hücre içi İşaretleyicilerin Onayı

  1. Hücre içi etiketleme.
    1. Hücreleri metabolik olarak pasif hale getirmek ve hücre içi antikorların nüfuz etmesine izin vermek için 1 saat süreyle sıralanmış hücreleri düzeltin ve 4 ° C'de permeabilize edin.
    2. Aşağıdaki antikorları, permeabilizasyon çözeltisinde seyreltin: 100 μg / mL'lik bir stokta 1: 100 seyreltmeyle çoklu ekleme (RBPMS) ile anti-RNA bağlama proteini; Anti-sinüklein gama (SNCG), 1 mg / mL stokta 1: 100; Beyine özgü homeobox / POU alan protein 3A (BRN3A), 1: 100, 200 ug / mL stokta; Ve anti-nörona spesifik sınıf III beta tübülin (TUJ1), 1: 100, 1 mg / mL'lik bir stokta. Hücreleri ve antikor solüsyonlarını kapalı buz kovasında 1 saat inkübe edin.
    3. Numuneleri iki kez PBS /% 1 FBS ile yıkayın.
    4. Hücreleri uygun bir AF488 etiketli sekonder antikorda bir buz kovasında 30 dakika süreyle 1: 200 seyreltme ile tekrar süspanse edin.
    5. Numuneleri, adım 6.1.3'te olduğu gibi yıkayın . Hücreleri tutunPBS /% 1 FBS (250 uL) ilave edin.

7. Hücrenin Validasyonu, qPCR Analizi ile Sırala

Not: Bkz. Şekil 4 .

  1. RNA ekstraksiyonu 23 .
    1. Hücre lizisi ve homojenleştirme ile RNA 5.0 x 10 5 sıralanır, ardından kloroform ilave edilir.
    2. Alkolle çöktürmek için üst, renksiz fazı temiz bir mikrotüpe aktarın, bunu takiben bir spin sütununda konsantrasyon elde edin. Sütun üzerinde DNAse sindirimini yapın.
    3. RNA elüsyonu için kolonu RNaz içermeyen su ile yıkayın.
    4. Spektrofotometri ile RNA konsantrasyonunu değerlendirin.
  2. CDNA sentezi ve ön amplifikasyon.
    1. 100 ng RNA materyali kullanın ve ters transkriptaz enzimi, rekombinant ribonükleaz inhibitörü (RNA bozunumunu önlemek için), magnezyum klorür (MgCL 2 ) ve deoksinükleotidleri içerir.
    2. Tüp içeriğini karıştırın ve 25 ° C'de 10 dakika inkübe edin, ardından 42 ° C'de 60 dakika inkübe edin. Reaksiyonu 85 ° C'de 5 dakika inkübasyon ile tamamlayın. Elde edilen cDNA'yı kullanıma hazır olana kadar -20 ° C'de saklayın.
      Not: cDNA materyali, ön amplifikasyon basamağı derhal uygulanamazsa, bir aya kadar -20 ° C'de saklanabilir.
  3. CDNA'nın ön amplifikasyonu.
    1. CDNA materyalini Referans 23 ve Tablo'da detaylandırıldığı gibi retina ganglion hücreleri, amacrine hücreleri, astrositler, Müller, bipolar, yatay, fotoreseptörler ve retinal pigment epitel hücreleri dahil olmak üzere çoklu retinal hücre tipleri için spesifik bir dizi primer kullanarak önceden amplifiye edin Malzemeler .
      Not: Ön amplifikasyon reaksiyonu, miktar tespiti için duyarlılığı arttırmak için hazırlanmıştır. Ön amplifikasyon reaksiyonu, primerinMalzeme Tablosundan harmanlar; 100 ng RNA'da başlayan 2.5 uL cDNA; Ters transkriptaz enzimi; Ve 10 uL'lik nihai bir hacimde nükleaz içermeyen su.
    2. Enzim aktivasyon basamağını 95 ° C'de 10 dakika boyunca uygulayın, bunu takiben 95 ° C'de 15 saniye süreyle 14 döngü takiben 4 dakika 60 ° C uygulayın. Önceden güçlendirilmiş materyali 1:10 oranında Tris EDTA tamponunda seyreltin ve kullanıma hazır olana kadar -20 ° C'de saklayın.
  4. 7.4 qPCR reaksiyonu.
    1. Seyreltilmiş, önceden güçlendirilmiş cDNA (2.5 μL), primerler ( Malzemelerin Tablosunda listelenmiştir), nükleaz içermeyen su ve DNA polimeraz ve deoksinükleotitler içeren bir konsantre kullanılarak 10 μL son hacimdeki tüm qPCR reaksiyonlarını hazırlayın.
    2. QPCR'yi çalıştırmak için aşağıdaki enstrüman koşullarını kullanın: 2 dakika boyunca 50 ° C'de tutma basamağı, ardından 10 dakika boyunca 95 ° C. 95 ° C'de 15 saniye boyunca, ardından 60 ° C'de 1 dakika boyunca toplam 40 devir çalıştırın. Tüm ölçüleri uygulaEments üç kopyalar halinde.
    3. Her bir numunede oda temizliği geni ve hedef genler için C T değerlerini belirledikten sonra karşılaştırma eşiğini (C T ) kullanarak göreceli niceleme uygulayın. Aşağıdaki denklemi kullanarak göreli katlanma değişimini (R q ) hesaplayın: R q = 2 T -ΔC , burada ΔC T = C T hedef gen - C T referans geni 23 .
      Not: C T , raportör boyasının flüoresan sinyalinin keyfi olarak yerleştirilmiş bir eşiği 26 geçtiği PCR döngüsü olarak tanımlanır. C T , tepkimedeki amplikon (PCR ürünü) miktarıyla ters orantılıdır.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

RGC'lerin derinlemesine incelenmesi, düşük frekansları ve izolasyonları için sağlam ve standartlaştırılmış bir metodolojinin olmaması da dahil olmak üzere birçok faktör tarafından engellenmektedir. Şekil 1 , retina izolasyonu için kullanılan metodolojiyi göstermektedir. Enükleasyon prosedüründeki değişiklikler, enükleasyon in vivo deneyin bir parçası olup olmadığı gibi analiz türüne dayanır

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

FACS, hücre popülasyonlarını saflaştırmak için tercih edilen bir tekniktir. Diğer izolasyon yöntemleri arasında bağışıklık kazandırma, manyetik boncuklar ve kompleman sabitleme tükenmesi bulunur. FACS'nin bu diğer metodolojilere göre avantajı, değişik derecelerde yoğunluk gösteren hücre yüzeyi markörlerinin eşzamanlı tanımlanmasına dayanır. Molekülün flüoresan yoğunluğu protein ifade miktarı ile orantılıdır. Şimdiye dek, RGC'lerin izolasyonu kullanılan izolasyon yöntem...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarlar rakip mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.

Teşekkürler

Yazarlar teknik video yardımı için Mikrobiyoloji, İmmünoloji ve Biyokimya Bölümü'nden Kıdemli Illustrator Sayın Tim Higgins'e teşekkür etmek istiyorlar; Matthew W. Wilson'la tartışmalar ve Jablonski ve Morales-Tirado laboratuvarlarının üyeleri, yararlı yorumları için teşekkür eder. Bu çalışma, Alcon Araştırma Enstitüsü Genç Araştırmacı Ödülü (VMM-T), Tennessee Araştırma Vakfı (VMM-T) Üniversitesi, Ulusal Göz Enstitüsü EY021200 (MMJ), Gerwin Kardeşliği (VMM-T) tarafından desteklendi; Gerwin Ön Doktora Arkadaş Grubu (ZKG), Savunma Ordusu Tıbbi Araştırma ve Materiel Komutanlığı (VMM-T) ve Körlüğü Önleme Araştırması'ndan Sınırsız Hibe.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-mouse CD15 PEBioLegend125606Clone MC-480
Anti-mouse CD48 PE-Cy7BioLegend103424Clone HM48-1
Anti-mouse CD57Sigma AldrichC6680-100TSTClone VC1.1
Anti-mouse CD90.2 AF700BioLegend105320Clone 30-H12
Brilliant Violet 421 Goat Anti-mouse IgGBioLegend405317Clone Poly4053
Purified Anti-mouse CD16/32BioLegend101302FcgRII/III block, Clone 93
Zombie Aqua BioLegend423102Live cell/ Dead cell discrimination
Fetal Bovine SerumHycloneSH30071.03U.S. origin
AbC Total Antibody Compensation Bead KitThermo Fisher ScientificA10497Multi-species Ig
Neurobasal MediumThermo Fisher Scientific21103049Add serum to media prior to culture.
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific10010049Saline solution
Dissection MicroscopeOlympusSZ-PT ModelStereo Microscope
Sorvall CentrifugeThermo ScientificST 16RAll centrifugation performed  at RT
Base Plate – Dissection PanFisher ScientificSB15233FIMA wax plate can also be used
ForcepsAesculap5002-74 ½ inches
Iris Scissors, StraightAesculap13605 ½ inches
Falcon 15 mL conical tubesFisher Scientific352097Polypropylene tubes
Falcon 50 mL conical tubesFisher Scientific352098Polypropylene tubes
BD FACS TubesFisher Scientific352003Polypropylene tubes
40 mm dishesMidSciTP93040Tissue culture treated
70 μm nylon strainerMidSci70ICSsterile
40 μm nylon strainerMidSci40ICSsterile
 BD 10 mL syringeFisher Scientific301604Disposable Syringe without needle
PestlesMidSciPESTsterile
Wheaton VialsFisher Scientific986734No Liner
BD 30 G needleFisher Scientific3051281 inch
Hausser Scientific Bright-Line Glass Counting ChamberFisher Scientific0267151BHemocytometer
Gibco Trypan blue 0.4% SolutionFisher Scientific15250061Viability Dye
Eppendorf tubesFisher Scientific05-402-251.5mL
EVOS Floid Cell ImagingThermo Fisher Scientific447113Fluorescence Imaging with a 20X objective
100% EthanolFisher Scientific04-355-452Used to make 70% Ethanol
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+Rainin17014282LTS Pipette
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+Rainin17014391LTS Pipette
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+Rainin17014392LTS Pipette
Rack LTS 1000 mL – GPS-L1000SRainin17005088Blue Rack Sterile Tips
Rack LTS 250 mL – GPS-L250SRainin17005092Green Rack Sterile Tips
Rack LTS 20 mL – GPS-L10SRainin17005090Red Rack Sterile Tips
FACSAria II Cell SorterBD BiosciencesN/ACustom order
LSR II CytometerBD BiosciencesN/ACustom order
Abca8aThermo Fisher ScientificMm00462440_m1Müller cells
Aldh1alThermo Fisher ScientificMm00657317_m1Müller cells
Aqp4Thermo Fisher ScientificMm00802131_m1Astrocytes
Calb2Thermo Fisher ScientificMm00801461_m1Amacrine, Horizontal
Cd68Thermo Fisher ScientificMm03047340_m1Retinal Pigment Epithelial Cells
Gad2Thermo Fisher ScientificMm00484623_m1Amacrine
HprtThermo Fisher ScientificMm01545399_m1House keeping gene
Lhx1Thermo Fisher ScientificMm01297482_m1Horizontal
Lim2Thermo Fisher ScientificMm00624623_m1Horizontal
NrlThermo Fisher ScientificMm00476550_m1Photoreceptors
Ntrk1Thermo Fisher ScientificMm01219406_m1Horizontal
Pcp4Thermo Fisher ScientificMm00500973_m1Bipolar, Amacrine
Pou4f1Thermo Fisher ScientificMm02343791_m1Retinal Ganglion Cells
Prdx6Thermo Fisher ScientificMm00725435_s1Astrocytes
PrkcaThermo Fisher ScientificMm00440858_m1Bipolar
Prox1Thermo Fisher ScientificMm00435969_m1Horizontal
PvalbThermo Fisher ScientificMm00443100_m1Amacrine
RbpmsThermo Fisher ScientificMm02343791_m1Retinal Ganglion Cells
Rom1Thermo Fisher ScientificMm00436364_g1Photoreceptors
Rpe65Thermo Fisher ScientificMm00504133_m1Retinal Pigment Epithelial cells
Slc1a3Thermo Fisher ScientificMm00600697_m1Astrocytes
Slc6a9Thermo Fisher ScientificMm00433662_m1Amacrine
SncgThermo Fisher ScientificMm00488345_m1Retinal Ganglion Cells
Tubb3Thermo Fisher ScientificMm00727586_s1Retinal Ganglion Cells
VimThermo Fisher ScientificMm01333430_m1Müller cells
Taqman Universal Master MixThermo Fisher Scientific4440047qPCR Reagent
miRNeasy Mini KitQiagen217004RNA Isolation
SuperScript VILO cDNA Synthesis KitThermo Fisher Scientific11754250cDNA synthesis
Taqman PreAmp Master MixThermo Fisher Scientific4391128Pre-Amplification step
BD Cytofix/ CytopermBD Biosciences554714Fixation/ Permeabilization Buffer
BD Perm/ WashBD Biosciences554723Permeabilization Solution
RBPMSSanta Cruz Biotechnologysc-86815intracellular antibody
SNCGGene TexGTX110483intracellular antibody
BRN3ASanta Cruz Biotechnologysc-8429intracellular antibody
TUJ1BioLegend801202intracellular antibody

Referanslar

  1. Flammer, J., Orgul, S. Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma. Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).
  2. Bathija, R. Optic nerve blood flow in glaucoma. Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).
  3. Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma. Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).
  4. Morgan, J. E. Circulation and axonal transport in the optic nerve. Eye (Lond). 18 (11), 1089-1095 (2004).
  5. Tian, N., Hwang, T. N., Copenhagen, D. R. Analysis of excitatory and inhibitory spontaneous synaptic activity in mouse retinal ganglion cells. J Neurophysiol. 80 (3), 1327-1340 (1998).
  6. Schmidt, K. G., Bergert, H., Funk, R. H. Neurodegenerative diseases of the retina and potential for protection and recovery. Curr Neuropharmacol. 6 (2), 164-178 (2008).
  7. Dreher, B., Sefton, A. J., Ni, S. Y., Nisbett, G. The morphology, number, distribution and central projections of Class I retinal ganglion cells in albino and hooded rats. Brain Behav Evol. 26 (1), 10-48 (1985).
  8. Williams, R. W., Strom, R. C., Rice, D. S., Goldowitz, D. Genetic and environmental control of variation in retinal ganglion cell number in mice. J Neurosci. 16 (22), 7193-7205 (1996).
  9. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  10. Surgucheva, I., Weisman, A. D., Goldberg, J. L., Shnyra, A., Surguchov, A. Gamma-synuclein as a marker of retinal ganglion cells. Mol Vis. 14, 1540-1548 (2008).
  11. Nadal-Nicolas, F. M., et al. Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3860-3868 (2009).
  12. Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (2), 1052-1058 (2010).
  13. Van Bergen, N. J., et al. Recharacterization of the RGC-5 retinal ganglion cell line. Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (9), 4267-4272 (2009).
  14. Wood, J. P., Chidlow, G., Tran, T., Crowston, J. G., Casson, R. J. A comparison of differentiation protocols for RGC-5 cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (7), 3774-3783 (2010).
  15. Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1 (9), 791-803 (1998).
  16. Hong, S., Iizuka, Y., Kim, C. Y., Seong, G. J. Isolation of primary mouse retinal ganglion cells using immunopanning-magnetic separation. Mol Vis. 18, 2922-2930 (2012).
  17. Julius, R. S. The sensitivity of exponentials and other curves to their parameters. Comput Biomed Res. 5 (5), 473-478 (1972).
  18. Reif, A. E., Allen, J. M. The Akr Thymic Antigen and Its Distribution in Leukemias and Nervous Tissues. J Exp Med. 120, 413-433 (1964).
  19. Watanabe, M., Noguchi, T., Tsukada, Y. Regional, cellular, and subcellular distribution of Thy-1 antigen in rat nervous tissues. Neurochem Res. 6 (5), 507-519 (1981).
  20. Haeryfar, S. M., Hoskin, D. W. Thy-1: more than a mouse pan-T cell marker. J Immunol. 173 (6), 3581-3588 (2004).
  21. Sahagun, G., Moore, S. A., Fabry, Z., Schelper, R. L., Hart, M. N. Purification of murine endothelial cell cultures by flow cytometry using fluorescein-labeled griffonia simplicifolia agglutinin. Am J Pathol. 134 (6), 1227-1232 (1989).
  22. Shoge, K., et al. Rat retinal ganglion cells culture enriched with the magnetic cell sorter. Neurosci Lett. 259 (2), 111-114 (1999).
  23. Chintalapudi, S. R., et al. Isolation and Molecular Profiling of Primary Mouse Retinal Ganglion Cells: Comparison of Phenotypes from Healthy and Glaucomatous Retinas. Front Aging Neurosci. 8, 93(2016).
  24. Nagdeve, N. G., Yaddanapudi, S., Pandav, S. S. The effect of different doses of ketamine on intraocular pressure in anesthetized children. J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 43 (4), 219-223 (2006).
  25. Ding, C., Wang, P., Tian, N. Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model. Exp Eye Res. 92 (6), 512-520 (2011).
  26. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  27. Aerts, J., Nys, J., Arckens, L. A highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening. J Vis Exp. (92), e51936(2014).
  28. Li, X., et al. Loss of AP-2delta reduces retinal ganglion cell numbers and axonal projections to the superior colliculus. Mol Brain. 9 (1), 62(2016).
  29. Moshiri, A., et al. Near complete loss of retinal ganglion cells in the math5/brn3b double knockout elicits severe reductions of other cell types during retinal development. Dev Biol. 316 (2), 214-227 (2008).
  30. Danias, J., et al. Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12), 5151-5162 (2003).
  31. Jakobs, T. C., Ben, Y., Masland, R. H. CD15 immunoreactive amacrine cells in the mouse retina. J Comp Neurol. 465 (3), 361-371 (2003).
  32. Uusitalo, M., Schlotzer-Schrehardt, U., Kivela, T. Ultrastructural localization of the HNK-1 carbohydrate epitope to glial and neuronal cells of the human retina. Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (3), 961-964 (2003).
  33. Jackson, C. J., Garbett, P. K., Nissen, B., Schrieber, L. Binding of human endothelium to Ulex europaeus I-coated Dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium. J Cell Sci. 96 ( Pt 2), 257-262 (1990).
  34. Pennartz, S., Perraut, M., Pfrieger, F. Purification of retinal ganglion cells from postnatal rats by magnetic cell sorting. MACSmore. 12 (2), 16-18 (2010).
  35. Nadal-Nicolas, F. M., et al. Displaced retinal ganglion cells in albino and pigmented rats. Front Neuroanat. 8, 99(2014).
  36. Nadal-Nicolas, F. M., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo-Barriuso, M. Two methods to trace retinal ganglion cells with fluorogold: from the intact optic nerve or by stereotactic injection into the optic tract. Exp Eye Res. 131, 12-19 (2015).
  37. Barnstable, C. J., Drager, U. C. Thy-1 antigen: a ganglion cell specific marker in rodent retina. Neuroscience. 11 (4), 847-855 (1984).
  38. Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus. J Vis Exp. (16), (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Biyom hendislikSay 125retina gangliyon h creleriRGCak sitometrisin rodejenerasyonglokomya lanma

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır