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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Millionen von Menschen leiden an retinalen degenerativen Erkrankungen, die zu irreversibler Blindheit führen. Ein gemeinsames Element vieler dieser Krankheiten ist der Verlust von Netzhautganglienzellen (RGCs). Dieses detaillierte Protokoll beschreibt die Isolierung von primären murinen RGCs durch positive und negative Selektion mit Durchflusszytometrie.

Zusammenfassung

Neurodegenerative Erkrankungen haben oft einen verheerenden Einfluss auf die Betroffenen. Retinale Ganglienzelle (RGC) Verlust ist in einer Reihe von Krankheiten, einschließlich diabetischer Retinopathie und Glaukom, zusätzlich zu normalen Alterung verwickelt. Trotz ihrer Bedeutung waren RGCs bislang äußerst schwierig zu studieren, zum Teil aufgrund der Tatsache, dass sie nur einen kleinen Prozentsatz der Vielzahl von Zellen in der Netzhaut enthalten. Darüber hinaus verwenden aktuelle Isolationsmethoden intrazelluläre Marker, um RGCs zu identifizieren, die nicht lebensfähige Zellen produzieren. Diese Techniken beinhalten auch lange Isolationsprotokolle, so dass es an praktischen, standardisierten und zuverlässigen Methoden fehlt, um RGCs zu erhalten und zu isolieren. Diese Arbeit beschreibt eine effiziente, umfassende und zuverlässige Methode, um primäre RGCs von Mäusen retinae zu isolieren, wobei ein Protokoll auf der Grundlage sowohl positiver als auch negativer Selektionskriterien verwendet wird. Die vorgestellten Methoden erlauben die künftige Untersuchung von RGCs mit dem Ziel, das Gute besser zu verstehenAbnahme der Sehschärfe, die sich aus dem Verlust von funktionellen RGCs bei neurodegenerativen Erkrankungen ergibt.

Einleitung

RGCs sind endständig differenzierte Neuronen, und daher sind Primärzellen zum Experimentieren erforderlich. Die Entwicklung eines Protokolls für die Isolierung und Anreicherung von primären murinen Netzhautganglienzellen (RGCs) ist von grundlegender Bedeutung für die Aufdeckung der Mechanismen der RGC-Gesundheit und Degeneration in vitro . Dies ist besonders wichtig für Studien, die versuchen, potenzielle Therapien zur Förderung der RGC-Funktion zu generieren und ihren Tod zu minimieren. Die Degeneration von RGCs ist mit retinalen degenerativen Erkrankungen wie Glaukom, diabetischer Retinopathie und normaler Alterung assoziiert. Obwohl die spezifischen zellulären Mechanismen, die dem RGC-Verlust zugrunde liegen, unklar sind, wurde eine Reihe von Risikofaktoren identifiziert. Der Mangel an Oxygenierung am Sehnervenkopf 1 , 2 , 3 verursacht den RGC-Tod 4 und wirkt als Störung der Homöostase zwischen der Aktivierung von Erreger und iNhibitorische Rezeptoren innerhalb einzelner RGCs 5 , 6 . Eine Reihe von Herausforderungen behindern den Fortschritt in Richtung der Verwendung dieser Zellen für eingehende Studien. Zuerst ist die Anzahl der RGCs, die in einer murinen Netzhaut vorhanden sind, klein. RGCs machen weniger als 1% der gesamten Netzhautzellen aus 7 , 8 , 9 . Zweitens sind die meisten RGC-spezifischen Marker intrazelluläre Proteine 10 , 11 , 12 . Die Selektion, die auf diesen Markern basiert, lässt die Zellen nicht lebensfähig, was nachgeschaltete Funktionsanalysen ausschließt. Schließlich sind derzeit verfügbare Protokolle langwierig und fehlen Standardisierung 13 , 14 . Die frühen RGC-Isolationsprotokolle basierten auf Immunpanning-Methoden. Barres et al. 15 Adaptiert das klassische immunopAnning-Technik und fügte einen zweiten Schritt, die Monozyten und Endothelzellen aus der Masse der Netzhautzellen vor der positiven Selektion auf der Grundlage der Immunopositivität gegen Anti-Thymozyten-Antigen (aka Thy1), eine Zell-Oberfläche-Marker ausgeschlossen. Jahre später haben Hong et al. Kombinierte magnetische Wulstisolationstechniken mit Zellsortierungsstrategien zur Isolierung von RGCs mit höherer Reinheit 16 . Die Verwendung von magnetischen Perlen wird noch in vielen wissenschaftlichen Anwendungen verwendet. Gemeinsam verbesserten magnetische Perlen und Durchflusszytometrie-Protokolle die Reinheit von isolierten Zellen. Diese Reinigungssysteme wurden jedoch noch nicht für die Isolierung von murinen RGCs aus dissoziierten Retinae standardisiert.

Durchflusszytometrie ist eine leistungsstarke analytische Methode, die die optischen und Fluoreszenzeigenschaften von Zellsuspensionen misst. Die Zellen werden sowohl quantitativ als auch qualitativ mit einem hohen Maß an Empfindlichkeit analysiert und liefern eine mehrdimensionale Analyse der ZellpopulieAtion Die zelluläre Diskriminierung beruht auf zwei wesentlichen physikalischen Eigenschaften: Zellgröße oder Oberfläche und Granularität oder interner Komplexität 17 . Eine mehrdimensionale Analyse kann durch Kombination von Antikörpern durchgeführt werden, die mit Fluorochromen markiert sind, die ähnliche Anregungswellenlängen und unterschiedliche Emissionen aufweisen. Durchflusszytometrie ist schnell, reproduzierbar und empfindlich. Multitup-Laser erlauben noch mehr multidimensionale Analysen einzelner Zellen durch Durchflusszytometrie. So ist es eine attraktive Methodik für die Untersuchung von zytologischen Proben. Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) verwendet die multidimensionalen phänotypischen Unterschiede, die durch die Durchflusszytometrie identifiziert wurden, um einzelne Zellen in verschiedene Subpopulationen zu sortieren.

In den letzten zehn Jahren wurden mehrere Oberflächen- und intrazelluläre Proteine ​​als potentielle Biomarker für die Selektion von Zellen, einschließlich Neuronen, identifiziert. Erste Studien, die RGCs von Ratten zu isolieren suchten Thy1 als Ganglion celL marker Unglücklicherweise hat Thy1, aka CD90, mehrere Isoformen in anderen Nagetierarten 18 , 19 , 20 und wird durch mehrere retinale Zelltypen 19 , 20 exprimiert, was es zu einem unspezifischen Marker für RGCs macht. Ein weiterer Oberflächenmarker, CD48, findet sich bei monozytischen Populationen in der Netzhaut, einschließlich Makrophagen und Mikroglia. Unter Verwendung dieser beiden Oberflächenmarker wurde eine modifizierte RGC-Signatur-Thy1 + und CD48-Neg-Zellen entwickelt, 15 , 16 , 21 , 22 . Leider reichen diese beiden Auswahlkriterien nicht aus, um eine hochangereicherte RGC-Population auszuwählen. Um diesen unerfüllten Bedarf zu bewältigen, wurde ein Durchflusszytometrie-Protokoll entwickelt, das auf mehrschichtigen positiven und negativen Selektionskriterien usi basiertNg bekannte Zelloberflächenmarker zur Anreicherung und Reinigung von primären murinen RGCs.

Protokoll

Alle im folgenden Protokoll aufgeführten Verfahren wurden vom IACUC-Prüfungsausschuss am Institut für Gesundheitswesen der Universität Tennessee (UTHSC) genehmigt und folgten dem Verband für Forschung in der Vision und Ophthalmologie (ARVO) Der Tiere in der Ophthalmic und Vision Research, zusätzlich zu den Richtlinien für Labortierversuche (Institut für Labor-Tierressourcen, Public Health Service-Politik für humane Pflege und Verwendung von Labortieren).

1. Vorbereitung von Instrumenten, Lösungen und Medien

Hinweis: Alle Informationen über Materialien, Reagenzien, Werkzeuge und Instrumente, die im Protokoll angegeben sind, sind in der Tabelle der Materialien angegeben .

  1. Autoklavieren Sie alle Sektionsinstrumente und bewahren Sie sie in einem sterilen Bereich auf. Benutzen Sie die folgenden Instrumente: 4 Standardzangen (2 lange und 2 kurze) und 2 Scheren,Sowie 2 Pinzetten (1 lang und 1 kurz) und 1 Schere für die Sektion; Halten Sie einen zusätzlichen Satz als Backup.
  2. Vorbereitung von 100 ml steriler PBS / 1% FBS-Lösung zur Verwendung während der Wäschen, Immunolabeling-Verfahren und Zellsortierungsschritte. Halten Sie die Lösung bei 4 ° C gekühlt.
    Anmerkung: Füge Natriumazid (NaN 3 ) nicht zu der Lösung hinzu, da es giftig sein kann, Zellen zu leben.
    1. Vorbereiten von 100 ml PBS / 1% FBS mit 99 ml PBS und 1 ml FBS.
  3. 100 ml steriles neurales Zellmedium, ergänzt mit 3% FBS (siehe Tabelle der Materialien ) zur Verwendung als Sammel- und Kulturmedium vorbereiten. Halten Sie das Zellkulturmedium bei 4 ° C steril. Vor dem Gebrauch nur auf Raumtemperatur (RT) aufwärmen.
    1. Vorbereiten von 100 ml des neuralen Zellmediums, ergänzt mit 3% FBS unter Verwendung von 97 ml des neuralen Zellmediums und 3 ml FBS.
  4. Vor-Chill-Sammelröhrchen (15-ml-Röhrchen) vorbeschichtet mit 5 ml Sammelmedium durch Platzierung von tSaum in einem Eimer. Verwenden Sie nur Polypropylenrohre, um zu verhindern, dass die Zellen an der Röhrenoberfläche anhaften.
  5. Platzieren Sie 40-mm-Gerichte, 70-μm-Nylon-Siebe, Spritzen, Pistillen für den Zell-Sieb und sterile Polypropylen-Röhrchen im Biosicherheitsschrank. Sterilisieren Sie alle Gegenstände vor den Verfahren und halten Sie sie in einer sterilen Weise während der Prozeduren.
    Hinweis: Alle Schritte nach der Sammlung der Netzhaut werden im Biosicherheitsschrank durchgeführt.

2. Enukleation

Anmerkung: In diesem Experiment wurden insgesamt 10 junge (5-7 Wochen alte) C57BL / 6J-Mäuse verwendet, um 1,0 x 10 6 RGCs mit dem Phänotyp CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg zu isolieren.

  1. Euthanasiere die Mäuse mit CO 2 -Inhalation, gefolgt von Zervixversetzung. Verwenden Sie immer eine sekundäre Euthanasie-Methode, um sicherzustellen, dass das euthanisierte Tier tot ist.
    Anmerkung: Isofluoran kann als Alternative zu CO 2 verwendet werden . Ketamin wird nicht empfohlen, da es mit einer Erhöhung des Augeninnendrucks (IOP) verbunden ist, wenn er als Induktor der Anästhesie 24 , 25 verwendet wird .
  2. Setzen Sie die Pinzette unter den Globus des Auges, greifen Sie den Sehnerv und ziehen Sie hoch; Der Globus wird entkernt, wobei der Sehnerv intakt ist. Setzen Sie gesammelte Augen in eine Durchstechflasche mit PBS und halten Sie die Durchstechflasche auf Eis bis zum nächsten Schritt.
    Hinweis: Jedes Personal kann diesen Schritt nach Erhalt der entsprechenden Ausbildung von der Labortierpflege (LACU) durchführen.

3. Vorbereitung der Retinalzelle Suspension

  1. Lege das gesammelte Auge auf die Grundplatte eines Sektionsmikroskops, um die Hornhautdissektion zu beginnen. Jedes Auge individuell zerlegen.
  2. Halten Sie den Globus sorgfältig an der Sehnervenbasis mit Pinzette. Für diesen Schritt, verwenden Sie eine lonG und eine kurze Standardzange.
  3. Verwenden Sie eine 30-gauge (30G) scharfe Nadel, um die Hornhaut zu punktieren, damit der wässrige Humor aus dem Auge evakuieren kann, so dass es einfacher ist, das Auge mit der Pinzette zu halten.
  4. Halten Sie die Hornhaut mit der Pinzette und verwenden Sie Schere, um einen kleinen Einschnitt in der Hornhaut zu machen. Die Hornhaut und die Sklera vorsichtig mit der Pinzette schälen. Wenn der Globus auf halbem Weg geschält wird, rolle die Netzhaut und die Linse mit der Pinzette. Die Hornhaut, die Sklera und das Objektiv verwerfen.
    Anmerkung: Diese Methode stellt sicher, dass sich die Netzhaut vollständig vom Rest des Auges löst.
  5. Legen Sie die Netzhaut in eine kleine 40-mm-Petrischale mit PBS / 1% FBS.
    Hinweis: Als Alternative zur Petrischale kann ein Zellkulturteller verwendet werden. Achten Sie darauf, die Retinae immer feucht zu halten, wie in physiologischen Bedingungen.
    1. Waschen Sie jede Retina dreimal mit frisch sterilem PBS / 1% FBS im Biosicherheitsschrank.
  6. Platzieren Sie bis zu 12 Retinae aufEin steriles 70-μm-Nylon-Sieb mit PBS / 1% FBS angefeuchtet. Mit dem Back-End einer 10-ml-Spritze, sanft mazerieren die Retinae mit einer kreisförmigen Bewegung, um die Zellen zu lösen.
    1. Alternativ verwenden Sie eine Stößel für die Zellsieb-Mazeration oder verwenden Sie eine enzymatische Verdauung mit einer Kombination von 15 IE / ml Papain, 5 mM L-Cystein und 200 U / ml DNase I für 15 min bei 37 ° C, gefolgt von Inaktivierung mit PBS / 10% FBS.
      Anmerkung: Es wurden keine Veränderungen des Prozentsatzes der gewonnenen Zellen beobachtet, wenn der enzymatische Verdau mit der Mazeration entweder mit dem Backend der Spritze oder der Pistille verglichen wurde.
  7. Um die isolierten Zellen zu transferieren, legen Sie das sterile 70-μm-Nylon-Sieb über das Polypropylen-Sammelrohr. Führen Sie die gesammelten Zellen durch das Sieb mit einer P1000-Pipette. Spülen Sie das Sieb ( Schritt 3.6 ) mit PBS / 1% FBS, um alle verbleibenden Zellen freizugeben und auf das Sammelröhrchen zu übertragen.
  8. Füge PBS / 1% FBS zu ach hinzuDh ein Endvolumen von 1 ml pro Netzhaut. Die Zellsuspension für 7 min bei 200 xg und RT zentrifugieren.
    Anmerkung: Abhängig von der Anzahl der mazerierten Retinae (<6 retinae) kann das Zellpellet zu klein sein, um sichtbar zu sein.
    1. Den Zellüberstand verwerfen und das Zellpellet in PBS / 1% FBS unter Verwendung eines Verhältnisses von 1 ml pro 5 Retinae resuspendieren.
  9. Zähle die Zellen mit einem Hämocytometer.
    1. Reinigen Sie ein Glas-Hämocytometer und Deckglas mit 70% Alkohol. Die Röhre, die die Zellen enthält, vorsichtig umdrehen, um sicherzustellen, dass die Retina-Zellsuspension gleichmäßig verteilt ist. 20 μl 0,4% Trypanblau in ein Mikrozentrifugenröhrchen geben und mit 20 μl der Zellsuspension vermischen.
    2. Mischen Sie sanft und geben Sie 10 μl der 0,4% Trypan-Blau / Zelle Suspensionsmischung auf das Hämocytometer an und füllen beide Kammern; Kapillar-Aktion wird die 0,4% Trypan blau / Zelle Suspension Mischung unter dem Deckglas zu ziehen. Mit einem Mikroskop zählen alle Trypan-Blau-Negativzellen; ThiS Zahl stellt die lebenden Zellen dar.
    3. Bestimmen Sie die Lebensfähigkeit der Zellen anhand der folgenden Formel: Lebendzellzahl / Gesamtzellzahl =% Lebensfähigkeit.
      Anmerkung: Wenn die Lebensfähigkeit der Zellen weniger als 95% beträgt, ist die Verwendung von Fluoreszenzfarbstoffen für die Lebensfähigkeit der Zelllebensfähigkeit während der FACS erforderlich.
  10. Verwenden Sie eine fluoreszierende Lebensfähigkeit Farbstoff, der nicht-permeant ist, um Zellen zu leben. Waschen Sie die Zellen mit PBS, um jede Spur von Serum zu entfernen. Füge 1 μl Fluoreszenzfarbstoff zur Zelllebensfähigkeitsdiskriminierung pro 5,0 x 10 6 Zellen in einem 100 μl Endvolumen hinzu. 15 Minuten lang bei RT inkubieren, vor Licht geschützt. Füge 10x das Volumen von PBS / 1% FBS hinzu. 5 min bei 200 xg und RT zentrifugieren
  11. Inkubieren Sie die Zellsuspension über Nacht bei 4 ° C, falls nötig. Wenn dies geschieht, füllen Sie die Zelle Suspension Rohr mit neuronalen Zellmedium anstatt PBS / 1% FBS. Legen Sie das Rohr waagerecht und halten Sie es bei 4 ° C.

4. Immunolabelierung der ReTellerzellen

  1. Verwenden Sie die folgende Umwandlung, um das Volumen des Antikörpers pro Zellzahl zu bestimmen: 2 & mgr; l Antikörper pro 5,0 × 10 6 Zellen in einem Volumen von 100 & mgr; l
  2. Waschen Sie die Zellen und pflegen sie in PBS / 1% FBS. Nehmen Sie ein kleines Aliquot von Zellen (5,0 x 10 6 Zellen), um als Negativkontrolle (unmarkiert) zum Zeitpunkt der Sortierung zu verwenden.
    Hinweis: Diese Negativkontrolle ist entscheidend für die korrekte Kalibrierung des Zellsortierers.
  3. Um die unspezifische Bindung von Antikörpern an Zellen, die die Fc & ggr; -Rezeptoren II und III exprimieren, zu minimieren, wird 1 & mgr; l eines Anti-Maus-CD16 / 32-Antikörpers pro 1,0 × 10 6 Zellen in einem 50 & mgr; l Endvolumen unter Verwendung von PBS / FBS 10 min bei RT inkubieren.
  4. Fügen Sie den Antikörper-Cocktail der Probe hinzu und mischen Sie vorsichtig durch Pipettieren. Inkubieren für 30 min in einem Eiskübel. Stellen Sie sicher, dass der Eiskübel abgedeckt ist, da Licht das Experiment durch das Photobleichen des markierten Fluors beeinträchtigen könntePhoren
    1. Bereiten Sie den Antikörper-Cocktail unter Verwendung der folgenden fluoreszenzmarkierten Anti-Maus-Antikörper vor: CD90.2 AF-700, CD48 PE-Cyanine7, CD15 PE und nicht markiertem CD57.
      Hinweis: Für jeden Antikörper verwenden Sie die folgenden Konzentrationen pro 5,0 x 10 6 Zellen: CD90.2 AF700, 1 μg; CD48 PE-Cyanin 7, 0,4 & mgr; g; CD15 PE, 0,02 & mgr; g; Und nicht markiertes CD57, 0,4 μg.
      1. Verwenden Sie Volumina gemäß den folgenden Berechnungen (basierend auf den im Handel erhältlichen Antikörpern, die in der Tabelle der Materialien aufgelistet sind): insgesamt 5,0 x 10 7 zu markierende Zellen; 2 & mgr; l pro 5,0 × 10 6 Zellen = 20 & mgr; l jedes Antikörpers; 4 verschiedene Antikörper = 80 μl Antikörpercocktail; Endvolumen = [(5,0 x 10 7 Gesamtzellen) /5,0 x 10 6 Zellen] x 100 = 1.000 μl; 80 & mgr; l Abs + 50 & mgr; l anti-Maus CD16 / 32 + 870 & mgr; l PBS / 1% FBS = 1000 & mgr; l.
        Hinweis: Diese Kombination lieferte dieOptimale Kombination von Fluorochromen für die Gerätekonfiguration. Die folgenden Parameter fassen die Emission und Anregung: AF-700, Emission von 719 nm bei Anregung mit einem 638-nm-roten Diodenlaser zusammen; PE-Cyanin7, Emission von 767 nm bei Anregung mit einem 488 nm blauen Diodenlaser; Und PE, Emission von 575 nm bei Anregung mit einem 488 nm blauen Diodenlaser.
  5. Nach der 30-minütigen Inkubation, bringen Sie Volumen bis zu 5 ml mit PBS / 1% FBS. Die Proben werden durch Zentrifugieren für 7 min bei 200 xg und RT gereinigt. Wiederholen Sie den Vorgang einmal, um alle ungebundenen Antikörper zu entfernen.
  6. Füge 2 μl sekundären Antikörper (0,1 μg) hinzu, der die CD57 von 5,0 x 10 6 Zellen binden wird. Inkubieren für 30 min in einem Eiskübel, wie in Schritt 4.4 . Waschen Sie die Zellen zweimal, wie in Schritt 4.5 .
    1. Markieren Sie die Zellen mit sekundärem Antikörper, wenn in Schritt 4.4 ein nicht markierter primärer Antikörper verwendet wurde.
      Hinweis: Die zweiteAry-Antikörper der Wahl für diese Konfiguration ist in der Tabelle der Materialien aufgelistet; Es hat eine Emissionswellenlänge von 421 nm. Verwenden Sie es mit einem Bandpassfilter von 450/50 nm, wenn er mit dem violetten Diodenlaser bei 405 nm angeregt wird.
    2. Verwenden Sie Volumina gemäß den folgenden Berechnungen (basierend auf dem im Handel erhältlichen Antikörper, der in der Tabelle der Materialien aufgeführt ist ): 2 & mgr; l pro 5,0 × 10 6 Zellen = 20 & mgr; l Sekundärantikörper; Endvolumen = [(5,0 x 10 7 Gesamtzellen) /5,0 x 10 6 Zellen] x 50 = 500 μl; 20 & mgr; l Abs + 480 & mgr; l PBS / 1% FBS = 500 & mgr; l
  7. Halten Sie die markierten Zellen in PBS / 1% FBS. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämocytometer; Verwenden Sie eine endgültige Retinalzellkonzentration von 3,0 - 4,0 x 10 & sup7; Zellen / ml.
    Anmerkung: Verwenden Sie kein Zellkulturmedium, um die Zellen zu verdünnen, da das Phenolrot die Autofluoreszenz erhöhen kann, wodurch die Auflösung zwischen negat reduziert wirdIve und positive Zellen. Die endgültige Zellkonzentration pro Volumen hängt stark von der Volumenströmung der Gerätekonfiguration ab.
  8. Verwenden Sie einfarbige Kontrollen während des Setups, um Fluoreszenz-Überlauf zu minimieren.
    Hinweis: Dieser Schritt, auch als Kompensation bekannt, wird angewendet, um das durch die Kombination von Fluorophoren erzeugte Rauschen zu korrigieren. Polystyrol-Mikrokugeln in PBS / 0,1% BSA / 2 mM NaN 3 mit der Fähigkeit, fluoreszenzmarkierte Immunglobulin (Ig) -Isotypen aus mehreren Spezies zu binden, liefern positive Kontrollen, um die Kompensation einzustellen.
    1. Legen Sie 3 Tropfen der Polystyrol-Mikrokugeln in sterile FACS-Röhrchen ein, die je einen Fluorophor enthalten. Füge 1 μg des jeweiligen Fluorophors zu jedem Röhrchen hinzu. 15 Minuten bei RT inkubieren, vor Licht geschützt. Füge 3 ml PBS / 1% FBS zu den Probenröhrchen hinzu. 5 min bei 200 xg und RT zentrifugieren Den Überstand vorsichtig entfernen und in 250 μl PBS / 1% FBS resuspendieren.
    2. Um die negativen contr zu setzenOls, verwenden Polystyrol-Mikrosphären, die nicht an Ig binden. Führen Sie diesen Schritt am Tag vor, wenn nötig.

5. Zellsortierungsstrategie

Hinweis: Besondere Hinweise für den Geräteaufbau für FACS mit 355 nm, UV; 405 nm, violett; 488 nm, blau; Und 640 nm, rote Laser mit 2, 2, 5 und 3 Fluoreszenzkanalverteilung. Die Betriebssoftware war DIVA Version 8.0.1. Die Zellsortierung erfolgte mit einer 70 μm Düse, 70 psi Manteldruck, 87,5 Häufigkeit, 48,6 Amplitude mit dem ersten Tropfenabbruch bei 333, Spaltabfall von 6, Sortierpräzision auf Vierwegreinheit mit Default (32) Reinheitsmaske eingestellt und abfallen Verzögerung auf 42,98 mit Perlen eingestellt.

  1. Verwenden Sie 15-ml-Polypropylen-Konusrohre als Sammelgefäße. Füge 5 ml des Sammelmediums (Zellkulturmedium) jedem Schlauch hinzu und drehe das Röhrchen, um die Wände zu beschichten.
    Hinweis: Dieser Schritt verhindert, dass die Zellen an den Seiten von t klebenEr Sammelröhrchen Alternativ kann das Rohr mit unverdünntem FBS beschichtet werden.
  2. Berücksichtigen Sie die Effizienz des Zellsortierers, um die endgültige Ausbeute der Zellen abzuschätzen.
    Hinweis: Die Effizienz der Art variiert je nach verwendetem Durchflusszytometer. RGCs mit dem CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg Phänotyp umfassen etwa 1% aller Netzhautzellen.
  3. Haben die Zellsortierung von einem ausgebildeten Bediener durchgeführt (meist in einer Kernanlage). Stellen Sie sicher, dass das Gerät vor der Probenaufnahme mit 70% Ethanol gereinigt und sterilisiert wird. Wischen Sie die Außenseite der Sammelröhrchen vorsichtig mit 70% Ethanol ab.
  4. Wenn sich die Zellen absetzen oder aggregieren, pipettieren Sie die Zellen nach oben und unten und filtrieren die Suspension durch ein steriles 40-μm-Nylon-Sieb vor der Aufnahme. Achten Sie darauf, die Temperatur zu kontrollieren und halten Sie sie bei 4 ° C, während die Zellsortierung durchgeführt wird. Versagen, dies zu tun, wird das Cel reduzierenL Ausbeute.
  5. Besprechen Sie die Details der Art mit dem Zellsortierer Operator vor der Durchführung der Experimente.
    Hinweis: Zum Zeitpunkt des Experiments wird der Zellsortierer durch eine Reihe von Schaltflächen aus der Workspace-Symbolleiste der Erfassungssoftware für das Zytometer geklickt. Dies sind die Browser , Cytometer , Inspector , Worksheet und Acquisition Dashboard . Die hier verwendete Strategie der Zellsortierung ist als 2-Wege-Sortierung bekannt. Zwei Populationen werden gesammelt: die angereicherten RGCs und alle anderen Zelltypen. Wenn zusätzliche Populationen gesammelt werden sollen, können bis zu zwei weitere Populationen als 4-Wege-Sortierung isoliert werden. Wenn zusätzliche Populationen gesammelt werden, benötigt der Zellsortierer unterschiedliche Sammelröhren und Setup.
  6. Führen Sie eine Kompensation durch, um die Spektralüberlappung von den Fluorophoren zu korrigieren.
    Hinweis: Dieser Vorgang kann manuell durch Anpassung erfolgenJede Einstellung, oder es kann automatisch als Teil der verwendeten Software durchgeführt werden. Die meisten Software für Zellsortiergeräte haben die Möglichkeit einer automatisierten Kompensation. Es gilt als Goldstandard und die genaueste Art der Entschädigung. Die negativen (keine Fluorophor-) Probe und die Einzelkontrollen, die mit Polysteren-Mikrokugeln (Kompensationsperlen) hergestellt wurden, die speziell hergestellt wurden, um alle relevanten monoklonalen Antikörper, die in dem Experiment verwendet werden, zu binden, werden in diesem Schritt verwendet.
    1. Wählen Sie Experiment> Kompensations-Setup> Kompensations-Steuerelemente erstellen . Fügen Sie die fluorophore-spezifischen Steuerelemente aus der Liste hinzu, die auf dem Bildschirm angezeigt wird. Klicken Sie auf OK .
      Hinweis: Eine Kompensationsröhre für jede der Bedienelemente wird angezeigt.
      1. Verwenden Sie eine unmarkierte Kontrolle (kein Fluorophor, Schritt 4.2 ), um das vorwärts gestreute Licht (FSC), das seitlich gestreute Licht (SSC) zu verifizieren und die Anfangspopulation (P1) zu vergeben.
    2. Installieren Sie das Negativ-Steuerrohr auf das Zytometer und klicken Sie auf Laden. Vergewissern Sie sich, dass die Population von Interesse angezeigt wird und wählen Sie sie aus. Dies ist die Population 1 (P1). Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das P1-Tor und wählen Sie Apply to All Compensation Controls . Klicken Sie auf Datensatz aufzeichnen . Sobald die Aufnahme abgeschlossen ist, klicken Sie auf Entladen und entfernen Sie die Tube.
    3. Installiere die nächste Röhre auf das Zytometer, wie auf dem Bildschirm angezeigt. Wiederholen Sie Schritt 5.6.2, bis alle Daten der Bedienelemente aufgezeichnet wurden.
    4. Wählen Sie Experiment> Kompensations-Setup> Kompensation berechnen . Sichern Sie das Setup und benennen Sie das Experiment. Klicken Sie auf Link & Speichern .
      Hinweis: Die Kompensation ist ein notwendiger Schritt, da sie die Spektrumüberlappung zwischen den Detektoren entfernt.
    5. Wenn eine manuelle Kompensation erforderlich ist, tun Sie dies, indem Sie die Mittel der positiven Signale so einstellen, dass sie den Negativen für eac entsprechenH der verwendeten Fluorochrome
      Hinweis: Dieser Schritt wird durch den Zellsortierer durchgeführt und kann 30 Minuten dauern.
  7. Gating-Strategie ( Abbildung 3A ).
    1. Einrichten von P1 durch Plotten von FSC gegen SSC; Der FSC zeigt die Größe an und der SSC zeigt die interne Komplexität der Zellen an. Siehe Abbildung 3A .
    2. Zeichne eine Pseudofarbfläche von SSC-H (Höhe) gegen SSC-W (Breite) unter Verwendung der ausgewählten Population in Schritt 5.7.1 (P1); Die Pseudofarbfläche erlaubt die visuelle Darstellung der Dichte der Zellen relativ zueinander.
      Anmerkung: Eine niedrigere Zelldichte wird durch Blau und Grün dargestellt, während rote und orange Bereiche eine hohe Zelldichte darstellen.
      1. Führen Sie diesen Schritt aus, um einzelne Zellen nur zu sammeln. Das einzelne Zellengatter heißt P2. Siehe Abbildung 3A .
    3. Wiederholen Sie Schritt 5.7.2 zuPlot FSC-H gegen FSC-W mit P2. Stellen Sie sicher, dass die Auswahl einzelner Zellen als "Dubletten" oder Zellklumpen sowohl einen positiven als auch einen negativen Marker enthält und falsche Positivität liefert.
    4. Zeichne ein Pseudofarbfeld von CD90.2 gegenüber CD48. Wählen Sie alle CD90.2 + CD48 Neg-Zellen aus, um Monozyten aus der RGC-Anreicherung zu eliminieren. Nennen Sie dieses Tor CD90.2 + CD48 neg oder P3. Siehe Abbildung 3A .
    5. Unter Verwendung der ausgewählten CD90.2 + CD48 neg Population oder P3 Gate, ziehen Sie eine Pseudofarbfläche von CD57 gegen CD15, um Amacrinzellenverunreinigungen aus der RGC Anreicherung zu eliminieren. Tor der CD15 neg CD57 neg Bevölkerung. Siehe Abbildung 3A .
  8. Definieren Sie die Populationen, die für das Sample im Fenster "Layout sortieren" gesammelt werden sollen, und fahren Sie mit der Zellsortierung fort. Die zu sammelnde Probe ist CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg P>.
    Hinweis: Die zu sortierende Population wird aus dem Dropdown-Menü im Sortierfenster ausgewählt. Nach dem Hinzufügen der Bevölkerung, wird es für Zielereignisse oder wie viele Veranstaltungen gesammelt werden sollen. Zu jeder Zeit kann das Sortierlayout bearbeitet werden, indem man auf das Feld Sort Location mit der Population klickt. 0,9% ± 0,3 RGCs mit dem Phänotyp CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg werden von jungen (5-7 Wochen alt) und 0,5% ± 0,3 und alten (> 12 Monate alten) C57BL / 6J Mäusen 23 erhalten .
  9. Mit 25.000 Zellen eine Reinheitsprüfung durchführen 23 . Siehe Abbildung 3B -E.
    Hinweis: Die Reinheitsprüfung ist der Prozess, um die sortierten Zellen neu zu analysieren, um die Genauigkeit der Zellsorte zu überprüfen. Ein kleines Aliquot von sortierten Zellen wird auf das Zytometer geladen, um die Wirksamkeit der Art zu überprüfen.
_title "> 6. Bestätigung auf RGC Intrazelluläre Marker

  1. Intrazelluläre Kennzeichnung.
    1. Fix sortierte Zellen für 1 h und permeabilisieren bei 4 ° C, um die Zellen metabolisch inaktiv zu machen und das Eindringen von intrazellulären Antikörpern zu ermöglichen.
    2. Verdünnen Sie die folgenden Antikörper in der Permeabilisierungslösung: Anti-RNA-bindendes Protein mit multipler Spleißung (RBPMS) bei einer 1: 100-Verdünnung in einem 100 μg / ml-Stamm; Anti-Synuclein-Gamma (SNCG), 1: 100 in einem 1 mg / ml-Stamm; Hirn-spezifisches Homeobox / POU-Domänen-Protein 3A (BRN3A), 1: 100 in einem 200 μg / ml-Lager; Und anti-neuron-spezifisches Klasse-III-beta-Tubulin (TUJ1), 1: 100 in einem 1 mg / ml-Stamm. Inkubieren Sie die Zellen und Antikörper-Lösungen für 1 h in einem überdachten Eis-Eimer.
    3. Die Proben zweimal mit PBS / 1% FBS waschen.
    4. Resuspendieren der Zellen in dem geeigneten AF488-markierten sekundären Antikörper bei einer 1: 200-Verdünnung für 30 min in einem Eiskübel.
    5. Waschen Sie die Proben wie in Schritt 6.1.3. Halten Sie die Zellen inPBS / 1% FBS (250 μL) bis zur Analyse.

7. Validierung der Zelle Sortieren nach qPCR-Analyse

Hinweis: Siehe Abbildung 4 .

  1. RNA-Extraktion 23
    1. Extrahieren Sie die RNA aus 5,0 x 10 5 sortierten Zellen durch Zelllyse und Homogenisierung, gefolgt von der Zugabe von Chloroform.
    2. Übertragen Sie die obere, farblose Phase auf ein sauberes Mikroröhrchen für Alkoholabscheidung, gefolgt von einer Extraktkonzentration in einer Spinsäule. Führen Sie die DNAse-Verdauung auf der Säule durch.
    3. Waschen Sie die Säule mit RNase-freiem Wasser für die RNA-Elution.
    4. Die RNA-Konzentration durch Spektrophotometrie bewerten.
  2. CDNA-Synthese und Vorverstärkung.
    1. Verwenden Sie 100 ng RNA-Material und mischen Sie mit einer Lösung, die reverse Transkriptase-Enzym, rekombinanten Ribonuclease-Inhibitor (zur Vermeidung von RNA-Abbau), Magnesiumchlorid (MgCL 2 ) und Desoxynukleotiden.
    2. Den Röhrcheninhalt mischen und 10 min bei 25 ° C inkubieren, gefolgt von 60 min bei 42 ° C. Beenden Sie die Reaktion mit einer 5-minütigen Inkubation bei 85 ° C. Die resultierende cDNA bei -20 ° C aufbewahren, bis sie gebrauchsfertig sind.
      Hinweis: cDNA-Material kann bei -20 ° C bis zu einem Monat gelagert werden, wenn der Vorverstärkungsschritt nicht sofort durchgeführt werden kann.
  3. Vorverstärkung von cDNA.
    1. Vorverstärkendes cDNA-Material unter Verwendung einer Reihe von Primern, die für multiple retinale Zelltypen spezifisch sind, einschließlich: Netzhautganglienzellen, Amacrinzellen, Astrozyten, Müller, Bipolar, Horizontale, Photorezeptoren und Retinalpigmentepithelzellen, wie in Referenz 23 und in der Tabelle beschrieben Von Materialien .
      Anmerkung: Die Vorverstärkungsreaktion wird vorbereitet, um die Empfindlichkeit des Nachweises für die Quantifizierung zu erhöhen. Die Vorverstärkungsreaktion enthält eine Mischung des PrimersMischt aus der Tabelle der Materialien ; 2,5 & mgr; l cDNA, die bei 100 ng RNA begann; Reverse Transkriptase-Enzym; Und nukleasefreies Wasser in einem Endvolumen von 10 μl.
    2. Den Enzymaktivierungsschritt bei 95 ° C für 10 min durchführen, gefolgt von 14 Zyklen bei 95 ° C für 15 s, gefolgt von 60 ° C für 4 min. Das vorverstärkte Material 1:10 im Tris-EDTA-Puffer verdünnen und bei -20 ° C bis zum Gebrauch aufbewahren.
  4. 7,4 qPCR-Reaktion.
    1. Bereiten Sie alle qPCR-Reaktionen in einem 10 & mgr; l Endvolumen unter Verwendung der verdünnten, vorverstärkten cDNA (2,5 & mgr; l), der Primer (in der Tabelle der Materialien ), des nukleasefreien Wassers und eines Konzentrats mit DNA-Polymerase und Desoxynukleotiden vor.
    2. Verwenden Sie die folgenden Gerätebedingungen, um das qPCR auszuführen: einen Halteschritt von 50 ° C für 2 min, gefolgt von 95 ° C für 10 min. Führen Sie insgesamt 40 Zyklen bei 95 ° C für 15 s, gefolgt von 60 ° C für 1 min. Führen Sie alle Messungen durchIn replikaten von drei.
    3. Führen Sie eine relative Quantifizierung mit dem Vergleichsschwellenwert (C T ) nach der Bestimmung der Werte von C T für das Haushaltungsgen und die Zielgene in jeder Probe durch. Berechnen Sie die relative Faltungsänderung (R q ) unter Verwendung der folgenden Gleichung: R q = 2 T -ΔC , wobei ΔC T = C T Zielgen - C T Referenzgen 23 ist .
      Anmerkung: Das C T ist definiert als der PCR-Zyklus, bei dem das Fluoreszenzsignal des Reporterfarbstoffs einen willkürlich platzierten Schwellenwert 26 kreuzt. Das C T ist umgekehrt mit der Menge an Amplicon (PCR-Produkt) in der Reaktion verwandt.

Ergebnisse

Die eingehende Untersuchung von RGCs wird durch viele Faktoren behindert, darunter ihre niedrige Häufigkeit und das Fehlen einer robusten und standardisierten Methodik für ihre Isolation. Abbildung 1 zeigt die Methode zur Retinae-Isolierung. Variationen im Enukleationsverfahren existieren auf der Grundlage der Art der Analyse, wie wenn die Enukleation Teil des In-vivo- Experiments ist 27 . Die Enukleation in diesem Pr...

Diskussion

FACS ist die Technik der Wahl, um Zellpopulationen zu reinigen. Andere Isolationsverfahren umfassen Immunopanning, magnetische Perlen und Komplement-Fixationsverarmung. Der Vorteil von FACS gegenüber diesen anderen Methoden beruht auf der gleichzeitigen Identifizierung von Zelloberflächenmarkern mit unterschiedlichem Intensitätsgrad. Die Fluoreszenzintensität des Moleküls ist proportional zur Menge der Proteinexpression. Bisher basierte die Isolierung von RGCs ausschließlich auf Thy1 (CD90) Positivität und CD48 N...

Offenlegungen

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Danksagungen

Die Autoren danken Herrn Tim Higgins, Senior Illustrator von der Abteilung für Mikrobiologie, Immunologie und Biochemie, für technische Video-Unterstützung; Dr. Matthew W. Wilson für Gespräche und die Mitglieder der Laboratorien von Jablonski und Morales-Tirado für ihre hilfreichen Kommentare. Diese Arbeit wurde vom Alcon Research Institute Young Investigator Award (VMM-T), der University of Tennessee Research Foundation (VMM-T), dem National Eye Institute EY021200 (MMJ), dem Gerwin Fellowship (VMM-T), unterstützt. Das Gerwin Pre-Doctoral Fellowship (ZKG), das Department of Defense Army Medical Research und Materiel Command (VMM-T), und die uneingeschränkte Grant von der Forschung, um Blindheit zu verhindern.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-mouse CD15 PEBioLegend125606Clone MC-480
Anti-mouse CD48 PE-Cy7BioLegend103424Clone HM48-1
Anti-mouse CD57Sigma AldrichC6680-100TSTClone VC1.1
Anti-mouse CD90.2 AF700BioLegend105320Clone 30-H12
Brilliant Violet 421 Goat Anti-mouse IgGBioLegend405317Clone Poly4053
Purified Anti-mouse CD16/32BioLegend101302FcgRII/III block, Clone 93
Zombie Aqua BioLegend423102Live cell/ Dead cell discrimination
Fetal Bovine SerumHycloneSH30071.03U.S. origin
AbC Total Antibody Compensation Bead KitThermo Fisher ScientificA10497Multi-species Ig
Neurobasal MediumThermo Fisher Scientific21103049Add serum to media prior to culture.
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific10010049Saline solution
Dissection MicroscopeOlympusSZ-PT ModelStereo Microscope
Sorvall CentrifugeThermo ScientificST 16RAll centrifugation performed  at RT
Base Plate – Dissection PanFisher ScientificSB15233FIMA wax plate can also be used
ForcepsAesculap5002-74 ½ inches
Iris Scissors, StraightAesculap13605 ½ inches
Falcon 15 mL conical tubesFisher Scientific352097Polypropylene tubes
Falcon 50 mL conical tubesFisher Scientific352098Polypropylene tubes
BD FACS TubesFisher Scientific352003Polypropylene tubes
40 mm dishesMidSciTP93040Tissue culture treated
70 μm nylon strainerMidSci70ICSsterile
40 μm nylon strainerMidSci40ICSsterile
 BD 10 mL syringeFisher Scientific301604Disposable Syringe without needle
PestlesMidSciPESTsterile
Wheaton VialsFisher Scientific986734No Liner
BD 30 G needleFisher Scientific3051281 inch
Hausser Scientific Bright-Line Glass Counting ChamberFisher Scientific0267151BHemocytometer
Gibco Trypan blue 0.4% SolutionFisher Scientific15250061Viability Dye
Eppendorf tubesFisher Scientific05-402-251.5mL
EVOS Floid Cell ImagingThermo Fisher Scientific447113Fluorescence Imaging with a 20X objective
100% EthanolFisher Scientific04-355-452Used to make 70% Ethanol
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+Rainin17014282LTS Pipette
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+Rainin17014391LTS Pipette
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+Rainin17014392LTS Pipette
Rack LTS 1000 mL – GPS-L1000SRainin17005088Blue Rack Sterile Tips
Rack LTS 250 mL – GPS-L250SRainin17005092Green Rack Sterile Tips
Rack LTS 20 mL – GPS-L10SRainin17005090Red Rack Sterile Tips
FACSAria II Cell SorterBD BiosciencesN/ACustom order
LSR II CytometerBD BiosciencesN/ACustom order
Abca8aThermo Fisher ScientificMm00462440_m1Müller cells
Aldh1alThermo Fisher ScientificMm00657317_m1Müller cells
Aqp4Thermo Fisher ScientificMm00802131_m1Astrocytes
Calb2Thermo Fisher ScientificMm00801461_m1Amacrine, Horizontal
Cd68Thermo Fisher ScientificMm03047340_m1Retinal Pigment Epithelial Cells
Gad2Thermo Fisher ScientificMm00484623_m1Amacrine
HprtThermo Fisher ScientificMm01545399_m1House keeping gene
Lhx1Thermo Fisher ScientificMm01297482_m1Horizontal
Lim2Thermo Fisher ScientificMm00624623_m1Horizontal
NrlThermo Fisher ScientificMm00476550_m1Photoreceptors
Ntrk1Thermo Fisher ScientificMm01219406_m1Horizontal
Pcp4Thermo Fisher ScientificMm00500973_m1Bipolar, Amacrine
Pou4f1Thermo Fisher ScientificMm02343791_m1Retinal Ganglion Cells
Prdx6Thermo Fisher ScientificMm00725435_s1Astrocytes
PrkcaThermo Fisher ScientificMm00440858_m1Bipolar
Prox1Thermo Fisher ScientificMm00435969_m1Horizontal
PvalbThermo Fisher ScientificMm00443100_m1Amacrine
RbpmsThermo Fisher ScientificMm02343791_m1Retinal Ganglion Cells
Rom1Thermo Fisher ScientificMm00436364_g1Photoreceptors
Rpe65Thermo Fisher ScientificMm00504133_m1Retinal Pigment Epithelial cells
Slc1a3Thermo Fisher ScientificMm00600697_m1Astrocytes
Slc6a9Thermo Fisher ScientificMm00433662_m1Amacrine
SncgThermo Fisher ScientificMm00488345_m1Retinal Ganglion Cells
Tubb3Thermo Fisher ScientificMm00727586_s1Retinal Ganglion Cells
VimThermo Fisher ScientificMm01333430_m1Müller cells
Taqman Universal Master MixThermo Fisher Scientific4440047qPCR Reagent
miRNeasy Mini KitQiagen217004RNA Isolation
SuperScript VILO cDNA Synthesis KitThermo Fisher Scientific11754250cDNA synthesis
Taqman PreAmp Master MixThermo Fisher Scientific4391128Pre-Amplification step
BD Cytofix/ CytopermBD Biosciences554714Fixation/ Permeabilization Buffer
BD Perm/ WashBD Biosciences554723Permeabilization Solution
RBPMSSanta Cruz Biotechnologysc-86815intracellular antibody
SNCGGene TexGTX110483intracellular antibody
BRN3ASanta Cruz Biotechnologysc-8429intracellular antibody
TUJ1BioLegend801202intracellular antibody

Referenzen

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