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Resumo

Milhões de pessoas sofrem de doenças degenerativas da retina que resultam em cegueira irreversível. Um elemento comum de muitas dessas doenças é a perda de células ganglionares da retina (RGCs). Este protocolo detalhado descreve o isolamento de RGC murinos primários por seleção positiva e negativa com citometria de fluxo.

Resumo

As doenças neurodegenerativas muitas vezes têm um impacto devastador sobre os afetados. A perda de células ganglionares retinianas (RGC) está implicada em uma série de doenças, incluindo retinopatia diabética e glaucoma, além do envelhecimento normal. Apesar da sua importância, os RGCs têm sido extremamente difíceis de estudar até agora devido em parte ao fato de que eles compreendem apenas uma pequena porcentagem da grande variedade de células na retina. Além disso, os métodos de isolamento atuais usam marcadores intracelulares para identificar RGCs, que produzem células não viáveis. Essas técnicas também envolvem longos protocolos de isolamento, portanto, há uma falta de métodos práticos, padronizados e confiáveis ​​para obter e isolar RGCs. Este trabalho descreve um método eficiente, abrangente e confiável para isolar RGC primários de retinae de camundongos usando um protocolo baseado em critérios de seleção positivos e negativos. Os métodos apresentados permitem o estudo futuro de RGCs, com o objetivo de melhor compreender o maiorDeclínio na acuidade visual que resulta da perda de RGCs funcionais em doenças neurodegenerativas.

Introdução

Os RGCs são neurônios terminalmente diferenciados e, portanto, células primárias são necessárias para a experimentação. O desenvolvimento de um protocolo para isolamento e enriquecimento de células de gânglios retinianos murinos primários (RGCs) é fundamental para revelar os mecanismos de saúde e degeneração de RGC in vitro . Isto é especialmente importante para estudos que buscam gerar terapias potenciais para promover a função RGC e para minimizar sua morte. A degeneração de RGCs está associada a doenças degenerativas da retina, como glaucoma, retinopatia diabética e envelhecimento normal. Embora os mecanismos celulares específicos subjacentes à perda de RGC não estejam claros, uma série de fatores de risco foram identificados. A falta de oxigenação na cabeça do nervo óptico 1 , 2 , 3 causa a morte RGC 4 e atua como o distúrbio da homeostase entre a ativação de excitatório e iReceptores nibitórios dentro de RGCs individuais 5 , 6 . Uma série de desafios impede o progresso no sentido do uso dessas células para estudos aprofundados. Primeiro, o número de RGCs presentes em uma retina murina é pequeno. Os RGCs representam menos de 1% das células da retina 7 , 8 , 9 . Em segundo lugar, a maioria dos marcadores específicos de RGC são proteínas intracelulares 10 , 11 , 12 . A seleção com base nesses marcadores deixa as células não viáveis, o que impede análises funcionais a jusante. Finalmente, os protocolos atualmente disponíveis são longos e falta padronização 13 , 14 . Os protocolos de isolamento RGC precoce basearam-se em métodos de imunoparingologia. Barres et al. 15 Adaptou o immunop clássicoE acrescentou um segundo passo, que excluiu os monócitos e as células endoteliais da maior parte das células da retina antes da seleção positiva com base na imunopositividade ao antígeno anti-timócito (também conhecido como Thy1), um marcador de superfície celular. Anos mais tarde, Hong et al. Técnicas combinadas de isolamento de grânulos magnéticos com estratégias de triagem celular para isolar RGC com maior pureza 16 . O uso de pérolas magnéticas ainda é usado em muitas aplicações científicas. Juntos, os grânulos magnéticos e os protocolos de citometria de fluxo melhoraram a pureza das células isoladas. No entanto, estes sistemas de purificação ainda não foram padronizados para o isolamento de RGC murinos a partir de retina dissociada.

A citometria de fluxo é um poderoso método analítico que mede as características ópticas e fluorescentes das suspensões celulares. As células são analisadas quantitativa e qualitativamente com um alto nível de sensibilidade, fornecendo uma análise multidimensional da população celularAtion. A discriminação celular baseia-se em duas propriedades físicas principais: tamanho da célula ou área de superfície e granularidade ou complexidade interna 17 . Uma análise multidimensional pode ser realizada combinando anticorpos marcados com fluorocromos que possuem comprimentos de onda de excitação semelhantes e diferentes emissões. A citometria de fluxo é rápida, reproduzível e sensível. Os laseras Multitpe permitem análises multidimensionais ainda maiores de células individuais por citometria de fluxo. Assim, é uma metodologia atraente para o estudo de espécimes citológicos. A classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) usa as diferenças fenotípicas multidimensionais identificadas pela citometria de fluxo para classificar células individuais em subpopulações distintas.

Na última década, múltiplas proteínas superficiais e intracelulares foram identificadas como biomarcadores potenciais para a seleção de células, incluindo neurônios. Estudos iniciais que procuraram isolar RGCs de ratos usaram Thy1 como um ganglion celL marcador. Infelizmente, Thy1, também conhecido como CD90, tem múltiplas isoformas em outras espécies de roedores 18 , 19 , 20 e é expresso por vários tipos de células da retina 19 , 20 , tornando-se um marcador não específico para RGCs. Outro marcador de superfície, CD48, é encontrado em populações monocíticas na retina, incluindo macrófagos e microglia. Usando estes dois marcadores de superfície, uma assinatura RGC modificada - células Thy1 + e CD48 neg - foi desenvolvida 15 , 16 , 21 , 22 . Infelizmente, esses dois critérios de seleção não são suficientes para selecionar uma população RGC altamente enriquecida. Para resolver esta necessidade não atendida, foi desenvolvido um protocolo de citometria de fluxo 23 com base em critérios de seleção positiva e negativa de várias camadas usiNg conhecidos marcadores de superfície celular para enriquecer e purificar RGCs murinos primários.

Protocolo

Todos os procedimentos detalhados no seguinte protocolo foram aprovados pelo conselho de avaliação institucional do Comité de Consumo e Uso Animal (IACUC) do Centro de Ciências da Saúde da Universidade do Tennessee (UTHSC) e seguiram a Associação para Pesquisa em Visão e Oftalmologia (ARVO) Declarações para o Uso De Pesquisa de Animais em Oftálmica e Visão, além das diretrizes para experimentos em laboratório de animais (Instituto de Recursos de Laboratório de Animais, Política de Serviço de Saúde Pública sobre Cuidados Humanos e Uso de Animais de Laboratório).

1. Preparação de instrumentos, soluções e mídia

Nota: Todas as informações sobre materiais, reagentes, ferramentas e instrumentos relatados no protocolo estão especificadas na Tabela de Materiais .

  1. Autoclave todos os instrumentos de dissecação e armazená-los em uma área estéril. Use os seguintes instrumentos: 4 pinças padrão (2 longas e 2 curtas) e 2 tesouras,Bem como 2 fórceps (1 longo e 1 curto) e 1 tesoura para a dissecação; Mantenha um conjunto extra como um backup.
  2. Prepare 100 mL de solução de PBS estéril / 1% FBS para usar durante lavagens, procedimentos de imunomarcação e etapas de triagem celular. Mantenha a solução arrefecida a 4 ° C.
    Nota: Não adicione azida de sódio (NaN 3 ) à solução, pois pode ser tóxico para células vivas.
    1. Prepare 100 mL de PBS / FBS a 1% com 99 mL de PBS e 1 mL de FBS.
  3. Prepare 100 mL de meio de célula neural estéril suplementado com 3% de FBS (veja a Tabela de Materiais ) para uso como coleta e meio de cultura. Mantenha o meio de cultura celular estéril a 4 ° C. Apenas aqueça a temperatura ambiente (RT) antes de usar.
    1. Prepare 100 mL de meio celular neural suplementado com FBS a 3% utilizando 97 mL de meio celular neural e 3 mL de FBS.
  4. Tubos de coleta pré-chill (tubos de 15 mL) pré-revestidos com 5 mL de meio de colheita colocando tBainha de gelo em um balde de gelo. Use apenas tubos de polipropileno para evitar que as células aderem à superfície do tubo.
  5. Coloque pratos de 40 mm, filtros de nylon de 70 μm, seringas, pilões para o filtro de células e tubos de polipropileno estéril no gabinete de biossegurança. Esterilize todos os itens antes dos procedimentos e mantenha-os de forma estéril ao longo dos procedimentos.
    Nota: Todas as etapas após a coleta da retina serão realizadas no gabinete de biossegurança.

2. Enucleação

Nota: Um número total de 10 ratos jovens (5-7 semanas de idade) C57BL / 6J foram utilizados nesta experiência para isolar 1,0 x 10 6 RGCs com o fenótipo CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg .

  1. Eutanizar os ratos usando inalação de CO 2 seguido de deslocamento cervical. Use sempre um método secundário de eutanásia para garantir que o animal eutanizado esteja morto.
    Nota: O isofluorano pode ser usado como alternativa ao CO 2 . A ketamina não é recomendada, uma vez que está associada a um aumento da pressão intra-ocular (PIO) quando utilizado como indutor de anestesia 24 , 25 .
  2. Insira fórceps sob o globo do olho, aperte o nervo óptico e puxe-o; O globo será enucleado, com o nervo óptico intacto. Coloque os olhos coletados em um frasco contendo PBS e mantenha o frasco em gelo até o próximo passo.
    Nota: Qualquer pessoal pode realizar este passo depois de receber o treinamento apropriado da Unidade de Cuidados de Animais de Laboratório (LACU).

3. Preparação da Suspensão da Célula Retinal

  1. Coloque o olho recolhido na placa base de um microscópio de dissecação para iniciar a dissecção da córnea. Dissecte cada olho individualmente.
  2. Mantenha cuidadosamente o globo na base do nervo óptico usando fórceps. Para este passo, use um lonG, e uma pinça padrão curta.
  3. Use uma agulha afiada de calibre 30 (30G) para perfurar a córnea para permitir que o humor aquoso evacue dos olhos, facilitando a retenção do olho com a pinça.
  4. Segure a córnea com a pinça e use uma tesoura para fazer uma pequena incisão na córnea. Retire gentilmente a córnea e a esclerótica usando a pinça. Quando o globo é descascado a meio caminho, role a retina e a lente usando a pinça. Descarte a córnea, a esclerótica e as lentes.
    Nota: Este método garante que a retina se separe completamente do restante do olho.
  5. Coloque a retina em uma pequena placa de Petri de 40 mm contendo PBS / FBS a 1%.
    Nota: Como alternativa à placa de Petri, um prato de cultura celular pode ser usado. Certifique-se de manter sempre o retinae úmido, como em condições fisiológicas.
    1. Lave cada retina três vezes com PBS estéril fresco / 1% FBS dentro do gabinete de biossegurança.
  6. Coloque até 12 retina emUm filtro de nylon esterilizado de 70 μm umedecido com PBS / FBS a 1%. Usando o back-end de uma seringa de 10 mL, macerar gentilmente a retina usando um movimento circular para separar as células.
    1. Alternativamente, use um pilão para a maceração do filtro celular ou use digestão enzimática com uma combinação de 15 UI / mL de papaína, 5 mM de L-cisteína e 200 U / mL de DNase I durante 15 minutos a 37 ° C, seguida de inativação com PBS / 10% FBS.
      Nota: Não foram observadas alterações na porcentagem de células recuperadas quando a digestão enzimática foi comparada à maceração com o back-end da seringa ou o pilão.
  7. Para transferir as células isoladas, coloque o filtro de nylon estéril de 70 μm sobre o tubo de recolha de polipropileno. Passe as células coletadas através do filtro usando uma pipeta P1000. Enxaguar o filtro ( passo 3.6 ) com PBS / 1% FBS para libertar as células restantes e transferi-las para o tubo de recolha.
  8. Adicionar PBS / 1% FBS a achUm volume final de 1 mL por retina. Centrifugar a suspensão celular durante 7 min a 200 xg e RT.
    Nota: Dependendo do número de retina macerada (<6 retinae), o sedimento celular pode ser muito pequeno para ser visível.
    1. Descarte o sobrenadante celular e ressuspenda o sedimento celular em PBS / FBS a 1% usando uma proporção de 1 mL por 5 retina.
  9. Contar as células usando um hemocitómetro.
    1. Limpe um hemocitômetro de vidro e lamínula com 70% de álcool. Gire suavemente o tubo contendo as células para garantir que a suspensão de células da retina seja distribuída uniformemente. Coloque 20 μL de 0,4% de azul de tripano em um tubo de microcentrífuga e misture com 20 μL da suspensão celular.
    2. Misture suavemente e aplique 10 μL da mistura de 0,4% de azul de tripa / célula no hemocitómetro, enchendo ambas as câmaras; A ação capilar atrairá a mistura de suspensão de azul / célula tripanal de 0,4% sob o lamínula. Usando um microscópio, conta com todas as células negativas do trypan; ThiO número s representa as células vivas.
    3. Determine a viabilidade celular usando a seguinte fórmula: contagem de células vivas / contagem total de células =% de viabilidade.
      Nota: Se a viabilidade das células é inferior a 95%, o uso de corante fluorescente para discriminação de viabilidade celular é requerido durante FACS.
  10. Use um corante de viabilidade fluorescente que não seja permeável às células vivas. Lave as células com PBS para remover qualquer vestígio de soro. Adicione 1 μL de corante fluorescente para discriminação de viabilidade celular por 5,0 x 10 6 células em um volume final de 100 μL. Incubar à TA por 15 min, protegido da luz. Adicione 10x o volume de PBS / 1% FBS. Centrifugar por 5 min a 200 xg e RT.
  11. Incubar a suspensão celular durante a noite a 4 ° C, se necessário. Se isso for feito, encha o tubo de suspensão celular com o meio celular neural em vez de PBS / FBS a 1%. Coloque o tubo horizontalmente e mantenha-o a 4 ° C.

4. Immunomarcando o ReCélulas tinal

  1. Use a seguinte conversão para determinar o volume de anticorpo por número celular: 2 μL de anticorpo por 5,0 x 10 6 células em um volume de 100 μL.
  2. Lavar as células e mantê-las em PBS / FBS a 1%. Pegue uma pequena alíquota de células (5,0 x 10 6 células) para usar como controle negativo (não marcado) no momento da configuração do tipo.
    Nota: Este controle negativo é crítico para a calibração adequada do classificador de células.
  3. Para minimizar a ligação não específica de anticorpos a células que expressam os receptores Fcγ II e III, adicionar 1 μL de um anticorpo anti-rato CD16 / 32 por 1,0 x 10 6 células num volume final de 50 μL utilizando PBS / 1% FBS. Incubar durante 10 min à TA.
  4. Adicione o coquetel de anticorpos à amostra e misture suavemente por pipetagem. Incube durante 30 min numa balde de gelo. Certifique-se de que o balde de gelo esteja coberto, pois a luz pode comprometer o experimento devido ao fotobloco do fluoro marcadoPhores.
    1. Prepare o coquetel de anticorpos usando os seguintes anticorpos anti-mouse marcados com fluorescência: CD90.2 AF-700, CD48 PE-Cyanine7, CD15 PE e CD57 não marcado.
      Nota: Para cada anticorpo, use as seguintes concentrações por 5,0 x 10 6 células: CD90.2 AF700, 1 μg; CD48 PE-Cyanine7, 0,4 μg; CD15 PE, 0,02 μg; E CD57 não marcado, 0,4 μg.
      1. Use volumes de acordo com os seguintes cálculos (com base nos anticorpos comercialmente disponíveis listados na Tabela de Materiais ): total de 5,0 x 10 7 células a serem rotuladas; 2 μL por 5,0 x 10 6 células = 20 μL de cada anticorpo; 4 anticorpos diferentes = 80 μL de coquetel de anticorpos; Volume final = [(5,0 x 10 7 células totais) /5,0 x 10 6 células] x 100 = 1000 μL; 80 μL de Abs + 50 μL de CD16 anti-rato / 32 + 870 μL de PBS / FBS a 1% = 1000 μL.
        Nota: Esta combinação forneceu oCombinação ideal de fluorocromos para a configuração do instrumento. Os seguintes parâmetros resumem a emissão e a excitação: AF-700, emissão de 719 nm quando excitada com um laser de diodo vermelho de 638 nm; PE-Cyanine7, emissão de 767 nm quando excitada com um laser de diodo azul de 488 nm; E PE, emissão de 575 nm quando excitada com um laser de diodo azul de 488 nm.
  5. Após a incubação de 30 minutos, leve volume até 5 mL usando PBS / FBS a 1%. Lave as amostras centrifugando-as durante 7 min a 200 xg e RT. Repita o procedimento uma vez para remover todos os anticorpos não ligados.
  6. Adicionar 2 μL de anticorpo secundário (0,1 μg), que irá ligar a CD57 de 5,0 x 10 6 células. Incube durante 30 min num balde de gelo, como no passo 4.4 . Lave as células duas vezes, como no passo 4.5 .
    1. Rotular as células com anticorpo secundário se um anticorpo primário não marcado fosse usado no passo 4.4 .
      Nota: o segundoO anticorpo de escolha para esta configuração está listado na Tabela de Materiais ; Tem um comprimento de onda de emissão de 421 nm. Use-o com um filtro passa-banda de 450/50 nm quando excitado com o laser de diodo violeta a 405 nm.
    2. Use volumes conforme os seguintes cálculos (com base no anticorpo comercialmente disponível listado na Tabela de Materiais ): 2 μL por 5,0 x 10 6 células = 20 μL de anticorpo secundário; Volume final = [(5,0 x 10 7 células totais) /5,0 x 10 6 células] x 50 = 500 μL; 20 μL de Abs + 480 μL de PBS / 1% FBS = 500 μL.
  7. Mantenha as células rotuladas em PBS / FBS a 1%. Contar as células usando um hemocitómetro; Use uma concentração final de células da retina de 3,0 - 4,0 x 10 7 células / mL.
    Nota: Não use meio de cultura de células para diluir as células porque o vermelho de fenol pode aumentar a autofluorescência, reduzindo assim a resolução entre negativosCélulas positivas e positivas. A concentração celular final por volume depende muito do caudal volumétrico da configuração do instrumento.
  8. Use controles de uma única cor durante a configuração para minimizar o vazamento de fluorescência.
    Nota: Esta etapa, também conhecida como compensação, é aplicada para corrigir o ruído criado pela combinação de fluoróforos. As microesferas de poliestireno em PBS / 0,1% de BSA / NaN3 2 mM com a capacidade de se ligar a isotipos de imunoglobulina (Ig) com marcação fluorescente de múltiplas espécies fornecem controles positivos para estabelecer a compensação.
    1. Coloque 3 gotas de microesferas de poliestireno em tubos estéril FACS, distribuindo um por fluoróforo. Adicione 1 μg do respectivo fluoróforo a cada tubo. Incubar durante 15 minutos à RT, protegido da luz. Adicione 3 mL de PBS / 1% de FBS aos tubos de amostra. Centrifugar por 5 min a 200 xg e RT. Retire cuidadosamente o sobrenadante e ressuspenda em 250 μL de PBS / FBS a 1%.
    2. Para configurar o controle negativoOls, use microesferas de poliestireno que não se ligam a Ig. Execute este passo no dia anterior, se necessário.

5. Estratégia de classificação de células

Nota: Instruções específicas para a configuração do instrumento para FACS com 355 nm, UV; 405 nm, violeta; 488 nm, azul; E 640 nm, lasers vermelhos com distribuição de canal de fluorescência 2, 2, 5 e 3, respectivamente. O software operacional foi DIVA versão 8.0.1. A classificação das células foi realizada com um bocal de 70 μm, pressão de bainha de 70 psi, freqüência de 87,5, amplitude de 48,6 com queda de primeira queda em 333, vazamento de 6, classificação de precisão ajustada para a pureza de quatro vias com máscara de pureza padrão (32) e queda Atraso ajustado para 42,98 usando esferas.

  1. Utilize tubos cônicos de polipropileno de 15 mL como vasos coletores. Adicione 5 mL do meio de colheita (meio de cultura de células) a cada tubo e gire o tubo para revestir as paredes.
    Nota: Esta etapa impede que as células se encaixem nos lados de tEle coletou o tubo. Como alternativa, o tubo pode ser revestido com FBS não diluído.
  2. Tome em consideração a eficiência do classificador celular para estimar o rendimento final das células.
    Nota: A eficiência do tipo varia com base no citómetro de fluxo usado. Os RGCs com CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg fenótipo compreendem cerca de 1% de todas as células da retina.
  3. A classificação celular é realizada por um operador treinado (geralmente em uma instalação básica). Certifique-se de que o instrumento seja limpo e esterilizado com etanol a 70% antes da aquisição da amostra. Limpe cuidadosamente o exterior dos tubos de recolha com 70% de etanol também.
  4. Se as células se estabeleceram ou agregaram, pipetar as células para cima e para baixo e filtrar a suspensão através de um filtro de nylon esterilizado de 40 μm antes da aquisição. Certifique-se de controlar a temperatura e mantê-la a 4 ° C enquanto a classificação celular está sendo realizada; A falta de fazê-lo reduzirá o celEu cedo.
  5. Discuta os detalhes do tipo com o operador de classificador de células antes de realizar as experiências.
    Nota: No momento da experiência, o operador do classificador de células clicou em uma série de botões da barra de ferramentas do espaço de trabalho do software de aquisição para o citómetro. Estes são o navegador , o citometro , o inspetor , a planilha e o painel de compras . A estratégia de classificação de células usada aqui é conhecida como um tipo de 2 vias. São coletadas duas populações: as RGC enriquecidas e todos os outros tipos de células. Se forem coletadas populações adicionais, podem ser isoladas até duas populações adicionais como um tipo de 4 vias. Se forem coletadas populações adicionais, o classificador de células requer diferentes tubos de coleta e configuração.
  6. Execute uma compensação para corrigir a sobreposição espectral dos fluoróforos.
    Nota: Este processo pode ser feito manualmente por ajusteCada configuração, ou pode ser feito automaticamente como parte do software em uso. A maioria dos programas para equipamentos de classificação de células tem a opção de uma compensação automática. É considerado o padrão-ouro e o tipo mais preciso de compensação. A amostra negativa (sem fluoróforo) e os controles individuais preparados com microesferas de poliestereno (grânulos de compensação) especificamente fabricados para ligar todos os anticorpos monoclonais relevantes utilizados na experiência serão utilizados nesta etapa.
    1. Selecione Experiência> Configuração de compensação> Criar controles de compensação . Adicione os controles específicos do fluoróforo da lista exibida na tela. Clique em OK .
      Nota: Um tubo de compensação para cada um dos controles será exibido.
      1. Use um controle não marcado (sem fluoróforo, passo 4.2 ) para verificar a luz dispersa para a frente (FSC), a luz paralela (SSC) e para a porta inicial da população (P1).
    2. Instale o tubo de controle negativo no citómetro e clique em Carregar. Verifique se a população de interesse é exibida e selecione-a. Esta é a população 1 (P1). Clique com o botão direito do mouse no portão P1 e selecione Aplicar em Todos os Controles de Compensação . Clique em Registrar dados . Quando terminar a gravação, clique em Descarregar e remova o tubo.
    3. Instale o próximo tubo no citómetro, conforme mostrado na tela. Repita a etapa 5.6.2 até que todos os dados dos controles tenham sido gravados.
    4. Selecione Experiência> Configuração de Compensação> Calcular Compensação . Salve a configuração e nomeie a experiência. Clique em Link e Salvar .
      Nota: Compensação é um passo necessário, pois remove a sobreposição do espectro entre os detectores.
    5. Se for necessária uma compensação manual, faça isso ajustando os meios dos sinais positivos para que eles sejam iguais aos negativos para o eacH dos fluorocromos utilizados.
      Nota: Este passo é feito pela operação do classificador de células e pode demorar 30 min.
  7. Estratégia Gating ( Figura 3A ).
    1. Configure P1 ao traçar FSC versus SSC; O FSC é indicativo do tamanho e o SSC indica a complexidade interna das células. Veja a Figura 3A .
    2. Desenhe um gráfico pseudocolor de SSC-H (altura) versus SSC-W (largura) usando a população selecionada no passo 5.7.1 (P1); O gráfico pseudocolor permite a representação visual da densidade de células em relação um ao outro.
      Nota: uma menor densidade celular é representada por azul e verde, enquanto as áreas vermelha e laranja representam alta densidade celular.
      1. Execute este passo para colecionar células únicas apenas; O portão de célula única é chamado de P2. Veja a Figura 3A .
    3. Repita o passo 5.7.2 paraTrama FSC-H versus FSC-W usando P2. Certifique-se de que a seleção de células únicas como "dupletos" ou aglomerados de células contém um marcador positivo e negativo, proporcionando falsas positividade.
    4. Desenhe um gráfico pseudocolor de CD90.2 versus CD48. Selecione todas as células negativas CD90.2 + CD48 para eliminar monócitos do enriquecimento RGC; Chame este portão CD90.2 + CD48 neg , ou P3. Veja a Figura 3A .
    5. Usando a população negativa CD90.2 + CD48 selecionada ou o portão P3, desenhe um gráfico pseudocolor de CD57 versus CD15 para eliminar contaminantes de células amacrinas do enriquecimento de RGC. Porta a população CD15 neg CD57 neg . Veja a Figura 3A .
  8. Defina as populações a serem coletadas para a amostra na janela "Ordenar Layout" e continue com a classificação celular; A amostra a recolher é CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg P>.
    Nota: A população a ser ordenada é selecionada no menu suspenso de Adicionar na janela de classificação. Depois de adicionar a população, ele irá solicitar eventos alvo ou quantos eventos serão coletados. A qualquer momento, o layout de classificação pode ser editado clicando no campo Classificar Localização que contém a população. 0,9% ± 0,3 de RGCs com o fenótipo CD90.2 + CD48 neg CD15 neg CD57 neg são obtidos de ratinhos C57BL / 6J jovens (5-7 semanas de idade) e 0,5% ± 0,3 e idosos (> 12 meses de idade) 23 .
  9. Usando 25 mil células, execute uma verificação de pureza 23 . Veja a Figura 3B -E.
    Nota: A verificação de pureza é o processo para reanalisar as células ordenadas para verificar a precisão do tipo de célula. Uma pequena alíquota de células ordenadas será carregada no citómetro para verificar a eficácia do tipo.
_title "> 6. Confirmação em marcadores intracelulares RGC

  1. Rotulagem intracelular.
    1. Corrigir as células ordenadas por 1 h e permeabilizar a 4 ° C para tornar as células metabolicamente inativas e permitir a penetração de anticorpos intracelulares.
    2. Diluir os seguintes anticorpos na solução de permeabilização: proteína de ligação anti-ARN com splicing múltiplo (RBPMS) a uma diluição de 1: 100 em um estoque de 100 μg / mL; Gama de anti-sinucleína (SNCG), 1: 100 em um estoque de 1 mg / mL; Proteína de domínio homeobox / POU específico do cérebro 3A (BRN3A), 1: 100 em um estoque de 200 μg / mL; E tubulina beta de classe III específica para o neurônio (TUJ1), 1: 100 em um estoque de 1 mg / mL. Incube as células e soluções de anticorpos durante 1 h em uma cubeta de gelo coberta.
    3. Lavar as amostras duas vezes com PBS / FBS a 1%.
    4. Ressuspender as células no anticorpo secundário marcado AF488 apropriado a uma diluição de 1: 200 durante 30 min em uma balde de gelo.
    5. Lavar as amostras como no passo 6.1.3. Mantenha as células emPBS / 1% de FBS (250 μL) até estar pronto para analisar.

7. Validação da classificação de células por análise de qPCR

Nota: veja a Figura 4 .

  1. Extração de RNA 23 .
    1. Extrair o ARN de 5,0 x 10 5 células classificadas por lise celular e homogeneização seguida pela adição de clorofórmio.
    2. Transfira a fase superior e incolor para um microtube limpo para precipitação de álcool seguido de concentração de extrato em uma coluna de rotação. Execute a digestão DNAse na coluna.
    3. Lave a coluna com água livre de RNase para eluição de ARN.
    4. Avalie a concentração de ARN por espectrofotometria.
  2. Síntese de cDNA e pré-amplificação.
    1. Use 100 ng de material de ARN e misture com uma solução contendo enzima de transcriptase reversa, inibidor de ribonuclease recombinante (para evitar a degradação de ARN), cloreto de magnésio (MgCL 2 ), e desoxinucleótidos.
    2. Misturar o conteúdo do tubo e incubar durante 10 min a 25 ° C seguido de 60 min a 42 ° C. Conclua a reação com uma incubação de 5 min a 85 ° C. Armazene o cDNA resultante a -20 ° C até estar pronto para usar.
      Nota: o material de cDNA pode ser armazenado a -20 ° C por até um mês se o passo de pré-amplificação não puder ser realizado imediatamente.
  3. Pré-amplificação do cDNA.
    1. Preamplificar o material de cDNA usando uma série de iniciadores específicos para múltiplos tipos de células da retina, incluindo células de gânglios retinianos, células amacrinas, astrócitos, Müller, bipolar, horizontal, fotorreceptores e células epiteliais de pigmento da retina, conforme detalhado na Referência 23 e na Tabela De Materiais .
      Nota: A reação de pré-amplificação está preparada para aumentar a sensibilidade da detecção para quantificação. A reação de pré-amplificação contém uma mistura do iniciadorMisturas da tabela de materiais ; 2,5 μL de cDNA, que começou a 100 ng de RNA; Enzima transcriptase reversa; E água livre de nuclease em um volume final de 10 μL.
    2. Execute o passo de ativação da enzima a 95 ° C durante 10 minutos, seguido de 14 ciclos a 95 ° C durante 15 s, seguido por 60 ° C durante 4 min. Diluir o material pré-amplificado 1:10 no tampão Tris EDTA e mantê-lo a -20 ° C até estar pronto para uso.
  4. 7,4 qPCR reação.
    1. Prepare todas as reações de qPCR em um volume final de 10 μL utilizando o cDNA diluído, pré-amplificado (2,5 μL), iniciadores (listados na Tabela de Materiais ), água livre de nuclease e um concentrado com DNA polimerase e desoxinucleótidos.
    2. Use as seguintes condições de instrumento para executar o qPCR: um passo de espera de 50 ° C durante 2 minutos, seguido de 95 ° C por 10 min. Execute um total de 40 ciclos a 95 ° C durante 15 s seguido por 60 ° C durante 1 min. Execute todas as medidasEm repetições de três.
    3. Execute quantificação relativa usando o limite comparativo (C T ) após determinar os valores de C T para o gene de limpeza e os genes alvo em cada amostra. Calcule a mudança de dobra relativa (R q ) usando a seguinte equação: R q = 2 T -ΔC , onde ΔC T = C T gene alvo - gene de referência C T 23 .
      Nota: O C T é definido como o ciclo de PCR no qual o sinal fluorescente do tinteiro repórter cruza um limite 26 colocado arbitrariamente. O C T é inversamente relacionado à quantidade de amplicão (produto de PCR) na reação.

Resultados

O estudo aprofundado de RGCs é impedido por muitos fatores, incluindo sua baixa freqüência e a falta de uma metodologia robusta e padronizada para seu isolamento. A Figura 1 mostra a metodologia utilizada para isolamento de retina. As variações no procedimento de enucleação existem com base no tipo de análise, como se a enucleação faz parte da experimentação in vivo 27 . A enucleação neste protocolo é rea...

Discussão

FACS é a técnica de escolha para purificar populações celulares. Outros métodos de isolamento incluem imunopanning, esferas magnéticas e depleção de fixação do complemento. A vantagem do FACS sobre essas outras metodologias baseia-se na identificação simultânea de marcadores de superfície celular com diferentes graus de intensidade. A intensidade fluorescente da molécula é proporcional à quantidade de expressão da proteína. Até agora, o isolamento de RGCs baseava-se unicamente na positividade Thy1 (C...

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Os autores agradecem ao Sr. Tim Higgins, Ilustrador Sénior do Departamento de Microbiologia, Imunologia e Bioquímica, para assistência técnica em vídeo; Dr. Matthew W. Wilson para discussões e os membros dos laboratórios Jablonski e Morales-Tirado por seus comentários úteis. Este trabalho foi apoiado pelo Alcon Research Institute Young Investigator Award (VMM-T), a Fundação de Pesquisa da Universidade do Tennessee (VMM-T), o National Eye Institute EY021200 (MMJ), o Gerwin Fellowship (VMM-T); A Gerwin Pre-doctoral Fellowship (ZKG), o Departamento de Defesa Army Medical Research and Materiel Command (VMM-T), e a concessão irrestrita da pesquisa para prevenir a cegueira.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Anti-mouse CD15 PEBioLegend125606Clone MC-480
Anti-mouse CD48 PE-Cy7BioLegend103424Clone HM48-1
Anti-mouse CD57Sigma AldrichC6680-100TSTClone VC1.1
Anti-mouse CD90.2 AF700BioLegend105320Clone 30-H12
Brilliant Violet 421 Goat Anti-mouse IgGBioLegend405317Clone Poly4053
Purified Anti-mouse CD16/32BioLegend101302FcgRII/III block, Clone 93
Zombie Aqua BioLegend423102Live cell/ Dead cell discrimination
Fetal Bovine SerumHycloneSH30071.03U.S. origin
AbC Total Antibody Compensation Bead KitThermo Fisher ScientificA10497Multi-species Ig
Neurobasal MediumThermo Fisher Scientific21103049Add serum to media prior to culture.
Phosphate-Buffered Saline (PBS)Thermo Fisher Scientific10010049Saline solution
Dissection MicroscopeOlympusSZ-PT ModelStereo Microscope
Sorvall CentrifugeThermo ScientificST 16RAll centrifugation performed  at RT
Base Plate – Dissection PanFisher ScientificSB15233FIMA wax plate can also be used
ForcepsAesculap5002-74 ½ inches
Iris Scissors, StraightAesculap13605 ½ inches
Falcon 15 mL conical tubesFisher Scientific352097Polypropylene tubes
Falcon 50 mL conical tubesFisher Scientific352098Polypropylene tubes
BD FACS TubesFisher Scientific352003Polypropylene tubes
40 mm dishesMidSciTP93040Tissue culture treated
70 μm nylon strainerMidSci70ICSsterile
40 μm nylon strainerMidSci40ICSsterile
 BD 10 mL syringeFisher Scientific301604Disposable Syringe without needle
PestlesMidSciPESTsterile
Wheaton VialsFisher Scientific986734No Liner
BD 30 G needleFisher Scientific3051281 inch
Hausser Scientific Bright-Line Glass Counting ChamberFisher Scientific0267151BHemocytometer
Gibco Trypan blue 0.4% SolutionFisher Scientific15250061Viability Dye
Eppendorf tubesFisher Scientific05-402-251.5mL
EVOS Floid Cell ImagingThermo Fisher Scientific447113Fluorescence Imaging with a 20X objective
100% EthanolFisher Scientific04-355-452Used to make 70% Ethanol
Pipet-Lite LTS Pipette L-1000XLS+Rainin17014282LTS Pipette
Pipet-Lite LTS Pipette L-200XLS+Rainin17014391LTS Pipette
Pipet-Lite LTS Pipette L-20XLS+Rainin17014392LTS Pipette
Rack LTS 1000 mL – GPS-L1000SRainin17005088Blue Rack Sterile Tips
Rack LTS 250 mL – GPS-L250SRainin17005092Green Rack Sterile Tips
Rack LTS 20 mL – GPS-L10SRainin17005090Red Rack Sterile Tips
FACSAria II Cell SorterBD BiosciencesN/ACustom order
LSR II CytometerBD BiosciencesN/ACustom order
Abca8aThermo Fisher ScientificMm00462440_m1Müller cells
Aldh1alThermo Fisher ScientificMm00657317_m1Müller cells
Aqp4Thermo Fisher ScientificMm00802131_m1Astrocytes
Calb2Thermo Fisher ScientificMm00801461_m1Amacrine, Horizontal
Cd68Thermo Fisher ScientificMm03047340_m1Retinal Pigment Epithelial Cells
Gad2Thermo Fisher ScientificMm00484623_m1Amacrine
HprtThermo Fisher ScientificMm01545399_m1House keeping gene
Lhx1Thermo Fisher ScientificMm01297482_m1Horizontal
Lim2Thermo Fisher ScientificMm00624623_m1Horizontal
NrlThermo Fisher ScientificMm00476550_m1Photoreceptors
Ntrk1Thermo Fisher ScientificMm01219406_m1Horizontal
Pcp4Thermo Fisher ScientificMm00500973_m1Bipolar, Amacrine
Pou4f1Thermo Fisher ScientificMm02343791_m1Retinal Ganglion Cells
Prdx6Thermo Fisher ScientificMm00725435_s1Astrocytes
PrkcaThermo Fisher ScientificMm00440858_m1Bipolar
Prox1Thermo Fisher ScientificMm00435969_m1Horizontal
PvalbThermo Fisher ScientificMm00443100_m1Amacrine
RbpmsThermo Fisher ScientificMm02343791_m1Retinal Ganglion Cells
Rom1Thermo Fisher ScientificMm00436364_g1Photoreceptors
Rpe65Thermo Fisher ScientificMm00504133_m1Retinal Pigment Epithelial cells
Slc1a3Thermo Fisher ScientificMm00600697_m1Astrocytes
Slc6a9Thermo Fisher ScientificMm00433662_m1Amacrine
SncgThermo Fisher ScientificMm00488345_m1Retinal Ganglion Cells
Tubb3Thermo Fisher ScientificMm00727586_s1Retinal Ganglion Cells
VimThermo Fisher ScientificMm01333430_m1Müller cells
Taqman Universal Master MixThermo Fisher Scientific4440047qPCR Reagent
miRNeasy Mini KitQiagen217004RNA Isolation
SuperScript VILO cDNA Synthesis KitThermo Fisher Scientific11754250cDNA synthesis
Taqman PreAmp Master MixThermo Fisher Scientific4391128Pre-Amplification step
BD Cytofix/ CytopermBD Biosciences554714Fixation/ Permeabilization Buffer
BD Perm/ WashBD Biosciences554723Permeabilization Solution
RBPMSSanta Cruz Biotechnologysc-86815intracellular antibody
SNCGGene TexGTX110483intracellular antibody
BRN3ASanta Cruz Biotechnologysc-8429intracellular antibody
TUJ1BioLegend801202intracellular antibody

Referências

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