JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Microirradiation לייזר הוא כלי שימושי עבור מחקרים של תיקון ה-DNA בתאים חיים. בגישה מתודולוגי לשימוש של לייזרים UVA לזירוז נגעים דנ א שונים מוצג. לנו יש אופטימיזציה שיטה microirradiation המקומי המתחזק מחזור תא נורמלי; לפיכך, תאים לקרינה להמשיך לעבור מיטוזה.

Abstract

Microirradiation המקומי עם לייזרים מייצג כלי שימושי עבור מחקרים של ה-DNA תיקון-תהליכים הקשורים בתאים חיים. כאן, אנו מתארים בגישה מתודולוגיים ניתוח קינטיקה חלבון ב- DNA נגעים על אינטראקציות חלבון-חלבון או על מקומי microirradiated כרומטין. אנו גם מראים כיצד לזהות שלבים נפרדים של מחזור התא באמצעות מערכת סלולרית Fucci ללמוד קינטיקה תא מחזור-תלוית חלבון ב- DNA נגעים. תיאור מתודולוגי של השימוש של שני UV לייזרים (355 nm ו 405 ננומטר) לזירוז סוגים שונים של נזק לדנ א גם מוצג. רק התאים microirradiated על ידי 405 ננומטר דיודת לייזר המשיך דרך מיטוזה בדרך כלל, היו ללא הדימרים פירימידין cyclobutane (CPDs). אנו גם מראים כיצד ניתן לתקן תאים microirradiated בנקודת זמן נתון כדי לבצע immunodetection של החלבונים אנדוגני של עניין. ללימודים תיקון ה-DNA, נתאר בנוסף השימוש בשיטות biophysical כולל FRAP (קרינה פלואורסצנטית התאוששות לאחר Photobleaching) ו- FLIM (קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה במיקרוסקופ) תאים עם המתרחשים באופן ספונטני DNA נזק מוקדים. אנו גם מראים יישום של FLIM-קשת/קשתית (קרינה פלואורסצנטית תהודה אנרגיה העברה) במחקרים ניסיוני של אינטראקציות חלבון-חלבון.

Introduction

נזק לדנ א מוביל המראה של ה-DNA נגעים המורכב cyclobutane הדימרים פירימידין (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine, יחיד-strand או כפול-strand שובר1,2. Γ-קרני בצורת קרינה מייננת עם האנרגיה הגבוהה ביותר, penetrance גבוהה, וכך זה מקור קרינה נעשה שימוש נרחב הקרנות3. מצד שני, המושרה בניסוי נזקי DNA UV לייזרים מחקה טבעי בחשיפה לאור אולטרא סגול. אובה microirradiation, כשיטה מיקרוסקופיים, מייצג כלי ניסיוני עבור הלומדים נזק לדנ א בתאים חיים בודדים. Microirradiation שימש לראשונה, לפני 40 שנה על מנת לחשוף את הארגון של כרומוזום אזורים4,5. טכניקה זו תלויה מאוד גם את המאפיינים הפונקציונליים של מיקרוסקופ קונפוקלי או את מגבלות טכניות של nanoscopy מודרני. לזירוז DNA נגעים, תאים יכול להיות presensitized על ידי 5' bromodeoxyuridine (BrdU) או Hoechst 33342 לפני הקרנת UV. . Bártová et al. 6 שתואר קודם לכן השלב presensitization, לאחרונה אנו ממוטב טכניקה זו microirradiation כדי למנוע מוות של תאים, או אפופטוזיס. לדוגמה, השימוש של UV 405 ננומטר לייזר (ללא Hoechst 33342 presensitization) מוביל תנאי הגיוס של 53BP1-חיובית כפולה-strand מעברי (DSBs) על חשבון הדימרים פירימידין cyclobutane (CPDs). מצד שני, צעדים presensitization בשילוב עם UV microirradiation לגרום רמות גבוהות מאוד של CPDs ו- DSBs בו זמנית7,8. מתודולוגיה זו קשה להחיל על המחקר של נתיב יחיד של תיקון דנ א.

עם microirradiation, זה אפשרי לנתח חלבון גיוס, קינטיקה, ואינטראקציה -נגעים DNA בתאים חיים. דוגמה של שיטה זו פורסם ע י Luijsterburg. et al. 9 1β חלבון הטרוכרומטין, ואנחנו לאחרונה הראה לראשונה כי הגורם pluripotency Oct4, חלבון הקשורים עם גופים Cajal, coilin, גייסו ל UV-induced DNA נגעים6,10. קינטיקה חלבון-נגעים DNA ניתן גם יהיה ללמוד באמצעות FRAP (קרינה פלואורסצנטית התאוששות לאחר Photobleaching)11,12,13 או דאגה טכניקות (קרינה פלואורסצנטית תהודה אנרגיה העברה)14 ,15. שיטות אלה יש פוטנציאל לחשיפת דיפוזיה פשוטה של חלבונים DNA נגעים או אינטראקציות חלבון חלבון. כלי שימושי עבור אפיון נוסף של חלבונים הוא FLIM (קרינה פלואורסצנטית שלמים הדמיה במיקרוסקופ) או השילוב שלו עם סריג טכנולוגיה (סריג-FLIM)16. שיטות אלה מאפשרות חקר תהליכים בחיי תאים stably או transiently לבטא את החלבון עניין שתייגת על ידי מולקולה פלורסנט17. כאן מוצגת דוגמה של דעיכה מעריכית הזמן (τ) חלבון p53 מתויג GFP והשותף שלה אינטראקציה, מתויג mCherry 53BP1, משחק תפקיד חשוב ב- DNA נזק תגובה18,19 . Τ פרמטר, משך fluorochrome שסופקו על-ידי חישובים FLIM, הוא ספציפי צבע נתון פלורסצנטיות, יכולותיו איגוד של הסביבה התאית. לכן, בשיטה זו יכול להראות לנו הבחנות בין חלבון subpopulations, יכולותיהם איגוד ומאפיינים הפונקציונלית שלהם לאחר, לדוגמה, נזק לדנ א.

. הנה, חלוקה לרמות גישות מתודולוגיים של טכניקות מתקדמות מיקרוסקופ המשמש במעבדה שלנו ללמוד חלבון וספציפיות בזמן הגיוס, קינטיקה, דיפוזיה, אינטראקציות חלבון-חלבון באתר של כרומטין microirradiated מוצג. המתודולוגיה צעד אחר צעד את תנאי הגיוס של נגעים מקומיים DNA בתאים חיים, תיאור של מתודולוגיות שימושי עבור מחקרים של ה-DNA נזק-אירועים הקשורים ב המושרה מקומית נגעים DNA הנגרם על ידי לייזרים UV הינם מסופקים.

Protocol

1. טיפוח של שורות תאים

  1. שורות תאים הלה, נגזר
    הערה: שימוש הלה צוואר הרחם קרצינומה של תאים: גם תאים הלה stably לבטא היסטון ויזת עבודה H2B מתויג עם תאי ה-GFP או הלה-Fucci לבטא RFP-Cdt1 G1 ואת שלבי המוקדמות S ו GFP-geminin בשלבים S/G2-M ( איור 1).
    1. לטיפוח-תרגול של כל שורות תאים נגזר הלה, להשתמש Dulbecco ' s ששינה הנשר ' s בינוני (DMEM) בתוספת 10% סרום שור עוברי ואנטיביוטיקה המתאים ב 37 מעלות צלזיוס באווירה humidified, המכילה 5% CO 2. להחליף את המדיום 2 - 3 פעמים בשבוע.
    2. הסר בינוני תרבות, ולשטוף את התאים באמצעות 1 x PBS כדי לחסל את כל העקבות של סרום המכיל מעכבי טריפסין. לבצע שלב זה בשכונה הביולוגי בטמפרטורת החדר.
    3. להוסיף 1 מ"ל של פתרון טריפסין-EDTA prewarmed כדי לכסות את שכבת תאים, ולהשאיר את התאים ב- 37 מעלות צלזיוס Trypsinize תאים עד מפוזרת שכבת תאים (בדרך כלל 3-5 דקות).
    4. להוסיף 3 מ"ל של מדיום הגידול מלאה prewarmed כדי להשבית טריפסין-EDTA, ומעוררים את המדיום על ידי בעדינות pipetting מספר פעמים.
      הערה: הליך זה חייב להתבצע בשכונה חומרים מסוכנים כדי להגן על המפעיל מפני מזהמים וכדי לשמור על תנאים טיפוח אופטימלית תא.
    5. ספירת תאים באמצעות מונה תא אוטומטית או Bürker קאמרית. לדלל תא ההשעיה 1 × 10 5 תאים למ"ל ו pipet מ לתוך תבשיל חדש. דגירה תאים-CO של 37 ° C ו- 5%-2-
  2. טיפוח של תאי גזע עובריים בעכבר (mESCs), קו בתא D3
    1. התרבות mESCs בנייד תרבות מנות מצופה 0.2% הג'לטין ואת mESC תחזוקה בינוני. דגירה תאים-CO של 37 ° C ו- 5%-2-
      הערה: הכנת המדיום טיפוח/אחזקה mESCs ב aliquots 50 מ ל ואחסונו ב 2-8 ° C עד 2 שבועות מומלץ. המדיום mESC מכיל 75 מ"ל FBS תא ES, 5 מ ל פניצילין G סטרפטומיצין, 5 מ ל חומצות אמינו שאינן הכרחיות (10 מ מ) (הריכוז הסופי 0.1 מ מ), 50 µL העכבר גורם מעכב לוקמיה (mLIF; µg 100/mL) (הריכוז הסופי 10 ng/mL), µL 430 (1-mtg ב Thioglycerol; מטריים דילול ב- DMEM) (ריכוז סופי 100 מיקרומטר), גלוקוז גבוהות DMEM בינוני עד 500 מ"ל.
    2. תשאף המדיום טיפוח mESC מתוך קערה תרבות ולשטוף את התאים פעם אחת עם PBS 1 x.
    3. להוסיף 0.5 mL טריפסין-EDTA, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס רק עד התאים נתחיל לנתק מתוך קערה. לאחר מכן, בטל את טריפסין ע י שטיפת התאים עם 2 מ של mESC טיפוח בינוני בתוספת 15% סרום שור עוברית.
    4. להשתמש פיפטה כדי לסלק את התאים הנותרים מתוך קערה תרבות.
      הערה: חשוב להשיג תאים בודדים, כי גושים תא לקדם התמיינות של התאים.
    5. פיצול תאים 1:10 על מנות gelatinized mESC תחזוקה בינונית.
      הערה: אם הצפיפות של תאים mESC הוא נמוך מדי, הם לא גדלים היטב; אם הצפיפות גבוהה מדי, בידול הוא קידם.
    6. ודא כי mESCs נשמרות במצב בלתי מובחן על-ידי ביצוע המעבר mESC כל יום השני על-ידי פיצול תאים פטרי אחד לתוך ארבע מנות חדשות. בדוק את המושבות mESC עם מיקרוסקופ הפוכה תחת 100 X או 200 X הגדלה ולבצע, אם יש עדות mES ספונטנית תאית התמיינות, שהכלים המערבי כדי להעריך את דלדול חלבון Oct4.
      הערה: עם אופטימלית תא passaging, הבידול ספונטנית של mESCs במבחנה ניתן להפחית.

2. תאים תקנים

  1. זרע תאים 48 שעות לפני ניסויים על מנות מיקרוסקופ gridded (קוטר 35 מ מ) כדי למצוא תאים microirradiated לפי נקודות הציון שלהם הפטרי.
    הערה: זוהי דוגמה ש-microirradiation אשר הוא בשלב ניסיוני הראשון, והוא immunostaining השני ( איור 2 א).
    1. עבור זריעה, השתמש ריכוז של 5 × 10 4 תאים למ"ל עבור שורות תאים נגזר הלה (או 1 × 10 4 תאים למ"ל עבור תאים mES D3). השתמש לבינונית מלאה 2 מ"ל לכל תבשיל. במהלך הטיפוח-תרגול microirradiation, לשמור על תאים בתוך תא טרמוסטט או טיפוח-CO של 37 ° C ו- 5%-2-
    2. ספירת תאים באמצעות מונה הניתן אוטומטי תא.
      הערה: אין להשתמש ריכוז גבוה יותר של תאים. במיוחד במקרה של מושבות בצפיפות של D3 mESCs, צפיפות גבוהה תא מונע זיהוי התאים microirradiated מקומית לאחר immunostaining.
  2. להכין פלסמיד DNA ו תרביות תאים ריאגנט של בחירה כמפורט להלן. להכין פתרון A באמצעות 2-3 µg של הנבחרת פלסמיד ה-DNA (ראה את הטבלה של חומרים לפרטים) ו- 150 µL 1 x ל- PBS. להכין פתרון B שימוש ריאגנט תרביות תאים µL 3.5 ב- PBS 1 × µL 150. להבטיח כי כל פתרון טוב מעורב על ידי זהיר pipetting.
    הערה: היחס האופטימלי של ריאגנט DNA ו תרביות תאים מדעית להיקבע עבור כל שורת התאים וכל פלסמיד בודדים.
  3. ב 24 h לפני הייזנרייך החיים transiently transfected תאים, לשלב פתרון A פתרון B ללא vortexing. דגירה פתרונות משולבים בטמפרטורת החדר למשך 15-20 דקות. באופן dropwise, homogeneously לפזר זה להשלים את התערובת תרביות תאים (300 µL, כנקודת שמתואר 2.2) על השכבה תא גדל לתוך המנה מיקרוסקופ.
  4. תאים Incubate על 37 ° C ו- 5% CO 2 עבור 4-6 שעות, לאחר מכן להחליף את התערובת תרביות תאים בינונית טרייה. לטפח את התאים בתנאים סטנדרטיים.
    הערה: בעת שימוש בלייזר 405 ננומטר, לא presensitize את התאים עם כל ריאגנט, אך בעת שימוש בלייזר 355-nm, לבצע תא presensitization עם 10 מיקרומטר 5-ברומו-2 ' uridine (BrdU) - deoxy - 7 , 8 . Presensitization הזמן תלוי בסוג התא ואת אורך מחזור התא. עבור תאים הלה, להוסיף BrdU 16-20 h לפני microirradiation מקומיים. במקרה של mESCs, להוסיף 6 עד 8 שעות לפני microirradiation BrdU.

3. אינדוקציה של Lesions דנ א המקומי, מיקרוסקופיה קונפוקלית

  1. למקם את המנה על הבמה מיקרוסקופ ולהקליט את המיקום של התאים שנבחרו על המנה; הקואורדינטות התא יהיה נחוץ לצורך ניתוח נוסף ( איור 2A -ג).
  2. למצוא transfected תא (ים) בכיכר המסומנת מספר או אות ( איור 2 א d-f, חצים לספירה הצג מיקומו של התא מוגדל פאנלים Ae ו Af). להשיג תמונה של תא (ים) באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר ולרכוש תמונת זריחה על מנת לזהות את המיקום של תא (ים) והן הכיכר שכותרתו ( איור 2 א).
  3. עבור רכישת התמונה לפני הקרנה, להשתמש בלייזר לבן-אור (יקלו) (470-670 ננומטר בדרגות 1-nm) מחובר מיקרוסקופ קונפוקלי (או לייזר זמין אחר מחובר שהתלוננתימיקרוסקופ ocal).
  4. השתמש בהגדרות הבאות: 512 × 512 פיקסלים ברזולוציה, פיקסל בגודל 64 ננומטר, 400 הרץ, מצב דו-כיווני (סריקה בשני כיוונים), קו סט הממוצע 8, זום 8 x 12 x.
    הערה: קו ממוצע מייצג מספר נתון של סריקות; באותו הקו נסרק מספר פעמים לפני שתמשיך לשורה הבאה. חזר על סריקות של כל הקווים לייצר את המסגרת הסופית של התמונה.
  5. עבור התמונה תצפית ורכישה, השתמש מטרה שמן 63 × עם הפתח המספרי של 1.4 ולרכוש ברצף תמונות זריחה. לחסל צולבות לדבר בין fluorochromes שני באמצעות מצב סריקה רציפה של התוכנה המתאימה.
    הערה: כל למיקרוסקופ התוכנות מאפשרת את ההגדרה של מצב סריקה רציפים כביכול. המפעיל יכול לבחור האם לרכוש את fluorochromes ' מידע בו זמנית (למשל, באדום-ירוק-כחול זריחה) או, כפי שהוזכר כאן, בנפרד (ברצף), fluorochrome על ידי fluorochrome. לקחת בחשבון את המידע הכללי כי עירור/הפליטה המרבי עבור GFP הוא 395/509 nm ו עירור/הפליטה המרבי עבור mCherry הוא 587/610 nm (ראה fluorochromes המשמשים כאן איור 2B). על סמך מידע זה, בחר המתאימים עירור ומסננים פליטה עבור fluorochromes הרצוי. ניתן למטב את הליכי בחירת מסנן וסריקה עבור כל מיקרוסקופ קונפוקלי.
  6. עבור אינדוקציה של DNA נגעים, שימוש 64 קו במצב, סריקה לכבות את המערכת תסיר (ב ' רכישת ' מצב), לעבור על המקור UV חיצוני (על " UV לייזר " כפתור), הגדרת האזור של הריבית (ROI) (ב ' רכישת ' מצב), ולהגדיר את 355-nm לייזר לשלטון 100% או, לחילופין, להשתמש במקור 405 ננומטר לייזר.
    הערה: בדרך כלל, עוצמת הלייזר מותאם על-ידי לחצן ההתאמה לייזר מתאים במצב רכישת התמונה.
  7. לשימוש microirradiation מקומיים, לייזרים הפולטות בספקטרום UVA ליד. Microirradiation של רועי בגרעין ולקבלת תמונת לכידת, להגדיר את הרקע אפס במצב רכישת התמונה כדי לווסת את עוצמת הלייזר מחוץ רועי; אם התא הוא מוקרן כראוי, האות של ויזת עבודה H2B GFP-היסטון ייעלמו, לדוגמה, מתויג mCherry חלבון PCNA להיות מגויס DNA נגעים מיד לאחר הקרנה ( איור 2B ו Video 1 ).
    הערה: פגיעה DNA המושרה ברועי של אחד סעיף קונאפוקלית מוצג גם הקרנה תלת מימדי (3D) (ראה סיבוב תלת-ממד ו- x-y, x-z, y-z תחזיות איור 2C ו- 2 וידאו). לקבלת תיאורים של הפרמטרים הטכניים מלאה עבור לייזרים 355-nm ו 405 ננומטר, ראה Stixová. et al. 7
  8. לאחר רועי היה מוקרן, לכבות את המקור החיצוני UV, לכבות את רועי, הפעילי את המערכת תסיר, לשנות קו סריקה ל- 8 וכן למצוא תא אחר עבור הקרנה. לבחירה רועי, השתמש בלחצן ישים בתוכנה ' s תמונה רכישה מצב.
    הערה: mCherry-PCNA יש הצטברות המרבי לשיא נגעים DNA בין 2 ל- 20 דקות ( איור 2B). כדי לוודא את התוצאה על רמות החלבון אקסוגני, להמשיך עם immunofluorescence מכתים מיד לאחר microirradiation מקומיים. בחר את מרווח הזמן הקרנה על פי עניין.
    9. ודא כי ניתן להבחין הצטברות של חלבונים אקסוגני ברוב המכריע של תאים microirradiated
  9. . אימות זה, להשתמש בקריטריונים בשלבים הבאים.
    1. סימון שיש אין ביטוי אקסוגני החלבון בתאים transiently transfected. פתרון אפשרי, לבחור תאים עם רק ביטוי חלש של חלבון פלואורסצנטי (למשל, mCherry-PCNA או mCherry-53BP1).
    2. להעריך את phototoxicity של חשיפת יקלו המשמש עבור ייבוא תמונות.
      הערה: phototoxicity בדיקה, לחשוף transfected לתאים microirradiation לייזר ממושך, ודא כי התאים להמשיך מיטוזה כפי שמוצג איור 3 א -B. כפתרון אפשרי, להפחית את מספר הפרוסות קונאפוקלית בכל תא וזמן סריקה, מיטוב סריקה תלת-ממד על-ידי בחירה של האופטימלית צירית צעד (0.3 מיקרומטר מומלץ) ולקבוע את הלייזר ' s כוח לכל הפחות שלה. לחלופין, phototoxicity ניתן לסלק באמצעות Trolox (חומצה 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic, אנלוגי מסיסים במים של ויטמין E) מומס המדיום הטיפוח-תרגול. לניסויים DNA נזק-קשורים, לא מומלץ להשתמש של Trolox בשל השפעתו הגנה מפני קרינת UV.
    3. במקרה של הקרנה עם לייזר 355-nm, ודא מספיק תיאגוד BrdU באמצעות נוגדן המתאים של זיהוי BrdU של שיתוף BrdU קיט (ראה טבלה של חומרים). מאחר BrdU הוא שולב DNA במהלך שלב S של מחזור התא, הרוב המכריע של תאים עלינו להמשיך באמצעות S-השלב במהלך presensitization. כפתרון אפשרי, שקול את אורך מחזור התא, אשר הוא סוג התא הספציפי.
    4. ניתוח אם ה-DNA לתקן חלבונים עניין יש את היכולת לזהות נגעים DNA במחזור התא ספציפית phase(s). פתרון אפשרי: כדי לוודא כי גיוס של חלבונים שנבחר ל DNA נגעים מוגבל שלבי מחזור התא הספציפי (G1 S G2), השתמש הלה-Fucci תאים. תאים אלה אקספרס RFP-Cdt1 ב- G1 ואת שלבי המוקדמות S ו מתויג GFP geminin S/G2-M מחזור התא שלבים 22 ( איור 1).
    5. כדי למנוע אפופטוזיס, מוות של תאים, בחר מקור לייזר מתאים, לייזר כוח הגדרה 23. זכור כי מוקרן תאים צריך להמשיך מיטוזה ( איור 3 א -B, וידאו 3).
      הערה: אפופטוזיס לא רצויים ניתן להבחין באמצעות הגישה החיובית Annexin V, קספאז 3 או המחשוף B מירה אוחנה. ברמה המורפולוגית, תא ניתוק, היווצרות של גופים מוות יהיה גלוי.

4. Immunofluorescence Staining

  1. לשטוף את שכבת תאים (גדל במנות מיקרוסקופ) לזמן קצר עם 1 × PBS, לאחר שטיפה, לתקן תאים באמצעות פורמלין 4% 10 דקות (עבור שורות תאים נגזר הלה) או 20 דקות (עבור תאים D3 ES) בטמפרטורת החדר. לשטוף את הצלחת עם 1 × PBS.
    התראה: פורמלדהיד גורם נזק עיניים חמורות, עלול לגרום לתגובה אלרגית העור, ויש גם קרצינוגן אפשרי; לפיכך, כל הצעדים ניסיוני עם פורמלין צריכה להתבצע ב קולט אדים.
    הערה: כדי למנוע הלבנת מיותרים של אותות פלורסצנטיות, לאחסן המנה בחדר חשוך בזמן הדגירה הכרחי עבור צביעת immunofluorescence.
  2. Permeabilize תאים עם 0.1% טריטון X-100 מומס H 2 O ב 8 דקות ולאחר מכן דגירה התאים במשך 12 דקות עם PBS × 1 המכיל סאפונין 0.1% ו- 0.1% טריטון X-100. לאחר דגירה, לשטוף את התאים 1 × PBS פעמיים במשך 15 דקות
  3. תאים Incubate עם 1% BSA ב 1 × PBS עבור 60 דקות כדי לחסום את הכריכה לא ספציפי של נוגדנים שנבחרו. לשטוף תאים 1 × PBS למשך 15 דקות לאחר דגירה.
  4. Dilute נוגדן ראשוני ביחס של 1: 100 (או 1:200) (שלב זה חייב להיות optimized על נוגדנים בודדים) ב- BSA 1% ב- 1 × PBS, באמצעות 25 µL של פתרון זה לכל מאכל ולכסות את התאים עם coverslip. דגירה התאים עם הפתרון המכיל נוגדן ראשוני בתוך תא humidified בין לילה ב-4 מעלות צלזיוס
  5. למחרת, לשטוף תאים 1 × PBS פעמיים במשך 5 דק.
  6. לדלל הנוגדן משנית ביחס של 1: 100 (או לחילופין 1:200) ב- BSA 1% ב- 1 × PBS, באמצעות µL 100 של פתרון זה לכל תבשיל, ולכסות את התאים עם coverslip. דגירה התאים עם הפתרון המכיל הנוגדן משני עבור 60 דקות. לאחר דגירה, לשטוף את התאים 1 × PBS שלוש פעמים במשך 5 דק
  7. הר את coverslip עם טיפת הרכבה בינונית, לאטום את coverslip עם לק או דבק כדי למנוע ייבוש ותנועה במהלך תצפית מיקרוסקופית. לאחסן את המנה בחושך ב-4 מעלות צלזיוס

5. קרינה פלואורסצנטית שלמים התמונה (FLIM) מיקרוסקופיה

  1. להתחיל FLIM התוכנה. פתח " דבש היישום " של התוכנה ולהחליף לו " FLIM " מצב. ודא כי המערכת תסיר פועל במצב פעמו.
    הערה: האופרטור עליך להחליף לחצן חומרה כדי להגיע במצב פולס.
  2. למקם את המנה המכילות את התאים ויטראז'ים (מוכתם בסעיף 4) על הבמה מיקרוסקופ בכיוון זהה כמו בזמן microirradiation מקומיות, ולמצוא את התאים לקרינה על-פי הרשתות על הפטרי. בצע ייבוא תמונות על-ידי מיקרוסקופ קונפוקלי.
    הערה: השתמש בהגדרות הבאות: 1024 × 1024 פיקסלים, 400 הרץ, מצב דו-כיווני, שורות 16, זום 8 x 12 x.
  3. לפני תחילת המדידה FLIM, לבצע בדיקה ראשונית להציג רישום בזמן אמת של דעיכה מעריכית, על-ידי לחיצה על " ההתקנה FLIM " ו " רכישת " והקשה " FLIM להפעיל מבחן ". למטב את הפרמטרים FLIM עבור המדגם על-ידי הערכת את שני הפרמטרים העיקריים כדלקמן.
    1. מטב קצב החזרה של יקלו עם הגל עירור למכוניתך. החיים של המדגם (ראה הערה להלן). התוכנה מיקרוסקופ קונפוקלי, לכוונן את עוצמת לייזר עם הלחצן המתאים, אשר נקרא בדרך כלל " לייזר הגדרת התאמה " ב ' תמונה רכישת ' בתפריט. לאחר מכן, לחשב דעיכה עקומה (או היסטוגרמה מציג בכל הסעיפים פוטון) באמצעות התוכנה FLIM (ראה איור 4A -B).
      הערה: השתמש יקלו במצב דופק על עירור. התוכנה חייב להיות מצויד בורר הדופק עבור יקלו, אשר מאפשר בחירה של קצב החזרה (80, 40, 20 או 10 מגה-הרץ). אורך הגל עירור במקרה של התורם פלורסצנטיות, ה-GFP, הוא 488 ננומטר. העקומה דעיכה נרשם באמצעות תוכנה FLIM בסביבת העבודה. הפרמטר (τ D, τ DA) מראה פעמים דעיכה מעריכית (למשל, fluorochrome שלמים); פרמטר (א) מייצג את משרעת הריקבון fluorochrome (ראה דוגמאות של נתונים FLIM p53 מתויג GFP ו מתויג mCherry 53BP1 ב איור 4A -B).
    2. לבדוק את קצב החזרה ספירה באמצעות הכלי רכישת תוכנה (חזרה בחר שיעור מצב). בחר את הפיקסלים המבריקים במדגם; העקומה עבור הפיקסל הבהיר חייב להיות מתחת ל-10% של עוצמת קרינה פלואורסצנטית הכללית.
  4. לחץ על " מדידה " והקש " להפעיל את FLIM ".

6. תורם לכל החיים באמצעות FLIM Script יעילות החישוב של דאגה

  1. להפעיל את התוכנה סריג-FLIM ולפתוח ' התורם ' סביבת עבודה.
  2. בחר " ניתוח " / " הדמיה " טאב ' מתפריט ' ולהתחיל את התסריט FLIM על ידי לחיצה " להתחיל ". עבור ההגדרות האופטימליות סריג-FLIM, השתמש שותפים ידועים חלבון שמעצבת.
    הערה: היעילות סריג-FLIM למפגש ידועים שותפים GFP-p53 והיה mCherry-53BP1 (34.1 ± 2.3) % ( איור 4C).
  3. להשתמש רק את התורם פליטה (ערוץ 1 או 2) וערוץ התקשורת " לחשב מהר FLIM ".
    הערה: התמונה וגרף את שניהם יעודכנו.
  4. ב ה סריג-FLIM תוכנה, להגדיר את עוצמת (0 - 4000 ספירות) סולם שלמים (0 - 5 ns) ידנית של התוכנה. עם גישה זו, להמחיש את התא של עניין ולהגדיר את המדידה סריג-FLIM.
    הערה: הגדרה זו מבטלת הבדלים בעוצמת זריחה בין תאים בודדים באוכלוסייה תא.
  5. את הטופס דעיכה, לבחור את הדגם התאמה.
    הערה: מומלץ reconvolution n-מעריכית ומבחר של פרמטר דגם " n ". מתאימים באופן אופטימלי יש את הקריטריונים הבאים: מצויד עקומת שכבות-על העקומה דעיכה טוב ו- χ 2 - ערך שווה ל- 1 ( איור 4B).
  6. בחר " הסף " / " שימוש הסף " ולהגדיר את הסף ל-75. תתחיל " הראשונית התאמה ".
    הערה: התוכנה SPT64 מחשבת את אורך החיים הממוצע התורם בהיעדרו של קשת/קשתית (" לכל החיים הממוצע המשוקלל משרעת ", τ Av.Amp)

7. סריג יעילות באמצעות קובץ ה-Script FLIM-סריג

  1. בחר את סביבת העבודה של התורם/מקבל ולאחר מכן פתח " ניתוח " | " הדמיה " | " תמונת החיים תדאג ".
  2. בחר רק את התורם כערוץ פעיל ולהתאים פיקסל Binning בהתאם הפוטון המספר לפיקסל. לאחר מכן הפעל את מצב תוכנה בשם " לחשב FastFLIM ". אם הפוטון המספר/הפיקסל בתמונה נמוכה, להגדיל את הפיקסל Binning ל- 4 נקודות.
  3. להגדיר את עוצמת 0 - סעיפים 200 וגם את משך החיים של 0 - 5 ns-
  4. הפעלה " שימוש הסף " והזן את הסף של 75-
  5. להגדיר את מודל מתאים " Multi-הוצאה התורם ", הזן את הפרמטר דגם " n ", הזן τ Av.Amp (שלב 6.6) כמו τ D, ולהפעיל " להתאים הראשונית ".
  6. קבע את הפרמטרים Bkgr דצמ, Shift IRF, ו- Bkgr IRF לערכים קבועים על-ידי הסרת הסימן.
    הערה: הגדרת רוב הפרמטרים יישאר קבוע ככל האפשר. גישה זו מפחיתה את תנודות סטטיסטיות. במקרה זה, אין להקיש " הראשונית מתאים " שוב. תיאורים של הפרמטרים שהוזכרו בצע: IRF = כלי פונקציית ההיגב, BkgrDec = רקע של התאם מעריכית, ShiftIRF = IRF משמרת של מעריכי reconvolution מתאים, BkgrIRF = IRF רקע של מעריכי reconvolution מתאים. כל שלושה פרמטרים מחושבים והוא יכול להיות קבוע שימוש בתוכנה לצורך ניתוח נוסף.
  7. העיתונות " FRETŔ לחשב מעניינים פעוטים תמונה (ההתוויה של אזור התמונה FLIM), סריג יעילות היסטוגרמה מחושבים היסטוגרמה מרחק סריג מותווים ( איור 4C). עם סיום הניתוח התמונה, הקש " שמירת תוצאה ".
    הערה: במהלך הניסויים סריג, יש לקחת בחשבון כי חלבונים פלורסנט התערוכה הפיך מעברים בין פלורסנט (בהיר) ומדינות הלא-פלורסנט (כהה). תכונה זו נקראת " מהבהב ", סריג יעילות מושפע תופעה זו (הסבר על אפקט זה סופק על ידי. Vogerl et al. 24).

8. ניתוח FRAP

  1. המקום דיסh על הבמה מיקרוסקופ, לחפש את התאים transfected לבטא את החלבון fluorescently מתויג עניין ולבצע ייבוא תמונות באמצעות מיקרוסקופיית שדה בהיר עם המנורה מיקרוסקופ רגיל (ראה איור מק ט 2Aa-b), קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ מצבי.
    1. עבור רכישת התמונה, השתמש לייזר אור לבן (יקלו) מחובר מיקרוסקופ קונפוקלי (או לייזר של בחירה, לפי fluorochrome הנבחרת). השתמש בהגדרות הבאות: 512 × 512 פיקסלים, 1000 הרץ, דו-כיווניים מצב, קו ממוצע 1, זום 8 x 12 x.
    2. לרכוש לפחות 15 תמונות prebleaching (בעוצמה ~ 10% לייזר) ומגדירים האזור של הריבית (ROI) בתפריט רכישת התמונה.
  2. לניסויים photobleaching, להשתמש ללייזר (488 ננומטר). להחיל את ההגדרות הבאות: מסגרת רזולוציה 512 × 512 פיקסלים, 1000 הרץ, מצב דו-כיווני, זום 8 x 10 x.
    הערה: Fluorochromes כולל GFP, mCherry ו- RFP יכול להיות נרגש של לייזר ארגון עובדים-488 ננומטר או 514 nm.
  3. השתמש במצב תוכנה FRAP במיקרוסקופ של בחירה. במהלך photobleaching, להגדיר ללייזר ' s כוח מרבי באמצעות לחצן ההתאמה לייזר. לבצע ייבוא תמונות במרווחי s 0.256, על עוצמת הלייזר 10%-
    הערה: עבור postbleaching צעדים, השתמש במצב רכישת תמונה רגילה של מיקרוסקופ קונפוקלי של בחירה.
    1. צג זריחה זמן ההחלמה לאחר photobleaching (עד 45-50 s לאחר ההליך הלבנת).
      הערה: כפי שמוצג באיור 4D, זמן ההחלמה לאחר photobleaching עבור 53BP1 מתויג mCherry היא ברורים נגעים DNA ספונטנית, מוקדים UVA-הקרנה-induced. mCherry-53BP1-UVA נגעים התאושש במהירות בהשוואה הצטברויות mCherry-53BP1-באופן ספונטני המתרחשים DNA לתקן foci; רואה. איור 4D, Foltankova et al. 25
  4. לייצא הנתונים בתוכנה מיקרוסקופ (או תוכנה של הבחירה) לגיליון אלקטרוני ולבצע ניתוח סטטיסטי.

תוצאות

שימוש מתקדם מיקרוסקופיה קונפוקלית, הבחנו הצטברות של מתויג mCherry חלבונים 53BP1 ו- mCherry-PCNA ב DNA נגעים. הבדיקות בוצעו על-ידי microirradiation המקומי של תאים חיים. כדי לזהות את הדפוסים הפצה גרעינית של ה-DNA תיקון-חלבונים הקשורים בשלבים בודדים מחזור התא, השתמשנו המערכת התאית Fucci, שבו זה אפשרי ...

Discussion

טכניקות במיקרוסקופ מייצגים כלים בסיסיים במעבדות מחקר. כאן, תיאור קצר של השיטות המחקר של חלבון גיוס והוא מוצג קינטיקה ב DNA נגעים. במיוחד שהזכרנו ניסיוננו ניסויים בשדה של microirradiation המקומי של תאים חיים, נדון המחקר של חלבון קינטיקה על ידי האינטראקציה FRAP, חלבון ב DNA נגעים על ידי מקבל-הלבנת סריג

Disclosures

המחברים מצהירים כי ישנם שאין ניגודי אינטרסים.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה על ידי הסוכנות מענק של הרפובליקה הצ'כית, פרוייקט P302-12-G157. ניסויים נתמכו גם-תוכנית CZ09 ' מחקר צ'כית-נורווגית, אשר מפוקח על ידי קרנות נורבגי, ועל ידי משרד החינוך, הנוער והספורט של הרפובליקה הצ'כית (להעניק את המספר: 7F14369).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell cultivation
HeLaATCCCCL-2TM
ES-D3 [D3]ATCCCRL-11632TM
HeLa -Fucci cellshttp://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html
DMEMPAN-BiotechP03-0710
DMEM high glucoseSigma-AldrichD6429-500ML
Fetal bovine serum (FBS)HyCloneSV30180.03
ES Cell FBSGibco16141-079
Non-Essential Amino Acids (NEAA)Gibco11140-035
mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor)Merck MilliporeESG1107
MTG (1-Thioglycerol)Sigma-AldrichM6145-25ML
Penicillin-Streptomycin SolutionBioseraXC-A4122/100
Trypsin - EDTABioseraXC-T1717/100dilute with 1 × PBS in ratio 1:6
Nunclon cell culture dishesSigma-AldrichP7866cultivation of mESCs D3 cells
µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500Ibidi GmbH81166microscopic dish
0.2% GelatineSigma-AldrichG1890-100Gdilute in destille water and autoclaved
NameCompanyCatalog NumberComments
Cell transfection
GFP-p53 plasmidAddgene12091
mCherry-PCNA plasmidgenerous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt
mCherry-53BP1 plasmidAddgene19835
MetafeceteneBiontex Laboratories GmbHT020–2.0
10 × PBSThermo Fisher ScientificAM9625for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water
5-bromo-2’-deoxy-uridineSigma-Aldrich11296736001
NameCompanyCatalog NumberComments
Confocal microscopy
Microscope Leica TCS SP5Leica Microsystems
Microscope Leica TCS SP8Leica Microsystems
White-light laserLeica Microsystems
355-nm laserCoherent Inc.laser power 80 mW
405-nm laserLeica Microsystemslaser power 50 mW
NameCompanyCatalog NumberComments
Immunofluorescence staining
CoverslipVWR International Ltd631-1580
4% paraformaldehydeAffymetrix19943 1 LT
Triton X100MP Biomedicals2194854
Saponin from quillaja barkSigma-AldrichS4521
BSASigma-AldrichA2153
53BP1Abcamab21083primary antibody
AlexaFluore 647Thermo Fisher ScientificA27040secondary antibody
VectashieldVector Laboratories LtdH-1000mounting medium

References

  1. Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions. Photochem Photobiol. 88 (5), 1048-1065 (2012).
  2. Cooke, M. S., et al. Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair. J Immunol Methods. 280 (1-2), 125-133 (2003).
  3. Lahtz, C., et al. Gamma irradiation does not induce detectable changes in DNA methylation directly following exposure of human cells. PLoS One. 7 (9), e44858 (2012).
  4. Cremer, T., et al. Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84. Hum Genet. 74 (4), 346-352 (1986).
  5. Zorn, C., Cremer, T., Cremer, C., Zimmer, J. Laser UV microirradiation of interphase nuclei and post-treatment with caffeine. A new approach to establish the arrangement of interphase chromosomes. Hum Genet. 35 (1), 83-89 (1976).
  6. Bartova, E., et al. Recruitment of Oct4 protein to UV-damaged chromatin in embryonic stem cells. PLoS One. 6 (12), e27281 (2011).
  7. Stixova, L., et al. HP1beta-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs. Epigenetics Chromatin. 7 (1), 39 (2014).
  8. Stixova, L., et al. Advanced microscopy techniques used for comparison of UVA- and gamma-irradiation-induced DNA damage in the cell nucleus and nucleolus. Folia Biol (Praha). 60, 76-84 (2014).
  9. Luijsterburg, M. S., et al. Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage. J Cell Biol. 185 (4), 577-586 (2009).
  10. Bartova, E., et al. Coilin is rapidly recruited to UVA-induced DNA lesions and gamma-radiation affects localized movement of Cajal bodies. Nucleus. 5 (3), 460-468 (2014).
  11. Franek, M., et al. Advanced Image Acquisition and Analytical Techniques for Studies of Living Cells and Tissue Sections. Microsc Microanal. 22 (2), 326-341 (2016).
  12. Lemmer, P., et al. Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range. J Microsc. 235 (2), 163-171 (2009).
  13. Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nat Cell Biol. 3 (6), E145-E147 (2001).
  14. Lakowitz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
  15. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
  16. Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M., Suhling, K. Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology. Curr Opin Biotechnol. 20 (1), 28-36 (2009).
  17. Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
  18. Iwabuchi, K., Bartel, P. L., Li, B., Marraccino, R., Fields, S. Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (13), 6098-6102 (1994).
  19. Ward, I. M., Minn, K., van Deursen, J., Chen, J. p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice. Mol Cell Biol. 23 (7), 2556-2563 (2003).
  20. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr Biol. 8 (7), 377-385 (1998).
  21. Walter, J., Schermelleh, L., Cremer, M., Tashiro, S., Cremer, T. Chromosome order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages. J Cell Biol. 160 (5), 685-697 (2003).
  22. Sakaue-Sawano, A., et al. Tracing the silhouette of individual cells in S/G2/M phases with fluorescence. Chem Biol. 15 (12), 1243-1248 (2008).
  23. Sorokin, D. V., et al. Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle. Nucleus. 6 (4), 301-313 (2015).
  24. Vogel, S. S., Nguyen, T. A., van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS One. 7 (11), e49593 (2012).
  25. Foltankova, V., Matula, P., Sorokin, D., Kozubek, S., Bartova, E. Hybrid detectors improved time-lapse confocal microscopy of PML and 53BP1 nuclear body colocalization in DNA lesions. Microsc Microanal. 19 (2), 360-369 (2013).
  26. Suchankova, J., et al. Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci. Biol Cell. 107 (12), 440-454 (2015).
  27. Bártová, E., et al. PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle. Protoplasma. , (2017).
  28. Krejci, J., et al. Post-Translational Modifications of Histones in Human Sperm. J Cell Biochem. 116 (10), 2195-2209 (2015).
  29. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18475-18480 (2010).
  30. Sustackova, G., et al. Acetylation-dependent nuclear arrangement and recruitment of BMI1 protein to UV-damaged chromatin. J Cell Physiol. 227 (5), 1838-1850 (2012).
  31. Smirnov, E., et al. Separation of replication and transcription domains in nucleoli. J Struct Biol. 188 (3), 259-266 (2014).
  32. Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).
  33. Day, R. N. Measuring protein interactions using Forster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
  34. Konig, K., Uchugonova, A., Breunig, H. G. High-resolution multiphoton cryomicroscopy. Methods. 66 (2), 230-236 (2014).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

129FLIMPCNA53BP1p53

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved