JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Lazer microirradiation yaşayan hücrelerde DNA onarım çalışmaları için yararlı bir araçtır. Çeşitli DNA lezyonlar ikna etmek için UVA lazerler kullanımı için bir metodolojik yaklaşım gösterilir. Normal hücre döngüsü tutar yerel microirradiation için bir yöntemi optimize; Böylece, ışınlanmış hücre mitoz devam edin.

Özet

Lazerler ile yerel microirradiation canlı hücrelerdeki DNA onarım ile ilgili süreçlerin çalışmaları için yararlı bir araç temsil eder. Burada, yerel olarak microirradiated Kromatin zaman ya da protein-protein etkileşimleri üzerinde protein Kinetik DNA lezyonlar, analiz için bir metodolojik yaklaşım tarif. Biz de tek tek hücre döngüsü bağlı protein Kinetik DNA lezyonlar, çalışmaya Fucci hücresel sistem kullanarak hücre döngüsü aşamaları tanımak gösterilmiştir. İki UV lazerler kullanımı metodolojik açıklaması (355 nm ve 405 nm) farklı DNA hasar ikna etmek için de sunulmaktadır. Yalnızca hücre microirradiated 405 nm diode lazer tarafından mitoz normalde devam etti ve cyclobutane pirimidin dimer (CPDs) yoksun olduğunu. Biz de nasıl microirradiated hücre immunodetection ilgi endojen proteinlerin gerçekleştirmek için verilen süre noktada sabit olabilir gösterir. DNA onarım çalışmaları için ayrıca sıkı BAĞLAMAK (floresan kurtarma sonra Photobleaching) ve FLIM (floresan ömür boyu Imaging mikroskobu) kendiliğinden meydana gelen hücreler dahil olmak üzere biyofiziksel yöntemlerin kullanımı tarif DNA hasarı foci. Ayrıca protein-protein etkileşimleri deneysel çalışmalarda FLIM FRET (floresan rezonans enerji transferi) bir uygulama gösterir.

Giriş

DNA hasar oluşan cyclobutane pirimidin dimer (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine ve tek iplikçikli DNA lezyonlar görünümünü açar veya iki iplikçikli1,2tatili. Γ-ışınları iyonize radyasyon yüksek enerji ve yüksek alellerle biçimidir, böylece bu kaynağı radyasyon radyoterapi3' te yaygın olarak kullanılır. Öte yandan, deneysel olarak UV lazerler taklit eder doğal maruz UV ışığı neden olduğu DNA hasar indüklenen. UVA microirradiation, mikroskobik bir yöntem olarak, bireysel yaşam hücrelerdeki DNA hasarı çalışmak için deneysel bir araç temsil eder. Microirradiation ilk kez 40 yıl önce kromozom bölgeleri4,5organizasyonu ortaya çıkarmak amacıyla kullanıldı. Bu teknik son derece işlevsel özelliklerini confocal mikroskoplar veya modern nanoscopy teknik sınırları üzerinde bağlıdır. DNA lezyonlar ikna etmek için hücreleri tarafından 5' bromodeoxyuridine (BrdU) veya Höchst 33342 UV Işınlama önce presensitized. Bártová vd. 6 presensitization adım daha önce açıklanan ve son zamanlarda biz bu microirradiation teknik hücre ölümü veya apoptosis önlemek için en iyi duruma getirilmiş. Örneğin, bir 405 nm UV lazer (olmadan Höchst 33342 presensitization) kullanımı pahasına cyclobutane pirimidin dimer (CPDs) 53BP1-pozitif iki iplikçikli kırılmalar (DSBs) indüksiyon için yol açar. Öte yandan, UV microirradiation ile kombine presensitization adımları çok yüksek düzeyde CPDs ve DSBs aynı anda neden7,8. Bu yöntem tek bir DNA onarım yol çalışma odasına uygulamak zordur.

Microirradiation ile protein alımı, kinetik ve etkileşim, canlı hücreler lezyonlarının DNA analiz etmek mümkündür. Bu yöntemi örneği Luijsterburg vd tarafından yayımlandı 9 heterochromatin protein 1β ve biz son zamanlarda pluripotency faktör Oct4 ve Aytac, Cajal organları ile ilişkili bir protein DNA UV kaynaklı lezyonlar6,10' a işe ilk kez gösterdi. Bu DNA lezyonlar, protein Kinetik da sıkı BAĞLAMAK (floresan kurtarma sonra Photobleaching)11,12,13 kullanarak okudu olabilir veya (floresan rezonans enerji transferi) teknikleri14 ÜZÜLMEK ,15. Bu yöntemler basit Difüzyon proteinlerin DNA lezyonlar veya protein-protein etkileşimleri ortaya potansiyeline sahip. Ek protein karakterizasyonu için yararlı bir araç FLIM (floresan ömür boyu Imaging mikroskobu) veya perde teknoloji (FRET-FLIM)16ile onun birlikte olduğunu. Bu yöntemler stabil olan hücreler yaşayan veya geçici protein flüoresan molekül17tarafından öğesini ilgi ifade işlemleri çalışma etkinleştirin. Burada, üstel çürüme kez (τ) GFP öğesini p53 protein ve etkileşim ortak, 53BP1, mCherry öğesini DNA hasarı yanıt18,19 ' önemli bir rol oynayan bir örneği gösterilir. Parametre τ FLIM hesaplamaları tarafından sağlanan fluorochrome ömrünü bir verilen Floresans boya, bağlama yetenekleri ve hücresel çevresi için özeldir. Bu nedenle, bu yöntem bize DNA hasar sonra örneğin, protein altgrupları, bağlama yeteneklerini ve fonksiyonel özellikleri arasındaki farklılıklar gösterebilir.

Burada, bizim laboratuvarda Saat özel protein alımı, Kinetik, difüzyon ve microirradiated Kromatin sitesinde protein-protein etkileşimleri incelemek için kullanılır bir anahat gelişmiş mikroskobu teknikleri metodolojik yaklaşımların sunulur. Canlı hücreler yerel DNA lezyonlarının indüksiyon ve metodolojileri itibariyle yerel olarak bağlı DNA lezyonlar UV lazerler tarafından neden olduğu DNA hasar ile ilgili olayların çalışmaları için yararlı bir açıklama için adım adım yöntemler sağlanır.

Protokol

1. hücre hatları ekimi

  1. HeLa türetilmiş hücre hatları
    Not: kullanım HeLa serviks Karsinomu hücre: stabil Histon H2B ifade ya HeLa hücreleri RFP-Cdt1 ifade GFP veya HeLa-Fucci hücrelerle öğesini G1 ve erken S aşamaları ve GFP-geminin S/G2-M aşamasında ( şekil 1).
    1. Tüm HeLa türetilmiş hücre satırlarını ekimi için Dulbecco kullanmak ' s modifiye kartal ' % 10 fetal sığır serum ve oksijen bir atmosferde % 5 CO 2 içeren 37 ° C'de uygun antibiyotikler ile takıma s orta (DMEM). Orta 2 - haftada 3 kez yerine.
    2. Kültür orta kaldırmak ve tripsin inhibitörü içeren serum tüm izlerini ortadan kaldırmak için 1 x PBS kullanarak hücreleri durulayın. Oda sıcaklığında bir biohazard başlıklı bu adımı gerçekleştirin.
    3. 1 mL hücre katmanı kapsayacak şekilde prewarmed tripsin-EDTA çözeltisi ekleyip 37 ° c Trypsinize hücreleri, hücre hücre Katmanı (genellikle 3-5 dk) dağınık kadar devam.
    4. Prewarmed tam büyüme orta tripsin-EDTA devre dışı bırakabilirsiniz için 3 mL ekleyin ve hafifçe birkaç kez pipetting tarafından orta dağıtmak.
      Not: Bu yordam bir biohazard mahallede kirletici operatör korumak ve optimum hücre yetiştirme koşulları korumak için gerçekleştirilmelidir.
    5. Bir otomatik hücre sayaç veya Bürker odası kullanarak hücreleri hesaplama. Hücre süspansiyon 1 × 10 5 hücre/mL ve 5 mL damlalıklı yeni bir tabak içine sulandırmak. Hücreleri 37 ° C ve % 5 CO 2 kuluçkaya.
  2. Ekimi fare embriyonik kök hücre (mESCs), D3 hücre kültürünü
    1. kültür mESCs hücre kültür yemekleri % 0,2 jelatin ve mESC bakım orta ile kaplı. Hücreleri 37 ° C ve % 5 CO 2 kuluçkaya.
      Not: 50 mL aliquots mESCs ekimi/bakım ortamda hazırlanması ve 2-8 ° C'de 2 hafta için depolama önerilir. 75 mL ES hücre FBS, 5 mL penisilin G ve streptomisin, 5 mL mESC ortam içeren sigara-esansiyel Amino asitler (10 mM) (son konsantrasyonu 0,1 mM), 50 µL fare lösemi engelleyici faktör (mLIF; 100 µg/mL) (son konsantrasyonu 10 ng/mL), 430 µL MTG (1- Thioglycerol; DMEM içinde 1: 100 seyreltme) (son toplama 100 µM) ve yüksek glikoz DMEM orta ilâ 500 mL.
    2. Kültür çanak mESC ekimi ortamından Aspire edin ve 1 x PBS bir kez hücrelerle durulayın.
    3. 0,5 mL tripsin-EDTA ekleyin ve sadece yemek ayırmak hücreleri başlamak kadar 37 ° C'de kuluçkaya. Tripsin 2 mL % 15 fetal sığır serum ile desteklenmiş mESC yetiştirme ortamının hücrelerle yıkayarak devre dışı bırakabilirsiniz.
    4. Kültür çanak kalan hücrelerden çıkarmak için bir pipet kullanın.
      Not: hücrelere farklılaşma hücre kümeleri teşvik tek hücre elde etmek önemlidir çünkü.
    5. Bölünmüş hücreler 1:10 mESC bakım orta ile gelatinized yemekleri üzerine.
      Not: mESC hücre yoğunluğu çok düşük ise, onlar de büyümek değil; yoğunluğu çok yüksek ise, farklılaşma yükseltilir.
    6. MESCs mESC geçiş iki günde dört yeni tabaklar bir Petri kabına hücrelerden bölerek gerçekleştirerek farklılaşmamış bir durumda tutulur emin olun. Ters bir mikroskop altında 100 X veya 200 X büyütme ile mESC sömürgelerinde incelemek ve hücre farklılaşması spontan mES kanıtı ise, Batı lekesi Oct4 protein tükenmesi değerlendirmek için gerçekleştirin.
      Not: optimum hücre passaging ile spontan mESCs vitro farklılaşma azaltılabilir.

2. Transfection hücre

  1. tohum hücreleri gridded mikroskobu yemekleri üzerinde deneyler önce 48 h (çapı 35 mm) microirradiated hücreleri Petri kabına onların koordinatlarına göre bulmak için.
    Not: Bu hangi microirradiation ilk deneysel adımdır bir örnektir ve immunostaining ( şekil 2A) saniyedir.
    1. Tohum için 5 × 10 4 hücre/mL bir konsantrasyon HeLa türetilmiş hücre hatları (veya 1 × 10 4 hücre/mL D3 mES hücreler için) için kullanın. Çanak başına 2 mL tam orta için kullanın. Yetiştirme ve microirradiation sırasında korumak bir termostat veya yetiştirme odası 37 ° C ve % 5 CO 2 hücrelerinde.
    2. Bir otomatik hücre sayaç kullanarak hücreleri hesaplama.
      Not: yoğun hücre kullanmayın. D3 mESCs yoğun paketlenmiş kolonileri durumunda özellikle, yüksek hücre yoğunluğu yerel olarak microirradiated hücreleri bir kimlik immunostaining sonra engeller.
  2. Aşağıdaki gibi tercih plazmid DNA ve transfection reaktif hazırlamak. 2-3 µg, seçili plazmid DNA kullanarak Çözüm A hazırlamak (Ayrıntılar için Malzemeler tablo görmek) ve 150 µL 1 x PBS. 3.5 µL transfection reaktif 150 µL 1 × PBS kullanarak Çözüm B hazırlayın. Her çözüm iyi dikkatli pipetting tarafından karışık olun.
    Not: Optimum oranı DNA ve transfection reaktif ampirik olarak her hücre kültürünü ve bireysel plazmid için belirlenmelidir.
  3. , Geçici transfected yaşayan deneysel gözlenmesi önce s 24 hücreleri, birleştirmek çözüm A ve çözüm B vortexing olmadan. 15-20 dakika oda sıcaklığında kombine çözümleri kuluçkaya. Dropwise bir şekilde homojen bu dağıtmak tamamlamak transfection karışımı mikroskobu tabak içinde büyüyen hücre Katmanı (açıklandığı noktası 2.2 olarak 300 µL).
  4. Incubate hücrelerin 37 ° C ve % 5 CO 2 için 4-6 h, sonra transfection karışımı ile taze orta yerini alır. Standart koşullar altında hücre yetiştirmek.
    Not: 405 nm lazer kullanırken, herhangi bir reaktif hücrelerle presensitize değil ama 355 nm lazer kullanırken, hücre presensitization 10 µM 5-bromo-2 ile gerçekleştirmek ' - Deoksi - uridine (BrdU) 7 , 8 . Presensitization zaman hücre tipi ve hücre döngüsünün uzunluğuna bağlıdır. HeLa hücreleri için 16-20 saat önce yerel microirradiation BrdU ekleyin. MESCs söz konusu olduğunda, 6-8 h microirradiation önce BrdU ekleyin.

3. Yerel DNA lezyonlar ve Confocal mikroskobu indüksiyon

  1. mikroskop Sahne Alanı'nda çanak yerleştirin ve çanak temel konumunu kaydetmek; hücre koordinatları daha fazla analiz için gerekli olacaktır ( şekil 2A a-c).
  2. Transfected hücreleri ile bir sayı ya da harf (d-f 2A rakam, hücrenin konumu panelleri Ae ve Af büyütülmüş reklam gösterisinde oklar) etiketli bir köşeli bulmak. Parlak alan mikroskobu kullanarak hücreleri bir görüntü elde etmek ve hücreleri ve etiketli Meydanı ( şekil 2A) konumunu tanımlamak için bir floresan görüntü elde.
  3. Confocal mikroskop bağlı bir beyaz ışık lazer (WLL) (470-670 nm 1-nm artışlarla) (veya için conf bağlı başka bir kullanılabilir lazer ışınlama önce resim alma için kullanınÖçal mikroskop).
  4. Aşağıdaki ayarları kullanın: 512 × 512 piksel çözünürlük, piksel boyutu 64 nm, 400 Hz, çift yönlü modu (iki yönde tarama), satır ortalama 8 kümesine, 8 x 12 x zum
    Not: Tarama belirli sayıda satır ortalama temsil eder; aynı satıra birden çok kez bir sonraki satıra devam etmeden önce taranır. İnceden inceye gözden geçirmek tüm satırlarının üretmek görüntünün son karesine tekrarladı.
  5. Görüntü gözlem ve satın alma için 63 × petrol amaç 1.4 sayısal bir diyafram ile kullanın ve sırayla Floresans görüntüleri elde etmek. Çapraz-hadis uygun yazılımı sıralı tarama modunu kullanarak iki fluorochromes arasında ortadan kaldırmak.
    Not: Tüm mikroskop bilgisayar yazılımı sözde bir sıralı tarama modu ayarını etkinleştirir. Operatör fluorochromes elde etmek seçebilirsiniz ' bilgi aynı anda (örneğin, kırmızı-yeşil-mavi Floresans içinde) veya burada, tek tek belirtildiği gibi (ardışık) olarak fluorochrome fluorochrome tarafından. Maksimum uyarma/emisyon GFP için 395/509 genel bilgiler dikkate nm ve maksimum uyarma/emisyon mCherry için olduğunu 587/610 nm (burada şekil 2B içinde kullanılan fluorochromes bakınız). Bu bilgilere göre uygun uyarma ve emisyon filtreler için istediğiniz fluorochromes seçin. Filtre seçimi ve yordamlar tarama her confocal mikroskop için optimize gerekir.
  6. DNA lezyonlar, kullanım 64 satır tarama modu, indüksiyon için WLL geçiş (içinde ' Alım ' modu), dış UV kaynağında geçiş (üzerinde " UV lazer " düğme), faiz (ROI) bölgesi ayarlayın (içinde ' edinme ' modu) ve 355 nm ayarla Lazer için % 100 güç veya alternatif olarak, bir 405 nm lazer kaynağı kullanın.
    Not: Genel olarak, uygun lazer ayar düğmesi görüntü alma modunda tarafından lazer güç ayarlanır.
  7. Yerel microirradiation için çevre UVA spektrumunda yayarlar lazerler kullanıyor. Yatırım Getirisini çekirdeği microirradiation ve yakalama yansıması, lazer yoğunluğu ROI dışında düzenlemek için görüntü alma modunda sıfır olarak arka planını ayarlamak; hücre düzgün ışınlanmış, GFP Histon H2B sinyal kaybolur ve örneğin, mCherry öğesini PCNA protein DNA lezyonlar için hemen ışınlama sonra alınacaktır, ( şekil 2B ve Video 1 ).
    Not: Yatırım Getirisi bir confocal Ayrıca üç boyutlu (3D) projeksiyon (bkz: 3D döndürme ve x-y, x-z, y-z projeksiyonlar şekil 2C ve Video 2) bölümün içinde bir DNA hasarı indüklenen. Stixová vd. 355 nm ve 405 nm lazerler tam teknik parametrelerini açıklamaları için bkz: 7
  8. sonra ROI ışınlanmış, dış UV kaynak geçiş, yatırım Getirisi geçiş, WLL üzerinde geçiş, 8'e tarama satırını değiştirin ve ışınlama için başka bir hücreyi bulmak. Yatırım Getirisi seçimi için ilgili düğmeyi yazılımda kullanmak ' s resim alma modunu.
    Not: mCherry-PCNA DNA lezyonlar 2 ve 20 dk ( şekil 2B) arasında en fazla birikimi tepe vardır. Eksojen protein düzeyleri üzerinde sonucu görmek üzere, hemen yerel microirradiation sonra boyama ayirt devam. Işınlama zaman aralığına göre faiz seçin.
  9. Bir birikimi eksojen proteinlerin microirradiated hücrelerin çoğunda algılanabilir doğrula. Bu doğrulama için aşağıdaki adımlarda ölçütü kullanın.
    1. Onay yok overexpression geçici transfected hücrelerdeki eksojen protein olduğunu. Olası bir çözüm, yalnızca zayıf bir ifade (örneğin, mCherry-PCNA veya mCherry-53BP1) floresan protein içeren hücreleri seçin.
    2. Değerlendirmek resim alma için kullanılan WLL pozlama fototoksisite.
      Not: Fototoksisite sınama, uzun süreli lazer microirradiation için transfected hücreleri göstermek ve hücreler mitoz için 3A rakam gösterildiği gibi devam etmek doğrulamak -B. Olası bir çözüm, tarama süresi ve hücre başına confocal dilim sayısını azaltmak, 3D tarama en iyi Aksiyel adım (0.3 µm önerilir) seçime göre en iyi duruma getirme ve lazer ayarla ' s güç onun en azından. Alternatif olarak, fototoksisite ekimi ortamda çözünmüş Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic asit, E vitamini suda çözünen bir analog) kullanarak ortadan kaldırılabilir. DNA hasar ile ilgili deneyler için bu UV ışınlarına karşı koruyucu etkisi nedeniyle Trolox kullanmak için tavsiye edilmez.
    3. İle 355 nm lazer ışınlama durumunda yeterli birleşme BrdU BrdU birleşme üzerinden uygun bir BrdU algılama antikor kullanarak doğrulayın (bkz. Tablo reçetesi) kit. Bu yana BrdU DNA hücre döngüsü S aşamasında kurulmuştur, hücreleri çoğunluğu presensitization sırasında S-faz üzerinden devam etmeliyiz. Olası bir çözüm, hücre türü hücre döngüsünün uzunluğunu dikkate belirli.
      4. DNA tamir olsun ilgi proteinler
    4. analiz belirli hücre döngüsü lezyonlarının DNA evrelerini tanımak için bir yeteneği var. Olası bir çözüm: DNA lezyonlar için seçili protein alımı için belirli hücre döngüsü aşama (G1/S/G2) sınırlı olduğunu doğrulamak için HeLa-Fucci hücreler kullanın. Bu hücreler ifade RFP-Cdt1 G1 ve erken S aşamaları ve GFP öğesini geminin S/G2-M hücre döngüsü aşamaları 22 ( şekil 1).
      5. Apoptozis, hücre ölümü, önlemek için
    5. uygun lazer kaynağı seçin ve güç ayarı 23 lazer. Hücreleri ışınlanmış unutmayın mitoz için devam ( şekil 3A -B, Video 3).
      Not: İstenmeyen apoptosis Annexin V pozitifliği, caspase 3 veya B bölünme Okan tarafından tespit edilebilir. Dekolmanı morfolojik düzeyde, hücre ve apoptotik organları oluşumu görülebilir.

4. Ayirt Staining

  1. (mikroskop yemekleri büyüyen) hücre katmanı kısaca 1 × PBS ile yıkayınız ve hemen sonra durulama, oda sıcaklığında %4 formaldehit 10 dakikadır (HeLa türetilmiş hücre hatları) ya da 20 dk (için D3 ES hücreleri) kullanarak hücreleri tamir. 1 × PBS ile çanak durulayın.
    Uyarı: Formaldehit ciddi göz hasara neden olur, alerjik cilt reaksiyon neden olabilir ve aynı zamanda potansiyel bir kanserojen olduğu; Böylece, formaldehit ile tüm deneysel merdiven-meli var olmak kılınmak bir aspiratör mahallede.
    Not: gereksiz floresan sinyallerini ağartma önlemek için çanak karanlık bir odaya kuluçka zaman ayirt boyama için gerekli sırasında depolamak.
  2. Hücreleri Triton X-100 çözünmüş H 2 O 8 dakika içinde % 0.1 ile permeabilize ve saponin % 0,1 ve %0,1 içeren 1 × PBS ile 12 dk için hücreleri kuluçkaya Triton X-100. Kuluçka sonra iki kez 15 dakika süreyle 1 × PBS hücrelerde yıkama
  3. Incubate hücreleri ile % 1 BSA 1 × seçili antikorların belirsiz bağlama engellemek için PBS 60 dk için. Hücrelerde 1 × PBS 15dk için kuluçka sonra yıka.
    4. 1: 100 (veya 1: 200) oranında
  4. Dilute birincil antikor (Bu adım o olmalıdırptimized bireysel karşı antikorlar) 1 × PBS % 1 BSA içinde bu çözümün 25 µL çanak kullanarak ve bir coverslip hücrelerle kapsar. Hücreleri oksijen odasında birincil antikor gecede 4'te içeren çözüm ile kuluçkaya ° C.
  5. Ertesi gün, hücrelerde 1 × PBS iki kez 5 dakika süreyle yıkayın
  6. 1: 100 (veya alternatif olarak 1: 200) % 1 BSA 1 × PBS, bu çözümün 100 µL çanak kullanarak oranında, ikincil antikor sulandırmak ve bir coverslip hücrelerle kapsar. 60 dk için ikincil antikor içeren çözüm ile hücreleri kuluçkaya. Kuluçka sonra üç kez 5 dakika süreyle 1 × PBS hücrelerde yıkama
  7. Coverslip montaj orta bir damla ile bağlayın ve coverslip tırnak cilası ya da kurutma ve hareket sırasında mikroskobik gözlem önlemek için tutkal ile kapatın. Saat 4'te karanlıkta yemek depolamak ° C.

5. Floresans ömür boyu görüntü (FLIM) mikroskopi

  1. Başlangıç FLIM yazılım. Açık " Application Suite " yazılım ve geçiş yapmak " FLIM " modu. WLL darbeli modda çalıştığından emin olun.
    Not: Operatör pulse modu ulaşmak için donanım düğmesi geçmelidir.
  2. Yerel microirradiation sırasında aynı yönde mikroskop sahnede (Bölüm 4 lekeli) lekeli hücreleri içeren çanak yerleştirin ve Izgaralar üzerinde Petri kabına göre radyasyonlu hücreleri bulmak. Resim alma tarafından confocal mikroskop gerçekleştirmek.
    Not: aşağıdaki ayarları kullanın: 1024 × 1024 piksel, 400 Hz, çift yönlü modu, 16 satır, 8 x 12 yakınlaştırma
  3. FLIM ölçüm başlamadan önce bir gerçek zamanlı kayıt üstel girdabında yanında tıkırtı üstünde göstermek için bir ön test gerçekleştirmek " Kur FLIM " ve " Alım " basarak " çalıştırmak FLIM test ". Örnek FLIM parametrelerini aşağıdaki gibi iki ana parametre değerlendirmek tarafından en iyi duruma getirme.
    1. Uyarma dalga boyu ile WLL tekrarlama oranı ayarlı örnek ömür boyu en iyi duruma getir (aşağıdaki nota bakın). Confocal mikroskop yazılım, genellikle denir uygun düğmeyi ile lazer yoğunluğunu ayarlayın " lazer yararlanma ayarı " içinde ' görüntü edinme ' menü. Sonra bir bozunma eğrisi (veya foton hepsi gösterilen çubuk grafik) FLIM yazılımını kullanarak hesaplamak ( şekil 4A görmek -B).
      Not: WLL uyarma için nabız modunda kullanın. Belgili tanımlık bilgisayar yazılımı ile bir darbe seçici tekrarlama oranı gibi seçilmesine olanak tanıyan WLL için donatılmış olmalıdır (80, 40, 20 veya 10 MHz). 488 uyarma dalga boyu Floresans donör, GFP, durumunda olan nm. Bozunma eğrisi FLIM yazılım çalışma alanı kullanarak kaydedilir. Parametre (τ D, τ DA) üstel çürüme kez gösterir (örneğin, fluorochrome ömür boyu); parametre (A) temsil fluorochrome çürüme genliğini (p53 GFP öğesini ve mCherry öğesini 53BP1 şekil 4A içinde için FLIM verileri örnekler bkz: -B).
    2. Yazılımları satın alma aracı'nı (select tekrarlama oranı kipi) kullanarak sayısı tekrarlama oranı kontrol edin. En parlak piksel örnek seçin; Eğrinin en parlak piksel için genel floresan yoğunluğu % 10'u olmalıdır.
  4. Tıklayın " ölçüm " ve basın " çalıştırmak FLIM ".

6. donör ömür boyu bir FLIM komut dosyası ve verimliliği hesaplama, FRET kullanarak

  1. perde-FLIM yazılımını başlatın ve açık ' donör ' çalışma.
  2. Select " analiz " / " görüntüleme " tab menü ve FLIM komut dosyasını tıklatarak başlatmak " başlatmak ". Optimum FRET-FLIM ayarlar için iyi bilinen etkileşen protein ortakları kullan.
    Not: iyi bilinen etkileşimli olarak çalışmak için FRET-FLIM verimliliği GFP p53 ortakları ve mCherry-53BP1 oldu (34.1 ± 2.3) % ( şekil 4 c).
  3. Kullanmak sadece donör emisyon kanal (channel 1 veya 2) ve basın " hızlı hesaplamak FLIM ".
    Not: Resim ve grafik de güncelleştirilir.
  4. FRET-FLIM içinde yazılım, yoğunluk ölçeği ayarlayın (0 - 4000 adet) ve ömür boyu ölçeği (0 - 5 ns) el ile belgili tanımlık bilgisayar yazılımı içinde. Bu yaklaşım ile ilgi hücre görselleştirmek ve FRET-FLIM ölçüm ayarla.
    Not: Bu ayar floresan yoğunluğu hücre nüfus tek tek hücreleri arasında farklılıkları ortadan kaldıran.
  5. Çürüme formunda, uygun modeli seçin.
    Not: N-üstel reconvolution ve seçim modeli parametresi önerilir " n ". Bir oturması aşağıdaki kriterlerden: monte iyi bozunma eğrisi ve χ 2 bindirmeleri eğri - 1'e ( şekil 4B) eşit değerdir.
  6. Select " eşik " / " kullanım eşik " ve eşik 75'e ayarlayın. Başlangıç " ilk uyum ".
    Not: SPT64 yazılım FRET yokluğu ortalama donör hayatta hesaplar (" genlik ağırlıklı ortalama ömür boyu ", τ Av.Amp)

7. FLIM-perde komut dosyası kullanarak FRET verimlilik

  1. donör/alıcısı çalışma alanını seçin ve açın " analiz " | " görüntüleme " | " ömür boyu FRET görüntü ".
  2. Sadece donör aktif kanalı seçin ve piksel Binning foton numarası/piksel bağlı olarak ayarlayın. Daha sonra adı verilen yazılım modunda çalıştırın " hesaplamak FastFLIM ". Foton numarası/piksel görüntü düşükse, piksel Binning 4 puan için yükseltin.
  3. 0 - 200 sayar ve ömür boyu 0 - yoğunluğu ayarla 5 ns.
  4. Harekete geçirmek " kullanım eşik " ve 75 eşiğinde girmek.
  5. Uygun modelini ayarlamak " Multi-Exp. donör ", modeli parametresi girin " n ", τ girin Av.Amp (adım 6,6) olarak bir τ D ve harekete geçirmek " ilk uygun ".
  6. Set parametreler Bkgr Aralık, Shift IRF ve Bkgr IRF işareti kaldırarak sabit değerlere.
    Not: sabit kalmasını parametreleri çoğunluğu mümkün olduğu kadar ayarla. Bu yaklaşım istatistiksel dalgalanmaları azaltır. Bu durumda, basın mı " ilk uygun " tekrar. Belirtilen parametre açıklamaları izleyin: IRF enstrüman yanıt işlevi, BkgrDec = arka plan üstel uygun, ShiftIRF = üstel reconvolution BkgrIRF uygun, vardiya IRF = üstel reconvolution uygun IRF arka plan =. Tüm üç parametre hesaplanır ve daha fazla analiz için yazılım kullanarak sabit olabilir.
  7. Basın " hesaplamak FRETŔ bir perde (FLIM görüntü alanında çizilen) görüntü FRET verimliliği histogram hesaplanır ve bir FRET mesafe çubuk grafik çizilir ( şekil 4 c). Görüntü analiz ettikten sonra tuşuna basın " Kaydet sonucu ".
    Not: perde deneyler sırasında bu floresan proteinler floresan (parlak) ve sigara-floresan (karanlık) Birleşik arasına tersinir geçişler sergi düşünün gereklidir. Bu özelliği denir " yanıp ", ve perde verimliliği (Bu etkisi açıklaması sağlanan Vogerl vd tarafından bu olay tarafından etkilenen 24).

8. Sıkı BAĞLAMAK analizi

  1. yer dish mikroskop sahnede fluorescently tagged protein ilgi ifade transfected hücreleri bulmak ve parlak alan mikroskobu ile standart mikroskop lamba kullanarak resim alma gerçekleştirmek (bkz şekil 2Aa:-b) ve Floresans mikroskobu modları.
    1. Confocal mikroskop (veya lazer seçimi, seçili fluorochrome göre) bağlı beyaz ışık lazer (WLL) resim alma için kullanın. Kullanma ertesi gün koyma: 512 × 512 piksel, 1000 Hz, çift yönlü mod, satır ortalama 1, 8 x 12 yakınlaştırma
    2. (~ %10 lazer güçte) en az 15 prebleaching görüntüleri ve faiz (ROI) için resim alma menüsündeki bölgesi tanımlamak.
  2. Photobleaching deneyler için bir argon lazer kullanın (488 nm). Aşağıdaki ayarlar uygulanır: çerçeve Çözünürlük 512 × 512 piksel, 1000 Hz, çift yönlü modu, 8 x 10 zoom
    Not: GFP, mCherry ve RFP gibi Fluorochromes 488 çalışan bir argon lazer heyecanlı nm veya 514 nm.
  3. Seçim mikroskop sıkı BAĞLAMAK yazılım modunu kullanın. Photobleaching sırasında argon lazer ayarla ' s güç lazer ayar düğmesini kullanarak maksimum. Resim alma % 10 lazer güç 0,256 s aralıklarla gerçekleştirmek.
    Not: adımları postbleaching için tercih confocal mikroskop standart resim alma modunu kullanın. Photobleaching sonrası
    1. monitör Floresans toparlanma süresini (beyazlatma prosedür sonra 45-50 s ilâ).
      Not: şekil 4 d içinde gösterildiği gibi mCherry öğesini 53BP1 için photobleaching sonrası toparlanma süresini spontan DNA lezyonlar ve UVA ışınlama indüklenen foci farklıdır. mCherry-53BP1 UVA lezyonlar, hızla kendiliğinden meydana gelen DNA onarım foci adlı mCherry 53BP1 birikimleri ile karşılaştırıldığında kurtarıldı; bkz: şekil 4 d ve Foltankova vd. 25
  4. mikroskop yazılım (veya yazılım) verileri elektronik tabloya verme ve istatistiksel analiz.

Sonuçlar

Gelişmiş confocal mikroskobu kullanarak, mCherry öğesini 53BP1 ve mCherry-PCNA proteinler DNA lezyonlar adlı bir birikimi görülmektedir. Analizleri canlı hücreler yerel microirradiation tarafından gerçekleştirilmiştir. Proteinlerin DNA onarım ile ilgili nükleer dağıtım desenleri tek hücre döngüsü aşamalı olarak tanımak için biz hangi G1, erken S, belirlemek mümkündür Fucci hücresel sistem ve G2 aşama hücre döngüsü (şekil 1)...

Tartışmalar

Mikroskopi teknikleri temel araçları araştırma laboratuarları'nda temsil eder. Burada, protein alımı için çalışma yöntemleri hakkında kısa bir açıklama kullanılan ve Kinetik DNA lezyonlar, sunulur. Biz özellikle deneysel deneyimi yaşayan hücrelerin yerel microirradiation alanında kaydetti ve sıkı BAĞLAMAK ve protein-protein etkileşim alıcısı ağartma FRET28 DNA lezyonlar ve onun gelişmiş protein Kinetik incelenmesi konuşalım değişiklik FRET-FLIM (

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir çıkar çatışması vardır bildirin.

Teşekkürler

Bu eser Çek Cumhuriyeti, proje P302-12-G157 Grant ajansı tarafından desteklenmiştir. Deneyler de Norveç fon tarafından ve Milli Eğitim Bakanlığı, gençlik ve spor Çek Cumhuriyeti tarafından denetimli çek-Norveç araştırma programı CZ09 tarafından desteklenen (sayı vermek: 7F14369).

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell cultivation
HeLaATCCCCL-2TM
ES-D3 [D3]ATCCCRL-11632TM
HeLa -Fucci cellshttp://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html
DMEMPAN-BiotechP03-0710
DMEM high glucoseSigma-AldrichD6429-500ML
Fetal bovine serum (FBS)HyCloneSV30180.03
ES Cell FBSGibco16141-079
Non-Essential Amino Acids (NEAA)Gibco11140-035
mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor)Merck MilliporeESG1107
MTG (1-Thioglycerol)Sigma-AldrichM6145-25ML
Penicillin-Streptomycin SolutionBioseraXC-A4122/100
Trypsin - EDTABioseraXC-T1717/100dilute with 1 × PBS in ratio 1:6
Nunclon cell culture dishesSigma-AldrichP7866cultivation of mESCs D3 cells
µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500Ibidi GmbH81166microscopic dish
0.2% GelatineSigma-AldrichG1890-100Gdilute in destille water and autoclaved
NameCompanyCatalog NumberComments
Cell transfection
GFP-p53 plasmidAddgene12091
mCherry-PCNA plasmidgenerous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt
mCherry-53BP1 plasmidAddgene19835
MetafeceteneBiontex Laboratories GmbHT020–2.0
10 × PBSThermo Fisher ScientificAM9625for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water
5-bromo-2’-deoxy-uridineSigma-Aldrich11296736001
NameCompanyCatalog NumberComments
Confocal microscopy
Microscope Leica TCS SP5Leica Microsystems
Microscope Leica TCS SP8Leica Microsystems
White-light laserLeica Microsystems
355-nm laserCoherent Inc.laser power 80 mW
405-nm laserLeica Microsystemslaser power 50 mW
NameCompanyCatalog NumberComments
Immunofluorescence staining
CoverslipVWR International Ltd631-1580
4% paraformaldehydeAffymetrix19943 1 LT
Triton X100MP Biomedicals2194854
Saponin from quillaja barkSigma-AldrichS4521
BSASigma-AldrichA2153
53BP1Abcamab21083primary antibody
AlexaFluore 647Thermo Fisher ScientificA27040secondary antibody
VectashieldVector Laboratories LtdH-1000mounting medium

Referanslar

  1. Cadet, J., Mouret, S., Ravanat, J. L., Douki, T. Photoinduced damage to cellular DNA: direct and photosensitized reactions. Photochem Photobiol. 88 (5), 1048-1065 (2012).
  2. Cooke, M. S., et al. Immunochemical detection of UV-induced DNA damage and repair. J Immunol Methods. 280 (1-2), 125-133 (2003).
  3. Lahtz, C., et al. Gamma irradiation does not induce detectable changes in DNA methylation directly following exposure of human cells. PLoS One. 7 (9), e44858 (2012).
  4. Cremer, T., et al. Detection of chromosome aberrations in the human interphase nucleus by visualization of specific target DNAs with radioactive and non-radioactive in situ hybridization techniques: diagnosis of trisomy 18 with probe L1.84. Hum Genet. 74 (4), 346-352 (1986).
  5. Zorn, C., Cremer, T., Cremer, C., Zimmer, J. Laser UV microirradiation of interphase nuclei and post-treatment with caffeine. A new approach to establish the arrangement of interphase chromosomes. Hum Genet. 35 (1), 83-89 (1976).
  6. Bartova, E., et al. Recruitment of Oct4 protein to UV-damaged chromatin in embryonic stem cells. PLoS One. 6 (12), e27281 (2011).
  7. Stixova, L., et al. HP1beta-dependent recruitment of UBF1 to irradiated chromatin occurs simultaneously with CPDs. Epigenetics Chromatin. 7 (1), 39 (2014).
  8. Stixova, L., et al. Advanced microscopy techniques used for comparison of UVA- and gamma-irradiation-induced DNA damage in the cell nucleus and nucleolus. Folia Biol (Praha). 60, 76-84 (2014).
  9. Luijsterburg, M. S., et al. Heterochromatin protein 1 is recruited to various types of DNA damage. J Cell Biol. 185 (4), 577-586 (2009).
  10. Bartova, E., et al. Coilin is rapidly recruited to UVA-induced DNA lesions and gamma-radiation affects localized movement of Cajal bodies. Nucleus. 5 (3), 460-468 (2014).
  11. Franek, M., et al. Advanced Image Acquisition and Analytical Techniques for Studies of Living Cells and Tissue Sections. Microsc Microanal. 22 (2), 326-341 (2016).
  12. Lemmer, P., et al. Using conventional fluorescent markers for far-field fluorescence localization nanoscopy allows resolution in the 10-nm range. J Microsc. 235 (2), 163-171 (2009).
  13. Reits, E. A., Neefjes, J. J. From fixed to FRAP: measuring protein mobility and activity in living cells. Nat Cell Biol. 3 (6), E145-E147 (2001).
  14. Lakowitz, J. R. . Principles of Fluorescence Spectroscopy. , (2006).
  15. Piston, D. W., Kremers, G. J. Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly. Trends Biochem Sci. 32 (9), 407-414 (2007).
  16. Levitt, J. A., Matthews, D. R., Ameer-Beg, S. M., Suhling, K. Fluorescence lifetime and polarization-resolved imaging in cell biology. Curr Opin Biotechnol. 20 (1), 28-36 (2009).
  17. Shimomura, O., Johnson, F. H., Saiga, Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea. J Cell Comp Physiol. 59, 223-239 (1962).
  18. Iwabuchi, K., Bartel, P. L., Li, B., Marraccino, R., Fields, S. Two cellular proteins that bind to wild-type but not mutant p53. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (13), 6098-6102 (1994).
  19. Ward, I. M., Minn, K., van Deursen, J., Chen, J. p53 Binding protein 53BP1 is required for DNA damage responses and tumor suppression in mice. Mol Cell Biol. 23 (7), 2556-2563 (2003).
  20. Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. M. Histone-GFP fusion protein enables sensitive analysis of chromosome dynamics in living mammalian cells. Curr Biol. 8 (7), 377-385 (1998).
  21. Walter, J., Schermelleh, L., Cremer, M., Tashiro, S., Cremer, T. Chromosome order in HeLa cells changes during mitosis and early G1, but is stably maintained during subsequent interphase stages. J Cell Biol. 160 (5), 685-697 (2003).
  22. Sakaue-Sawano, A., et al. Tracing the silhouette of individual cells in S/G2/M phases with fluorescence. Chem Biol. 15 (12), 1243-1248 (2008).
  23. Sorokin, D. V., et al. Localized movement and morphology of UBF1-positive nucleolar regions are changed by gamma-irradiation in G2 phase of the cell cycle. Nucleus. 6 (4), 301-313 (2015).
  24. Vogel, S. S., Nguyen, T. A., van der Meer, B. W., Blank, P. S. The impact of heterogeneity and dark acceptor states on FRET: implications for using fluorescent protein donors and acceptors. PLoS One. 7 (11), e49593 (2012).
  25. Foltankova, V., Matula, P., Sorokin, D., Kozubek, S., Bartova, E. Hybrid detectors improved time-lapse confocal microscopy of PML and 53BP1 nuclear body colocalization in DNA lesions. Microsc Microanal. 19 (2), 360-369 (2013).
  26. Suchankova, J., et al. Distinct kinetics of DNA repair protein accumulation at DNA lesions and cell cycle-dependent formation of gammaH2AX- and NBS1-positive repair foci. Biol Cell. 107 (12), 440-454 (2015).
  27. Bártová, E., et al. PCNA is recruited to irradiated chromatin in late S phase and is most pronounced in G2 phase of the cell cycle. Protoplasma. , (2017).
  28. Krejci, J., et al. Post-Translational Modifications of Histones in Human Sperm. J Cell Biochem. 116 (10), 2195-2209 (2015).
  29. Chou, D. M., et al. A chromatin localization screen reveals poly (ADP ribose)-regulated recruitment of the repressive polycomb and NuRD complexes to sites of DNA damage. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (43), 18475-18480 (2010).
  30. Sustackova, G., et al. Acetylation-dependent nuclear arrangement and recruitment of BMI1 protein to UV-damaged chromatin. J Cell Physiol. 227 (5), 1838-1850 (2012).
  31. Smirnov, E., et al. Separation of replication and transcription domains in nucleoli. J Struct Biol. 188 (3), 259-266 (2014).
  32. Bastiaens, P. I., Squire, A. Fluorescence lifetime imaging microscopy: spatial resolution of biochemical processes in the cell. Trends Cell Biol. 9 (2), 48-52 (1999).
  33. Day, R. N. Measuring protein interactions using Forster resonance energy transfer and fluorescence lifetime imaging microscopy. Methods. 66 (2), 200-207 (2014).
  34. Konig, K., Uchugonova, A., Breunig, H. G. High-resolution multiphoton cryomicroscopy. Methods. 66 (2), 230-236 (2014).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

H cresel biyolojisay 129DNA hasarconfocal mikroskobuFLIM perdePCNA53BP1p53

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır