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요약

레이저 microirradiation는 살아있는 세포에서 DNA 수리의 연구에 대 한 유용한 도구입니다. 다양 한 DNA 병 변 유발 하 UVA 레이저의 사용에 대 한 방법론 접근 표시 됩니다. 우리 지역 microirradiation; 정상적인 세포 주기를 유지 하는 방법을 최적화합니다 따라서, 비친된 세포 유사 분열을 통해 진행합니다.

초록

레이저와 로컬 microirradiation 라이브 세포에서 DNA 복구 관련 프로세스의 연구에 대 한 유용한 도구를 나타냅니다. 여기, 우리가 로컬로 microirradiated chromatin에서 시간 또는 단백질 단백질 상호 작용을 통해 단백질 DNA 병 변에서 활동을 분석 하는 방법론 접근 방식을 설명 합니다. 우리 또한 세포 주기 세포 주기 의존적인 단백질 DNA 병 변에서 속도 론을 공부 Fucci 셀룰러 시스템을 사용 하 여 개별 단계를 인식 하는 방법을 보여 줍니다. 2 자외선 레이저를 사용 하 여의 방법론 설명 (355 nm, 405 nm) 다른 유형의 DNA 손상 유도 하는 것 또한 제공 됩니다. 만 405 nm 다이오드 레이저 셀 microirradiated 유사 분열을 통해 정상적으로 진행 하 고 cyclobutane pyrimidine 이합체 (CPDs) 없는 했다. 우리는 또한 어떻게 microirradiated 셀 관심의 내 생 단백질의 immunodetection를 수행 하기 위해 주어진된 시간에 고쳐질 수 있다 보여줍니다. 또한 생물 방법 FRAP (복구 후 Photobleaching 형광) 및 FLIM (형광 일생 화상 현미경 검사 법)를 포함 하 여 자연 발생 된 셀에서의 사용 설명 DNA 수 선 연구, DNA 손상 포커스. 우리는 또한 단백질 단백질 상호 작용의 실험 연구에 FLIM-무서 워 (형광 공명 에너지 전송)의 응용 프로그램을 보여줍니다.

서문

구성 된 cyclobutane pyrimidine 이합체 (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine, 및 단일 가닥 DNA 변의 모양을 이끌어 DNA 손상 또는 더블-스트랜드 나누기1,2. Γ 광선은 높은 에너지와 높은 penetrance 이온화 방사선의 형태, 따라서 방사선의이 소스는 방사선 치료3에서 널리 이용 된다. 다른 한편으로, 실험적으로 UV 레이저 모방 자연 UV 빛에 노출으로 인 한 DNA 손상을 유도 한다. 현미경 방법으로 UVA microirradiation은 개별 살아있는 세포에서 DNA 손상 연구 실험 도구를 나타냅니다. Microirradiation은 염색체 지구4,5의 조직 공개 40 년 전에 처음으로 사용 되었다. 이 기술은 매우 중 confocal 현미경의 기능 특성 또는 현대 nanoscopy의 기술적인 한계에 종속 됩니다. DNA 병 변을 유도 하 세포 5' bromodeoxyuridine (BrdU) 또는 Hoechst 33342 UV 조사 전에 presensitized 수 있습니다. Bártová 외. 6 이전 presensitization 단계를 설명 하 고 최근 우리 세포 죽음, 또는 apoptosis를 피하기 위하여이 microirradiation 기술에 최적화 된. 예를 들어 (Hoechst 33342 presensitization) 없이 405 nm 자외선 레이저를 사용 하 여 53BP1-긍정적인 이중 가닥 틈 (DSBs)의 유도 cyclobutane pyrimidine 이합체 (CPDs)의 비용으로 리드. 다른 한편으로, UV microirradiation와 함께 presensitization 단계 유도 CPDs과 DSBs의 매우 높은 수준을 동시에7,8. 이 방법은 단일 DNA 수 선 통로의 연구에 적용 하기가 어렵습니다.

Microirradiation, 단백질 모집, 활동, 및 살아있는 세포 병 변 DNA에서 상호 작용 분석 가능 하다. 이 방법의 예로 Luijsterburg 그 외 여러분 에 의해 출판 되었음 9 섬으로 단백질 1β, 그리고 우리에 대 한 최근 pluripotency 요소 Oct4 Cajal 몸, coilin와 관련 된 단백질 DNA UV 유도 된 병 변6,10모집은 처음으로 나타났다. 단백질이 DNA 병 변에서 활동 또한 FRAP (복구 후 Photobleaching 형광)11,,1213 를 사용 하 여 공부 될 수 있다 또는 (형광 공명 에너지 전송) 기술14 무서 워 ,15. 이러한 방법은 병 변 DNA 또는 단백질 단백질 상호 작용 단백질의 간단한 확산을 가능성이 있다. 단백질의 추가 특성에 대 한 유용한 도구가입니다 FLIM (형광 일생 화상 현미경) 또는 그것의 함께 무서 워 기술 (무서 워-FLIM)16. 이 메서드는 셀을 안정적으로 생활 또는 형광 분자17에 의해 표를 붙인 관심사의 단백질을 뚜렷이 표현 프로세스의 연구를 사용. 여기, GFP 태그 p53 단백질 및 그것의 상호 작용 협동자, mCherry 태그 53BP1, DNA 손상 응답18,19 에 있는 중요 한 역할에 대 한 지 수 감퇴 시간 (τ)의 예가 표시 됩니다. 매개 변수 τ FLIM 계산에서 제공 하는 형광 색소의 일생은 주어진된 형광 염료, 그것의 바인딩 능력 및 그것의 세포질 환경에 대 한 특정 이다. 따라서,이 방법은 표시할 수 있습니다 우리 단백질 부분 모집단, 그들의 바인딩 능력, 및 그들의 기능 속성 사이의 구분 후, 예를 들어 DNA 손상.

여기, 우리의 실험실에 시간 특정 단백질 모집, 속도 론, 확산, 및 microirradiated chromatin의 사이트에서 단백질 단백질 상호 작용을 공부 하는 데 사용 되는 고급 현미경 기술의 방법론 접근의 개요 제공 됩니다. 살아있는 세포에서 로컬 DNA 변의 유도 및 UV 레이저에 의해 발생 하는 로컬 유발된 DNA 병 변에서 DNA 손상 관련 이벤트의 연구에 대 한 유용한 방법론의 설명에 대 한 단계별 방법을 제공 합니다.

프로토콜

1. 재배의 셀 라인

  1. 헬러 파생 셀 라인
    참고: 사용 헬러 자 궁 경부 암 세포: 히스톤 H2B 안정적으로 표현 하거나 HeLa 세포 GFP 또는 헬러 Fucci 셀 RFP Cdt1 표현 태그 g 1와 이른 S 단계 및 GFP geminin S/g 2-M 단계 ( 그림 1)에서
    1. 모든 헬러 파생 셀 라인의 경작, 사용 Dulbecco ' s 수정이 글 ' s 매체 (DMEM) 10% 태아 둔감 한 혈 청 및 5% CO 2를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 적절 한 항생제와 보충. 대체 매체 2-주 당 3 번.
    2. 문화 매체를 제거 하 고 씻어 트립 신 억제제를 포함 하는 혈 청의 모든 흔적을 제거 하기 위해 1 x PBS를 사용 하 여 셀. 실 온에서 생물 학적 후드에이 단계를 수행.
    3. 셀 레이어 커버 prewarmed 트립 신-EDTA 솔루션의 1 mL을 추가 하 고 셀 계층 분산 (일반적으로 3-5 분) 때까지 37 ° C. Trypsinize 세포에서 세포를 유지.
    4. 트립 신-EDTA, 비활성화를 prewarmed 완전 한 성장 매체의 3 mL를 추가 하 고 부드럽게 여러 번 pipetting으로 매체를 분산.
      참고:이 절차 수행 해야 생물 학적 후드에서 오염 물질에서 연산자를 보호 하 고 최적의 세포 배양 조건을 유지 하기 위해.
    5. Count 셀 자동 셀 카운터 또는 Bürker 챔버를 사용 하 여. 새로운 요리에 세포 현 탁 액 1 × 10 5 셀/mL를 피펫으로 5ml를 희석. 37 ° C, 5% CO 2에서 셀을 품 어.
  2. 마우스 배아 줄기 세포 (mESCs), D3 셀 라인의
    1. 셀에 문화 mESCs 문화 요리 0.2% 젤라틴 및 mESC 유지 보수 매체와 코팅. 37 ° C, 5% CO 2에서 셀을 품 어.
      참고: 50 mL aliquots에 mESCs 재배/유지 보수 매체를 준비 하 고 2-8 ° C에서 최대 2 주 동안 그것을 저장 것이 좋습니다. MESC 매체 포함 75 mL ES 세포 FBS, 5 mL 페니실린 G와 스, 5 mL 비 필수 아미노산 (10mm) (최종 농도 0.1 m m), 50 µ L 마우스 백혈병 억제 인자 (mLIF; 100 µ g/mL) (최종 농도 10 ng/mL), 430 µ MTG (1-L Thioglycerol; DMEM에 1: 100 희석) (최종 농도 100 µ M)과 높은 포도 당 DMEM 매체를 500 mL.
    2. MESC 재배 매체 문화 접시에서 발음 및 1 x PBS와 한 번 셀 린스.
    3. 0.5 mL 트립 신-EDTA를 추가 하 고 셀 접시에서 분리할 때까지 그냥 37 ° C에서 품 어. 그런 다음은 트립 신 15% 태아 둔감 한 혈 청으로 보충 mESC 재배 매체의 2 mL로 세포 세척 하 여 비활성화.
    4. 문화 접시에서 나머지 셀을 꺼내 려 하는 피 펫을 사용.
      참고: 그것은 단일 세포를 얻기 위해 중요 한 세포 덩어리는 세포의 분화 촉진 하기 때문에.
    5. 분할 세포 mESC 유지 보수 매체와 gelatinized 요리에 1시 10분.
      참고: mESC 세포의 밀도가 너무 낮은 경우에, 그들은 성장 하지 않는다. 차별화 추진 밀도가 너무 높은 경우.
    6. 확인 mESCs 4 개의 새로운 요리에 한 페 트리 접시에서 세포를 분할 하 여 두 번째 매일 mESC 통로 수행 하 여 미 분화 상태로 유지 됩니다. MESC 식민지 100 배 또는 200 배 확대, 거꾸로 현미경으로 검사 하 고, 증거가 있다 자발적인 mES의 세포 분화, Oct4 단백질 소모를 평가 하는 서쪽 오 점 수행.
      참고: 최적의 셀 뿌리고, 함께 체 외에 mESCs의 자발적인 차별화 감소 될 수 있다.

2. 세포 Transfection

  1. 종자 세포 gridded 현미경 요리 실험 하기 전에 48 h (직경 35 m m) 페 트리 접시에 그들의 좌표에 따라 microirradiated 셀을 찾기 위해.
    참고:이 예제는 microirradiation에는 첫 번째 실험 단계 이며 immunostaining은 두 번째 ( 그림 2A).
    1. 시드를 사용 하 여 5 × 10 4 셀/mL의 농도 헬러 파생 셀 라인 (또는 1 × 10 4 셀/mL D3 mES 셀). 요리 당 2 mL 전체 매체 사용 합니다. 재배와 microirradiation, 동안 37 ° C, 5% CO 2는 온도 또는 재배 실에 셀 유지.
    2. 자동 셀 카운터를 사용 하 여 계산 셀.
      참고: 셀의 높은 농도 사용 하지 마십시오. D3 mESCs의 밀도가 포장된 식민지, 특히의 경우 높은 세포 밀도 immunostaining 후 로컬 microirradiated 세포의 식별 방지.
  2. 다음과 같이 선택의 플라스 미드 DNA 및 transfection 시 약 준비. 선택 된 플라스 미드 DNA의 2-3 µ g를 사용 하 여 솔루션을 준비 (자세한 내용은 테이블의 자료 참조)와 150 µ L 1 x PBS. 솔루션 B 150 µ L 1 × PBS에 3.5 µ L transfection 시 약을 사용 하 여 준비 합니다. 각 솔루션 주의 pipetting으로 잘 혼합 되도록.
    참고: DNA와 transfection 시 약의 최적 비율 실험적으로 결정 되어야 각 셀 라인 및 개별 플라스 미드.
  3. 뚜렷이 transfected 삶의 실험 관찰 하기 전에 h 24에 셀 결합 솔루션 및 솔루션 B vortexing 없이. 15-20 분 동안 실내 온도에 결합 된 솔루션을 품 어. Dropwise 방식에서 균질 분산이 현미경 접시에 성장 셀 레이어에 transfection 혼합물 (300 µ L, 2.2에서 설명한 점으로) 완료.
    4. 37 ° C에서 4-6 시간, 5% CO 2
  4. 품 셀은 신선한 매체 transfection 혼합물을 다음 바꿉니다. 표준 조건 하에서 세포를 배양.
    참고: 405 nm 레이저를 사용할 때 셀 모든 시 약을 presensitize 하지 않습니다 하지만 355 nm 레이저를 사용할 때 수행 10 µ M 5-브로 모-2와 셀 presensitization '-의하여-uridine (BrdU) 7 , 8 . Presensitization 시간 세포 유형과 세포 주기의 길이에 따라 달라 집니다. 헬러 세포 추가 BrdU 로컬 microirradiation 전에 16 ~ 20 h. MESCs, 경우 추가 BrdU microirradiation 전에 6 ~ 8 h.

3. 로컬 DNA 변과 Confocal 현미경 검사 법의 유도

  1. 접시 현미경 스테이지에 놓고 접시에 선택한 셀의 위치를 기록, 셀 좌표 추가 분석을 위해 필요한 것입니다 ( 그림 2A -c).
  2. 숫자 또는 문자 ( 그림 2A d-f, 광고 표시 패널 Ae와 Af 확대는 셀의 위치에에서 화살표) 광장에서 transfected 셀을 찾을. 밝은 분야 현미경 검사 법을 사용 하 여 셀의 이미지를 가져오고는 셀 및 레이블이 광장 ( 그림 2A)의 위치를 식별 하기 위해 형광 이미지를 획득.
  3. 조사 하기 전에 이미지 수집, confocal 현미경에 연결 된 흰색 빛 레이저 (WLL) (1 nm 단위로 470-670 nm) (또는 다른 사용 가능한 레이저는 conf에 연결 사용로컬 현미경).
  4. 다음 설정을 사용 하 여: 512 × 512 픽셀의 해상도, 픽셀 크기 64 nm, 400 Hz, 양방향 모드 (두 방향으로 스캔), 평균 세트 8, 8 x 12 엑스 줌
    참고: 선 평균이 나타냅니다 주어진된 수를의 검사; 같은 줄의 다음 줄으로 계속 하기 전에 여러 번 검색 합니다. 모든 라인의 스캔 이미지의 마지막 프레임을 생산 반복.
  5. 이미지 관찰 및 인수 사용 하 여 63 × 오일 목표 1.4의 조리개 수치와 및 형광 이미지를 순차적으로 취득. 적절 한 소프트웨어의 순차 스캔 모드를 사용 하 여 두 개의 형광 사이 크로스 토크 제거.
    참고: 모든 현미경 소프트웨어 소위 순차 스캔 모드의 설정을 수 있습니다. 연산자는 형광을 확보 여부를 선택할 수 있습니다 ' 정보 동시에 (예를 들어, 빨강-녹색-파랑 형광에서) 언급 했 듯이 여기에, 개별적으로 또는 (순차적으로), 형광 색소에 의해 형광 색소. GFP에 대 한 최대 여기/방출 395/509는 일반 정보를 고려 및 mCherry에 대 한 최대 여기/방출은 587/610 nm ( 그림 2B에서 여기에서 사용 하는 형광을 참조). 이 정보에 따라에 적당 한 흥분 및 원하는 형광 방출 필터 선택 하십시오. 필터 선택과 절차를 스캔 각 confocal 현미경 최적화 해야 합니다.
  6. DNA 변의 스캔 모드, 64 사용 하 여 선 유도 WLL 끄고 (에서 ' 수집 ' 모드), 외부 자외선 소스에 전환 (에 " UV 레이저 " 버튼), 관심 (ROI)의 영역 설정 (에서 ' 수집 ' 모드), 355 nm를 설정 100% 전원 레이저 또는, 또는, 405 nm 레이저 소스를 사용 하 여.
    참고: 일반적으로, 레이저 파워 이미지 수집 모드에서 적절 한 레이저 조정 버튼으로 조정 됩니다.
  7. 로컬 microirradiation 근처 UVA 스펙트럼에서 방출 하는 레이저를 사용. 투자 수익; 외부 레이저 강도 조절 하는 이미지 수집 모드에서 0으로 배경을 설정 하는 핵에 있는 투자 수익의 microirradiation 및 캡처 이미지 경우 셀 제대로 반구, GFP 히스톤 H2B의 신호, 사라지고, 방사선 조사 후 즉시 mCherry 태그 PCNA 단백질 DNA 병 변에 보충 수는 예를 들어 ( 그림 2B와 비디오 1 ).
    참고: DNA 상해 confocal 섹션도 3 차원 (3D) 프로젝션 (참조 3D 회전 및 x-y, x-z, y z 예측 그림 2C와 비디오 2)에 표시 한 투자 수익에 유도 한다. 에 대 한 설명은 355 nm 405 nm 레이저에 대 한 완전 한 기술적인 매개 변수, 참조 Stixová 외. 7
  8. 후 ROI를 반구, 끄고 외부 자외선 소스, ROI를 끄고는 WLL에 스위치, 8, 스캔 라인 변경 및 방사선에 대 한 다른 셀을 찾을. ROI 선택 단추 사용 하 여 해당 소프트웨어에서 ' s 이미지 수집 모드.
    참고: mCherry PCNA 2와 20 분 ( 그림 2B) 사이의 DNA 병 변에서 최대 축적 피크를 있다. 외 인 단백질 수준에서 결과 확인 하려면 로컬 microirradiation 후 즉시 얼룩 면역 형광 검사 진행. 관심에 따라 방사선 조사 시간 간격을 선택 합니다.
  9. 확인 외 인 단백질의 축적 microirradiated 세포의 대다수에서 검출 될 수 있다. 이 확인에 대 한 기준을 사용 하 여 다음 단계에서.
    1. 확인 정도 transfected 세포 외 인 단백질의 아무 overexpression입니다. 가능한 솔루션으로, 형광 성 단백질 (예를 들어, mCherry-PCNA 또는 mCherry 53BP1)의 약한 식만 있는 셀 선택.
    2. 평가 WLL 노출 이미지 취득에 사용의 phototoxicity.
      참고: phototoxicity 테스트, 장기간된 레이저 microirradiation transfected 세포 노출과 그림 3A에서와 같이 세포 유사 분열을 진행 확인 -B. 가능한 솔루션으로, 스캔 시간 및 셀 당 confocal 조각 수 절감, 최적의 축 단계 (0.3 µ m 권장)의 선택에 의해 3D 스캐닝 최적화 하 고 레이저를 설정 ' 그것의 최소한 s 힘. 또는, phototoxicity 재배 매체에 용 해 되는 Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic 산, 수용 성 비타민 E 아날로그)를 사용 하 여 제거할 수 있습니다. DNA 손상 관련 실험에 대 한 자외선에 대 한 그것의 보호 효과 Trolox의 사용 하 여 권장 되지 않습니다.
    3. 355 nm 레이저 조사, 경우 확인 BrdU BrdU 법인에서 적절 한 BrdU 탐지 항 체를 사용 하 여 충분 한 통합 키트 (재료의 표 참조). BrdU는 세포 주기의 S 단계 동안 DNA에 통합 되어, 이후 셀의 대다수 presensitization 동안 S-단계를 통해 진행 해야 합니다. 고려은 셀 세포 주기의 길이 가능한 솔루션으로 서 특정.
    4. 분석 여부는 DNA 복구 관심의 단백질 phase(s) 특정 세포 주기에서 DNA 장애를 인식 하는 기능이 있다. 가능한 해결책: DNA 병 변 선택 된 단백질의 신규 모집은 특정 세포 주기 단계 (G1/S/G2) 제한 확인, 헬러 Fucci 셀을 사용 합니다. 이러한 셀이 GFP 태그 geminin S/g 2-M 세포 주기 단계 22 ( 그림 1)를 표현 하는 G1 및 이른 S 단계 RFP Cdt1.
    5. Apoptosis, 세포 죽음을 피하기 위해 적절 한 레이저 소스를 선택 하 고 전원 설정 23 레이저. 세포 반구 유의 유사 분열을 진행 해야 합니다 ( 그림 3A -B, 비디오 3).
      참고: 원하지 않는 apoptosis Annexin V 양성, caspase 3, 또는 lamin B 분열 하 여 검색할 수 있습니다. 형태학 상 수준에 세포 분리 및 apoptotic 시체의 형성을 표시 됩니다.

4. 면역 형광 검사 얼룩

  1. 1 × PBS 짧게 (현미경 요리에서 성장) 셀 레이어를 헹 구 고 rinsing 후, 실 온에서 4% 포름알데히드 (헬러 파생 셀 라인)에 대 일 분 또는 20 분 (대 한 D3 ES 세포)를 사용 하 여 셀을 수정. 1 × PBS 가진 접시 린스.
    주의: 포름알데히드 심각한 눈 손상의 원인, 알레르기 성 피부 반응을 일으킬 수 이며 또한 잠재적인 발암 물질; 따라서, 포 름 알 데히드와 모든 실험 단계 추출기 후드에서 수행 되어야 합니다.
    참고: 불필요 한 표백 형광 신호를 방지 하려면 저장 요리 어두운 챔버에 면역 형광 염색에 필요한 보육 시간 동안.
  2. 0.1% 트라이 톤 X-100 H 2 O 8 분에 녹아 세포를 permeabilize 고 다음 0.1%와 0.1% 사포닌을 포함 하는 1 × PBS와 12 분에 대 한 셀을 품 어 트라이 톤 X-100. 부 화, 후 씻어 1 × PBS 15 분에 대 한 두 번 셀
  3. 1 × 난다 바인딩을 선택 된 항 체를 차단 하는 60 분에 대 한 PBS에에서 1 %BSA 품 셀. 부 화 후 15 분 동안 1 × PBS에에서 세포를 씻어.
  4. Dilute 1: 100 (또는 1: 200)의 비율로 1 차적인 항 체 (이 단계 o 되어야 합니다개별 항 체에 대 한 ptimized) 1 × PBS에서에서 1 %BSA 접시, 당 25 µ L이 솔루션을 사용 하 고 커버는 coverslip로 셀. 솔루션 4 하룻밤 습도 챔버에 1 차적인 항 체를 포함 하는 셀을 품 어 ° c.
  5. 다음 날에 씻어 1 × 2 시간 5 분 대 한 PBS에 셀
  6. 1: 100 (또는 양자 택일로 1: 200) 1 × PBS, 1 %BSA이 솔루션의 100 µ L를 사용 하 여 요리, 당의 비율에서 이차 항 체를 희석 하 고 커버는 coverslip로 셀. 60 분에 대 한 2 차 항 체를 포함 하는 솔루션으로 셀을 품 어. 부 화, 후 씻어 1 × 3 시간 5 분 대 한 PBS에에서 셀
  7. 장착 매체의 드롭 coverslip 탑재 하 고 매니큐어와 현미경 관찰 동안 건조 하 고 움직임을 방지 하기 위해 접착제 coverslip 인감. 4 어둠 속에서 요리를 저장 ° c.

5. 형광 일생 이미지 (FLIM) 현미경

  1. 시작은 FLIM 소프트웨어. 열기는 " 스위트 " 소프트웨어의에 스위치는 " FLIM " 모드. WLL 펄스 모드에서 작동할 다는 것을 확인.
    참고: 연산자는 펄스 모드를 도달 하는 하드웨어 단추를 전환 해야 합니다.
  2. 지역 microirradiation, 동안으로 동일한 방향에서 현미경 스테이지 (섹션 4에에서 스테인드) 스테인드 세포를 포함 하는 접시 놓고 페 트리 접시에 격자에 비친된 셀을 찾을 합니다. Confocal 현미경 이미지 수집 수행.
    참고: 다음 설정을 사용 하 여: 1024 × 1024 픽셀, 400 Hz, 양방향 모드, 16 라인 엑스 12 8 x 줌
  3. FLIM 측정을 시작 하기 전에 예비 테스트 클릭 하 여 지 수 감퇴의 실시간 기록 표시를 수행 " 설치 FLIM "와 " 인수 "를 눌러 " 실행 FLIM 테스트 ". 다음과 같이 두 가지 주요 매개 변수를 평가 하 여 샘플 FLIM 매개 변수를 최적화 합니다.
    1. 여기 파장 WLL의 반복 속도 조정 샘플의 수명에 최적화 (아래 참고 참조). 공초점 현미경 소프트웨어에서 적절 한 단추를 일반적으로 불리는와 레이저 강도 조정 " 레이저 조정 설정 "에 ' 이미지 수집 ' 메뉴. 다음, FLIM 소프트웨어를 사용 하 여 감퇴 곡선 (또는 모든 광자 수를 보여주는 히스토그램) 계산 ( 그림 4A 참조 -B).
      참고: 여기에 대 한 펄스 모드로 WLL을 사용 합니다. 소프트웨어를 갖추고 있어야 합니다 펄스 선택 WLL, 반복 속도 선택할 수에 대 한 (80, 40, 20, 또는 10 MHz). GFP, 형광 기증자의 경우 흥분 파장은 488 nm. 감퇴 곡선 FLIM 소프트웨어 작업 영역을 사용 하 여 기록 됩니다. 매개 변수 (τ D, τ 다) 지 수 감퇴 시간 표시 (예, 형광 색소 평생); 매개 변수 (A) 형광 색소 감퇴의 진폭을 나타냅니다 (FLIM p53 GFP 태그와 mCherry 태그 53BP1 그림 4A에 대 한 데이터의 예를 참조 -B).
    2. 는 소프트웨어 수집 도구 (선택 반복 속도 모드)를 사용 하 여 카운트 반복 속도 확인 합니다. 샘플;에 밝은 픽셀을 선택 밝은 픽셀에 대 한 곡선 전체 형광 강도의 10% 미만 이어야 합니다.
  4. 클릭 " 측정 "를 누르고 " 실행 FLIM ".

6. 기증자 수명을 FLIM 스크립트 및 효율 계산 무서 워를 사용 하 여

  1. 무서 워 FLIM 소프트웨어를 시작 하 고 열은 ' 기증자 ' 작업 영역.
  2. 선택은 " 분석 " / " 이미지 " 메뉴에서 탭을 클릭 하 여 FLIM 스크립트 시작 " 시작 ". 최적의 무서 워 FLIM 설정에 대 한 잘 알려진 상호 작용 단백질 파트너 사용.
    참고: 잘 알려진 상호 작용에 대 한 무서 워 FLIM 효율 파트너 GFP p53 그리고 mCherry 53BP1 (34.1 ± 2.3) % ( 그림 4C).
  3. 기증자 방출 채널 (채널 1 또는 2) 및 보도를 사용 하 여 " 계산 빠른 FLIM ".
    참고: 이미지 및 그래프 모두 업데이트 됩니다.
  4. 에 무서 워 FLIM 소프트웨어 강도 규모 설정 (0-4000 카운트)와 평생 스케일 (0-5 ns) 소프트웨어에서 수동으로. 이 방법의 셀을 시각화 하 고 무서 워 FLIM 측정 설정.
    참고:이 설정은 제거 세포 인구에서 개별 셀 간에 형광 강도 차이.
  5. 부패 형태로 피팅 모델 선택.
    참고: 좋습니다 n 지 수 reconvolution와 다양 한 모델 매개 변수 " n ". 최적의 맞춤은 다음 기준:는 장착 잘 감퇴 곡선 그리고 χ 2 오버레이 곡선-값이 1 ( 그림 4B).
  6. 선택은 " 임계값 " / " 사용 임계값 " 75 임계값을 설정 하 고. 시작 " 맞는 초기 ".
    참고: SPT64 소프트웨어 계산 무서 워의 부재의 평균 기증자 수명 (" 진폭이 중된 평균 수명 ", τ Av.Amp)

7. FLIM 무서 워 스크립트를 사용 하 여 무서 워 효율

  1. 기증자 또는 수락자 작업 영역을 선택 하 고 다음을 엽니다 " 분석 " | " 이미징 " | " 일생 초조해 이미지 ".
  2. 액티브 채널로 기증자를 선택 하 고 픽셀 비 닝 광자 수/픽셀에 따라 조정. 그런 다음 실행 하는 소프트웨어 모드 라는 " 계산 FastFLIM ". 이미지에서 광자 수/픽셀 낮은 경우 픽셀 Binning 4 포인트 증가.
  3. 강도 0으로 설정-200 개수와 평생을 0-5 ns.
  4. 활성화 " 사용 임계값 " 75의 임계값을 입력 하십시오.
  5. 피팅 모델을 설정 " 멀티 exp. 기증자 ", 모델 매개 변수를 입력 " n ", 입력 τ τ D로 Av.Amp (단계 6.6) 활성화 및 " 초기 맞는 ".
  6. 설정 매개 변수 Bkgr 12 월, IRF, 변화와 Bkgr 마크를 제거 하 여 상수 값을 IRF.
    참고: 가능한 일정 하 게 유지 하는 매개 변수의 대부분을 설정 합니다. 이 방법은 통계 동요를 감소 시킨다. 이 경우에, 누르지 마십시오 " 맞는 초기 " 다시. 다음 언급 한 매개 변수 설명: IRF 악기 응답 기능, BkgrDec = 지 수 맞추기, ShiftIRF에서에서 배경 = = 지 수 reconvolution 적합, BkgrIRF에서에서 IRF 근무 적합 지 수 reconvolution에서 IRF 배경 =. 모든 세 개의 매개 변수가 계산 되 고 추가 분석을 위해 소프트웨어를 사용 하 여 해결할 수 있습니다.
  7. 보도 " 계산 FRETŔ는 무서 워 (FLIM 이미지 영역에서 플롯) 이미지와 무서 워 효율 히스토그램 계산 되 고 무서 워 거리 히스토그램 플롯 ( 그림 4C). 이미지 분석 완료 되 면를 누릅니다 " 저장 결과 ".
    참고: 동안 무서 워 실험 그것은 형광 단백질 가역 전환 (밝은) 형광 비 형광 (어둠) 했으며 전시를 해야 하. 이 특성 불린다 " 깜박임 ", 무서 워 효율 (이 효과 대 한 설명 Vogerl 그 외 여러분에 의해 제공 된이 현상으로 영향을 24).

8. FRAP 분석

  1. 장소를 표시현미경 단계에 h 관심, 붙일 태그가 단백질 표현 transfected 세포 찾아서 표준 현미경 램프와 밝은 분야 현미경 검사 법을 사용 하 여 이미지 수집을 수행 (참조 그림 2Aa-b)와 형광 현미경 모드입니다.
    1. Confocal 현미경 (또는 선택 된 형광 색소에 따라 선택의 레이저)에 연결 된 흰색 빛 레이저 (WLL)를 사용 하는 이미지 수집에 대 한. 다음 설정을 사용 하 여: 512 × 512 픽셀, 1000 Hz, 양방향 모드, 선 평균 1, 8 x 12 엑스 줌
    2. (~ 10% 레이저 전력)에서 적어도 15 prebleaching 이미지와 이미지 수집 메뉴에 관심 (ROI)의 영역을 정의.
  2. Photobleaching 실험, 아르곤 레이저를 사용 하 여 (488 nm). 다음 설정을 적용: 프레임 해상도 512 × 512 픽셀, 1000 Hz, 양방향 모드, 엑스 10 8 x 줌
    참고: 488에서 일 하는 아르곤 레이저에 의해 흥분 수 형광 GFP, RFP, mCherry, 등 또는 514 nm.
  3. 는 FRAP 소프트웨어 모드 선택의 현미경의 사용. 아르곤 레이저를 설정 하는 동안 photobleaching, ' 레이저 조정 버튼을 사용 하 여 최대 s 힘. 10% 레이저 전력에서 0.256 s 간격으로 이미지 수집 수행.
    참고: 단계를 postbleaching에 대 한 선택의 confocal 현미경의 표준 이미지 수집 모드 사용. Photobleaching 후
    1. 모니터 형광 복구 시간 (최대 45-50 s 표백 절차 후).
      참고: 그림 4D 같이 53BP1 mCherry 태그에 대 한 photobleaching 후에 복구 시간 자발적인 DNA 병 변 및 UVA-방사선-유도 foci에서 구분 됩니다. mCherry-53BP1 UVA 병 변에서 자발적으로 발생 하는 DNA 복구 foci;에서 mCherry 53BP1 축적에 비해 빠르게 복구 참조 그림 4D 및 Foltankova 외. 25
  4. 현미경 소프트웨어 (또는 선택의 소프트웨어)에서 스프레드시트 데이터를 내보낼 및 통계 분석을 수행.

결과

고급 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여, DNA 병 변에서 mCherry 태그의 53BP1 및 mCherry PCNA 단백질의 축적을 관찰 합니다. 분석은 살아있는 세포의 지역 microirradiation에 의해 수행 되었습니다. 우리는 초기 S, g 1을 확인 하는 Fucci 셀룰러 시스템을 사용 하는 개별 세포 주기 단계에서 DNA 복구 관련 단백질의 핵 배포 패턴을 인식 하 고 셀의 G2 단계 주기 (그림 1

토론

현미경 검사 법 기술 연구 실험실에서 기본 도구를 나타냅니다. 여기, 단백질 모집의 연구에 대 한 사용 하는 방법에 대 한 간략 한 설명을 하 고 속도 론 DNA 병 변에서 선물 된다. 우리는 특히 살아있는 세포의 지역 microirradiation의 분야에서 우리의 실험 경험을 언급 하 고 우리가 FRAP 및 단백질-단백질 상호 작용 수락자 표백 무서 워28 에 의해 DNA 병 변 및 그것의 첨단에 의해 단백?...

공개

저자 아무 충돌 다는 것을 선언 합니다.

감사의 말

이 작품의 체코 공화국, 프로젝트 P302-12-G157 부여 기관에 의해 지원 되었다. 실험 또한 체코 노르웨이어 연구 프로그램 CZ09, 노르웨이 자금, 그리고 교육, 청소년 및 스포츠의 체코 공화국에 의해 감독에 의해 지원 되었다 (허가 번호: 7F14369).

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell cultivation
HeLaATCCCCL-2TM
ES-D3 [D3]ATCCCRL-11632TM
HeLa -Fucci cellshttp://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html
DMEMPAN-BiotechP03-0710
DMEM high glucoseSigma-AldrichD6429-500ML
Fetal bovine serum (FBS)HyCloneSV30180.03
ES Cell FBSGibco16141-079
Non-Essential Amino Acids (NEAA)Gibco11140-035
mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor)Merck MilliporeESG1107
MTG (1-Thioglycerol)Sigma-AldrichM6145-25ML
Penicillin-Streptomycin SolutionBioseraXC-A4122/100
Trypsin - EDTABioseraXC-T1717/100dilute with 1 × PBS in ratio 1:6
Nunclon cell culture dishesSigma-AldrichP7866cultivation of mESCs D3 cells
µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500Ibidi GmbH81166microscopic dish
0.2% GelatineSigma-AldrichG1890-100Gdilute in destille water and autoclaved
NameCompanyCatalog NumberComments
Cell transfection
GFP-p53 plasmidAddgene12091
mCherry-PCNA plasmidgenerous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt
mCherry-53BP1 plasmidAddgene19835
MetafeceteneBiontex Laboratories GmbHT020–2.0
10 × PBSThermo Fisher ScientificAM9625for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water
5-bromo-2’-deoxy-uridineSigma-Aldrich11296736001
NameCompanyCatalog NumberComments
Confocal microscopy
Microscope Leica TCS SP5Leica Microsystems
Microscope Leica TCS SP8Leica Microsystems
White-light laserLeica Microsystems
355-nm laserCoherent Inc.laser power 80 mW
405-nm laserLeica Microsystemslaser power 50 mW
NameCompanyCatalog NumberComments
Immunofluorescence staining
CoverslipVWR International Ltd631-1580
4% paraformaldehydeAffymetrix19943 1 LT
Triton X100MP Biomedicals2194854
Saponin from quillaja barkSigma-AldrichS4521
BSASigma-AldrichA2153
53BP1Abcamab21083primary antibody
AlexaFluore 647Thermo Fisher ScientificA27040secondary antibody
VectashieldVector Laboratories LtdH-1000mounting medium

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