Fortgeschrittene Mikroskopiertechniken der konfokalen zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen und die Kinetik bei DNA-Läsionen

Zusammenfassung

Laser Microirradiation ist ein nützliches Werkzeug für Studien zur DNA-Reparatur in lebenden Zellen. Ein methodischer Ansatz für die Nutzung der UVA Laser induzieren verschiedene DNA-Läsionen wird angezeigt. Wir haben eine Methode zur lokalen Microirradiation optimiert, die den normalen Zellzyklus unterhält; so fahren Sie bestrahlte Zellen durch Mitose.

Zusammenfassung

Lokale Microirradiation mit Lasern stellt ein nützliches Werkzeug für Studien zur DNA-Reparatur-bezogenen Prozesse in lebenden Zellen. Hier beschreiben wir einen methodischen Ansatz zur Analyse von Protein-Kinetik bei DNA-Läsionen über Zeit oder Proteinprotein Interaktionen auf lokal Microirradiated Chromatin. Wir zeigen auch, wie zu erkennen, einzelne Phasen des Zellzyklus mit dem Fucci zellulären System Zelle-Zyklus-abhängige Protein Kinetik bei DNA-Läsionen zu studieren. Eine methodische Beschreibung des Einsatzes von zwei UV-Lasern (355 nm und 405 nm), verschiedene Arten von DNA-Schäden zu induzieren auch vorgestellt. Nur die Zellen Microirradiated von 405 nm Diodenlaser führte normalerweise durch Mitose und waren frei von Cyclobutan Pyrimidine Dimere (CPDs). Wir zeigen auch, wie Microirradiated Zellen zu einem gegebenen Zeitpunkt auszuführende Immunodetection der körpereigene Proteine des Interesses behoben werden können. Für die DNA-Reparatur-Studien, beschreiben wir zusätzlich die Verwendung von biophysikalischen Methoden einschließlich FRAP (Fluoreszenz Erholung nach Immunofluoreszenz) und FLIM (Fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy) in Zellen mit spontan auftretender DNA Beschädigung Brennpunkte. Wir zeigen auch eine Anwendung der FLIM-FRET (Fluoreszenz Resonanz Energietransfer) in experimentellen Studien von Protein-Protein-Wechselwirkungen.

Einleitung

DNA-Schädigung führt zum Auftreten von bestehend aus Cyclobutan Pyrimidine Dimere (CPDs), 8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine und Einzel-Strang DNA-Läsionen oder Doppel-Strang bricht^1,2. Γ-Strahlen sind die Form von ionisierender Strahlung mit der höchsten Energie und hohe Penetranz, damit diese Quelle der Strahlung ist weit verbreitet in Strahlentherapie³. Auf der anderen Seite induziert experimentell DNA-Schäden durch UV-Laser imitiert natürliche Belichtung mit UV-Licht. UVA-Microirradiation darstellt als eine mikroskopische Methode, ein experimentelles Werkzeug zur Untersuchung von DNA-Schäden in einzelne lebende Zellen. Microirradiation wurde erstmals vor 40 Jahren verwendet, um die Organisation von Chromosom Regionen^4,5zu offenbaren. Diese Technik ist stark abhängig von entweder die funktionellen Eigenschaften der konfokalen Mikroskopen oder die technischen Grenzen des modernen Nanoskopie. DNA-Läsionen zu induzieren, können Zellen durch 5' Bromodeoxyuridine (BrdU) oder Hoechst 33342 vor UV-Bestrahlung presensitized. Bártová Et al. ⁶ zuvor beschrieben die presensitization Schritt, und vor kurzem haben wir diese Microirradiation-Technik zur Vermeidung von Zelltod oder Apoptose optimiert. Beispielsweise führt der Einsatz von 405nm UV Laser (ohne Hoechst 33342 Presensitization) zur Induktion von 53BP1-positiven Doppel-Strangbrüchen (DSB) auf Kosten von Cyclobutan Pyrimidine Dimere (CPDs). Auf der anderen Seite presensitization Schritte in Kombination mit UV-Microirradiation verursachen sehr hohe CPDs und DSB gleichzeitig^7,8. Diese Methodik ist schwierig, auf die Studie eines einzelnen DNA-Reparatur-Signalwegs anzuwenden.

Mit Microirradiation ist es möglich, Protein-Rekrutierung, Kinetik und Interaktion auf DNA-Läsionen in lebenden Zellen zu analysieren. Ein Beispiel für diese Methode wurde von Luijsterburg Et Al. veröffentlicht. ⁹ für Heterochromatin Protein 1β, und wir zeigten vor kurzem zum ersten Mal, das der Pluripotenz Faktor Oct4 und ein Protein assoziiert mit Cajal Körpern, coilin, UV-induzierten DNA-Läsionen^6,10eingestellt werden. Protein-Kinetik bei dieser DNA-Läsionen können auch untersucht werden, mit Hilfe der FRAP (Fluoreszenz Erholung nach Immunofluoreszenz)^11,12,13 oder FRET (Fluoreszenz Resonanz Energietransfer) Techniken^{14 ,15}. Diese Methoden haben das Potenzial, einfache Diffusion von Proteinen an DNA-Läsionen oder Protein-Protein-Wechselwirkungen zu offenbaren. Ein nützliches Werkzeug für zusätzliche Charakterisierung von Proteinen ist FLIM (Fluoreszenz Lifetime Imaging Microscopy) oder die Kombination mit Bund Technologie (Bund-FLIM)¹⁶. Diese Methoden ermöglichen die Untersuchung von Prozessen in lebenden Zellen, die stabil sind oder vorübergehend mit dem Ausdruck des Proteins des Interesses von ein fluoreszierendes Molekül¹⁷getaggt. Hier ist ein Beispiel für exponentielle Abfallzeit (τ) für GLP-Tags p53 Protein und seine Interaktionspartner, mCherry Verschlagwortet mit 53BP1, spielen eine wichtige Rolle im DNA-Schaden Antwort^18,19 . Der Parameter τ ist die Lebensdauer der Fluorochrom von FLIM Berechnungen zur Verfügung gestellt spezifisch für einen bestimmten Fluoreszenz-Farbstoff, seine Bindung-Fähigkeiten und seiner zellulären Umgebung. Daher kann diese Methode uns Unterscheidungen zwischen Protein Subpopulationen, ihre Bindung Fähigkeiten und ihre funktionellen Eigenschaften nach, z. B. DNA-Schäden zeigen.

Hier ein Überblick über die methodischen Ansätze der moderne Mikroskopiertechniken, die in unserem Labor verwendet wird, um Zeit-spezifischen Protein Rekrutierung, Kinetik, Diffusion und Protein-Protein-Interaktionen auf dem Gelände von Microirradiated Chromatin zu studieren wird vorgestellt. Die Schritt für Schritt Methode für die Induktion von lokalen DNA-Läsionen in lebenden Zellen und eine Beschreibung der Methoden, die nützlich für die Studien von DNA-Schäden im Zusammenhang mit Veranstaltungen im lokal induzierte DNA-Läsionen verursacht durch UV-Laser sind vorgegeben.

Protokoll

1. Anbau von Zell-Linien

1. HeLa-abgeleitete Zellinien
   Hinweis: Verwendung HeLa zervikalen Karzinomzellen: entweder stabil auszudrücken Histon H2B HeLa-Zellen mit dem Stichwort GLP oder HeLa-Fucci Zellen mit dem Ausdruck RFP-Cdt1 in der G1 und frühen S-Phase und GLP-Geminin in den S/G2-M-Phasen ( Abbildung 1).
   1. Für den Anbau alle HeLa-abgeleitete Zellinien verwenden Dulbecco ' s geändert Eagle ' s Medium (DMEM) mit 10 % fötalen Rinderserum und geeigneten Antibiotika bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO ₂ ergänzt. Ersetzen Sie das Medium 2 - 3 Mal pro Woche.
   2. Kulturmedium zu entfernen und spülen Sie die Zellen mit 1 X PBS, um alle Spuren des Serums zu beseitigen, die Trypsin-Inhibitor enthält. Führen Sie diesen Schritt in ein Biohazard-Haube bei Raumtemperatur.
   3. Fügen Sie 1 mL vorgewärmte Trypsin-EDTA-Lösung für die Zellschicht zu decken, und halten Sie Zellen bei 37 ° c Trypsinize Zellen bis Zellschicht (in der Regel 3-5 min) dispergiert wird.
   4. Fügen Sie 3 mL vorgewärmte komplette Wachstumsmedium, Trypsin-EDTA zu inaktivieren und verteilen das Medium durch mehrere Male sanft pipettieren.
      Hinweis: Dieses Verfahren muss durchgeführt werden in ein Biohazard Haube um den Bediener vor Verunreinigungen zu schützen und weiterhin optimale Zelle Anbaubedingungen.
   5. Graf Zellen unter Verwendung einer automatischen Zelle Zähler oder Bürker Kammer. Zellsuspension 1 × 10 ⁵ Zellen/mL und 5 mL Pipettieren in ein neues Gericht zu verdünnen. Inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C und 5 % CO ₂.
2. Anbau von embryonalen Stammzellen der Maus (mESCs), D3-Zell-Linie
   1. Kultur mESCs auf Zelle Kultur Gerichte mit 0,2 % Gelatine und mESC Wartung Medium beschichtet. Inkubieren Sie Zellen bei 37 ° C und 5 % CO ₂.
      Hinweis: Das mESCs Anbau/Wartung Medium in 50 mL Aliquote Zubereitung und Lagerung von es bei 2 bis 8 ° C für bis zu 2 Wochen wird empfohlen. Das mESC Medium enthält 75 mL ES Cell FBS, 5 mL Penicillin G und Streptomycin, 5 mL nicht-essentiellen Aminosäuren (10 mM) (Endkonzentration 0.1 mM), 50 µL Maus Leukämie Inhibitor Faktor (mLIF; 100 µg/mL) (Endkonzentration 10 ng/mL), 430 µL MTG (1) Thioglycerol; 1: 100 Verdünnung in DMEM) (Endkonzentration 100 µM) und hohe Glukose DMEM Medium bis zu 500 mL.
   2. Aspirieren mESC Anbau Medium aus der Kulturschale und spülen Sie die Zellen einmal mit 1 X PBS.
   3. 0,5 mL Trypsin-EDTA und bei 37 ° C inkubieren Sie einfach, bis die Zellen beginnen, aus der Schale lösen. Dann inaktivieren die Trypsin durch Waschen der Zellen mit 2 mL mESC Anbau Medium ergänzt mit 15 % fötalen Rinderserum.
   4. Verwenden eine Pipette, um die restlichen Zellen von der Kulturschale zu verdrängen.
      Hinweis: Es ist wichtig, einzelne Zellen zu erhalten, da Zelle Klumpen Differenzierung der Zellen fördern.
   5. Split Zellen 01:10 auf gelierenden Gerichte mit mESC Wartung Medium.
      Hinweis: Wenn die Dichte der mESC Zellen zu niedrig ist, sie nicht gut wachsen; Wenn die Dichte zu hoch ist, wird die Differenzierung gefördert.
   6. Stellen Sie sicher, dass mESCs in einem undifferenzierten Zustand beibehalten werden, indem Sie ausführen mESC Durchgang jeden zweiten Tag durch die Spaltung von Zellen aus einer Petrischale in vier neue Gerichte. MESC Kolonien mit einem inversen Mikroskop unter X 100 oder 200 X Vergrößerung zu inspizieren, und wenn es Beweise für spontane mES Zelldifferenzierung gibt, führen Western Blots Oct4 Protein Erschöpfung zu bewerten.
      Hinweis: Mit optimalen Zelle Passagierung, spontane Differenzierung des mESCs in Vitro reduziert werden.

2. Handy-Transfektion

1. Samen Zellen 48 h vor Experimenten auf gerasterten Mikroskopie Gerichte (Durchmesser 35 mm) um Microirradiated Zellen nach ihrer Koordinaten auf der Petrischale finden.
   Hinweis: Dies ist ein Beispiel, in welchem Microirradiation der erste experimentelle Schritt ist, und Immunostaining ist der zweite ( Abbildung 2A).
   1. Für die Aussaat, verwenden eine Konzentration von 5 × 10 ⁴ Zellen/mL für HeLa-abgeleitete Zellinien (oder 1 × 10 ⁴ Zellen/mL für D3 mES Zellen). Anwenden Sie bis zu kompletten Medium 2 mL pro Schale. Bei Anbau und Microirradiation pflegen Zellen in einem Thermostat oder Anbau Kammer bei 37 ° C und 5 % CO ₂.
   Anzahl Zellen mit einer automatischen Zelle Zähler
   2. .
      Hinweis: Verwenden Sie keine höhere Konzentration von Zellen. Insbesondere in dicht gepackten Kolonien von D3 mESCs, hohe Zelldichte verhindert eine Identifikation der lokal Microirradiated Zellen nach Immunostaining.
2. Plasmid DNA und Transfektion Reagenz der Wahl wie folgt vorbereiten. Lösung A mit 2 bis 3 µg des ausgewählten Plasmid DNA vorzubereiten (siehe die Tabelle der Materialien für Details) und 150 µL 1 X PBS. Lösung B mit 3,5 µL Transfection Reagens in 150 µL 1 × PBS vorzubereiten. Stellen Sie sicher, dass jede Lösung durch sorgfältige Pipettieren gut vermischt ist.
   Hinweis: Das optimale Verhältnis von DNA und Transfection Reagens muss empirisch bestimmt werden für jede Zelllinie und individuelle Plasmid.
3. Bei 24 h vor experimentellen Beobachtung vorübergehend transfizierten lebender Zellen verbinden Lösung A und Lösung B ohne aufschütteln. Inkubieren Sie die kombinierte Lösungen bei Raumtemperatur für 15-20 min. In gewissem Sinne tropfenweise, homogen verteilen das komplette Transfektion Mischung (300 µL, wie beschrieben in Punkt 2.2) auf der Zellschicht in der Mikroskopie Petrischale wachsen.
4. Inkubieren Zellen bei 37 ° C und 5 % CO ₂ für 4-6 h, ersetzen Sie die Transfektion Mischung durch frisches Medium. Zellen unter normalen Bedingungen zu kultivieren.
   Hinweis: Bei der Verwendung von 405 nm Laser die Zellen mit einer Reagenz nicht presensitize, aber bei der Verwendung von 355 nm Laser durchzuführen Zelle Presensitization mit 10 µM, 5-Bromo-2 ' - Deoxy - Uridin (BrdU) ^{7 , 8} . Presensitization Zeit hängt von den Typ und die Länge des Zellzyklus. HeLa-Zellen fügen Sie BrdU 16 bis 20 Uhr vor der lokalen Microirradiation hinzu. Im Falle von mESCs, fügen BrdU 6 bis 8 Stunden vor Microirradiation.

3. Induktion von lokalen DNA-Läsionen und konfokalen Mikroskopie

1. legen Sie die Schale auf den Mikroskoptisch und erfassen die Position der markierten Zellen auf dem Teller, die Zellkoordinaten benötigt werden, zur weiteren Analyse ( Abbildung 2A a-c).
2. Finden transfizierte Zellen in einem Quadrat mit einer Zahl oder einen Buchstaben ( Abbildung 2A d-f, Pfeile in Ad zeigen die Position der Zelle in Platten Ae und Af vergrößert) gekennzeichnet. Erhalten Sie ein Bild von den Zellen mit Hellfeld Mikroskopieren und eine Fluoreszenzbild zu erwerben, um die Position von den Zellen und dem beschrifteten Platz ( Abbildung 2A) zu identifizieren.
3. Für die Bildaufnahme vor Bestrahlung, verwenden Sie ein Weißlicht-Laser (WLL) (470-670 nm in 1-nm-Schritten) an die confocal Mikroskop angeschlossen (oder ein anderes zur Verfügung Laser verbunden, die ConfÖcal Mikroskop).
4. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: 512 × 512 Pixel Auflösung, Pixel Größe 64 nm, 400 Hz, bidirektionalen Modus (Scannen in zwei Richtungen), Zeile durchschnittlichen Satz 8, 8 X 12 x zoom
   Hinweis: Zeile Durchschnitt repräsentiert eine bestimmte Anzahl von Scans; die gleiche Zeile ist mehrfach gescannt, bevor Sie mit der nächsten Zeile fortfahren. Wiederholte Scans aller Linien produzieren der letzte Frame des Bildes.
5. Für Bild Beobachtung und Erfassung, verwenden ein 63 × Öl-Ziel mit einer numerischen Apertur von 1,4 und Fluoreszenzbilder sequentiell zu erwerben. Übersprechen zwischen den zwei Fluorochromes mittels des sequentiellen Scan Modus der entsprechenden Software beseitigen.
   Hinweis: Alle Mikroskop-Software ermöglicht die Einstellung eines sogenannten sequentiellen Scan-Modus. Die Betreiber kann auswählen, ob die Fluorochromes erwerben ' Informationen gleichzeitig (z. B. rot-grün-blaue Fluoreszenz) oder, wie hier erwähnt, einzeln (sequentiell), Fluorochrom durch Fluorochrom. Berücksichtigen Sie die allgemeine Informationen, dass die maximale Anregung/Emission für GFP 395/509 ist nm und die maximale Anregung/Emission für mCherry ist 587/610 nm (siehe Fluorochromes verwendet hier in Abbildung 2 b). Basierend auf diesen Informationen, wählen Sie passende Anregung und Emission Filter für die gewünschte Fluorochromes. Filterauswahl und Scan-Verfahren müssen für jedes confocal Mikroskop optimiert werden.
6. Für die Induktion von DNA-Läsionen, Einsatz 64 Linie scanning-Modus, schalten Sie die WLL (in ' Erwerb ' Modus), schalten Sie die externe UV-Quelle (auf " UV-Laser " Schaltfläche "), legen Sie die Region of Interest (ROI) (in ' Erwerb ' Modus), und legen Sie die 355 nm Laser-auf 100 % oder alternativ eine 405 nm Laserquelle.
   Hinweis: In der Regel Laserleistung wird eingestellt, indem die geeigneten Laser den Einstellknopf in Bild Akquisitionsmodus.
7. Für lokale Microirradiation verwenden Laser, die in dem in der Nähe von UVA-Spektrum emittieren. Legen Sie für Microirradiation der ROI im Zellkern und Aufzeichnungsabbild den Hintergrund Bild Akquisitionsmodus Laserintensität außerhalb der ROI regulieren auf Null; Wenn die Zelle richtig bestrahlt wird und das Signal des GFP-Histon H2B verschwindet, beispielsweise mCherry-Tags PCNA Protein zu DNA-Läsionen werden, sofort nach der Bestrahlung rekrutiert wird ( Abb. 2 b und Video 1 ).
   Hinweis: Eine DNA-Schädigung induziert in der ROI eines konfokalen Abschnitt erscheint auch im dreidimensionalen (3D) Projektion (siehe 3D-Drehung und X-y, X-Z, y-Z-Projektionen in Abbildung 2 und Video 2). Beschreibung der kompletten technischen Parameter für 355 nm und 405 nm Laser siehe Stixová Et al. ⁷
8. nach ROI bestrahlt worden, schalten Sie die externe UV-Quelle, schalten Sie den ROI, schalten Sie die WLL, ändern Sie Zeile 8 Scannen und suchen Sie eine andere Zelle zur Bestrahlung. Für ROI-Auswahl auf die Schaltfläche anwendbar in der Software ' s Bild Akquisitionsmodus.
   Hinweis: mCherry-PCNA hat eine maximale Ansammlung Spitze bei DNA-Läsionen zwischen 2 und 20 min ( Abb. 2 b). Überprüfen Sie das Ergebnis auf exogene Proteingehalte, Immunfluoreszenz-Färbung sofort nach lokalen Microirradiation fortsetzen. Wählen Sie das Zeitintervall Bestrahlung nach Interesse.
9. Überprüfen Sie, ob eine Ansammlung von exogene Proteine in der Mehrzahl der Microirradiated Zellen erkannt werden kann. Verwenden Sie für diese Überprüfung die Kriterien in den folgenden Schritten.
   1. Check gibt es keine Überexpression von exogenen Protein in vorübergehend transfizierten Zellen. Als eine mögliche Lösung wählen Sie Zellen mit nur einem schwachen Ausdruck fluoreszierenden Proteins (z.B., mCherry-PCNA oder mCherry-53BP1).
   2. Bewerten die Phototoxizität der WLL-Ausstellung zur Bildaufnahme.
      Hinweis: Zu Testzwecken Phototoxizität, transfected Zellen zu längeren Laser Microirradiation entlarven und stellen Sie sicher, dass Zellen in Mitose Vorgehen, wie in Abbildung 3A -B. Als eine mögliche Lösung zu reduzieren, Scan Zeit und Anzahl der konfokalen Scheiben pro Zelle, optimieren, 3D-Scannen durch Auswahl der optimalen axialen Schritt (0,3 µm wird empfohlen) und legen Sie die Laser ' s macht an seinem Minimum. Alternativ kann Phototoxizität Trolox (6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic Säure, ein wasserlösliches Analogon von Vitamin E) aufgelöst im Anbau Medium mit beseitigt werden. Für DNA-Schäden im Zusammenhang mit Experimenten, es wird nicht empfohlen, der Trolox aufgrund ihrer Schutzwirkung gegen UV-Strahlung.
   3. Bei Bestrahlung mit 355 nm Laser, überprüfen Sie ausreichende Aufnahme von BrdU mit einer entsprechenden BrdU Detektionsantikörper aus der BrdU-Aufnahme kit (siehe Tabelle der Materialien). Da BrdU in DNA während der S-Phase des Zellzyklus integriert ist, muss der Großteil der Zellen während der Presensitization durch die S-Phase gehen. Als eine mögliche Lösung betrachten die Länge des Zellzyklus, die Zelltyp spezifische.
   4. Analysieren, ob die DNA-Reparatur interessierender Proteine haben die Fähigkeit, DNA-Läsionen in bestimmten Zellzyklus Phase(n) erkennen. Eine mögliche Lösung: Um sicherzustellen, dass die Rekrutierung von ausgewählten Proteinen, DNA-Läsionen auf spezifische Zellzyklus Phasen (S/G1/G2) beschränkt, verwenden Sie HeLa-Fucci Zellen. Diese Zellen express RFP-Cdt1 in der G1 und frühen S-Phase und GFP-markierte Geminin in der S/G2-M Zellzyklus Phasen ²² ( Abbildung 1).
   5. Zu vermeiden, Apoptose, Zelltod, wählen Sie eine geeignete Laserquelle und laser-Power Einstellung ²³. Denken Sie daran, die Zellen bestrahlt sollten fortfahren, Mitose ( Abbildung 3A -B, Video 3).
      Hinweis: Unerwünschte Apoptose kann durch Annexin V Positivität, Caspase 3 oder lamin B Spaltung nachgewiesen werden. Auf der morphologischen Ebene Zelle Trennung und Bildung von apoptotischen Körper sichtbar werden.

4. Immunfluoreszenz-Färbung

1. der Zellschicht (wachsend im Mikroskop Gerichte) mit 1 × PBS kurz abspülen und nach dem Spülen, Zellen mit 4 % Formaldehyd für 10 min (für HeLa-abgeleitete Zellinien) oder 20 min (für D3 ES-Zellen) bei Raumtemperatur zu beheben. Spülen Sie die Schale mit 1 × PBS.
   Vorsicht: Formaldehyd verursacht schwere Augenschäden, kann dazu führen, dass eine allergische Hautreaktion und ist auch ein potential Karzinogen; Daher sollten alle experimentellen Schritte mit Formaldehyd in eine Dunstabzugshaube durchgeführt werden.
   Hinweis: Zur Vermeidung von unnötigen Bleichen von Fluoreszenz Signale speichern das Gericht in einer dunklen Kammer während der Inkubationszeit für Immunfluoreszenz-Färbung notwendig.
2. Permeabilize Zellen mit 0,1 % Triton x-100 in H ₂ O 8 min aufgelöst und inkubieren Sie die Zellen für 12 min mit 1 × PBS mit 0,1 % Saponin und 0,1 % Triton x-100. Waschen Sie nach der Inkubation der Zellen in 1 × PBS zwei Mal für 15 min.
3. Inkubation der Zellen mit 1 % BSA in 1 × PBS für 60 min, unspezifische Bindung von ausgewählten Antikörpern zu blockieren. Waschen Sie Zellen in 1 × PBS für 15 min nach der Inkubation.
4. Verdünnt Primärantikörper in einem Verhältnis von 1: 100 (oder 1: 200) (dieser Schritt muss oPtimized für einzelne Antikörper) in 1 % BSA in 1 × PBS, mit 25 µL dieser Lösung pro Schale, und die Zellen mit einem Deckgläschen abdecken. Inkubation der Zellen mit der Lösung mit dem Primärantikörper in eine feuchte Kammer über Nacht bei 4 ° c
5. Am nächsten Tag waschen Zellen in 1 × PBS zwei Mal für 5 min.
6. Verdünnen der Sekundärantikörper in einem Verhältnis von 1: 100 (oder alternativ 1: 200) in 1 % BSA in 1 × PBS, mit 100 µL dieser Lösung pro Schale, und die Zellen mit einem Deckgläschen abdecken. Inkubieren Sie die Zellen mit der Lösung mit den sekundären Antikörper für 60 min. Waschen Sie nach der Inkubation der Zellen in 1 × PBS dreimal für 5 min.
7. Deckglas mit einem Tropfen Eindeckmittel montieren und Abdichten des Deckglases mit Nagellack oder Klebstoff, Trocknung und Bewegung bei der mikroskopischen Beobachtung zu verhindern. Speichern Sie das Gericht im Dunkeln bei 4 ° c

5. Fluoreszenzmikroskopie Lebensdauer Bild (FLIM)

1. Start der FLIM Software. Öffnen der " Anwendungs-Suite " der Software und schalten Sie ihn auf die " FLIM " Modus. Stellen Sie sicher, dass die WLL gepulst betrieben wird.
   Hinweis: Der Betreiber muss eine Hardwaretaste Pulsmodus erreichen wechseln.
2. Die Schale mit den gefärbten Zellen (gebeizt in Abschnitt 4) auf den Mikroskoptisch in die gleiche Ausrichtung wie bei lokalen Microirradiation und die bestrahlten Zellen nach der Netze auf der Petrischale zu finden. Bilderfassung durch confocal Mikroskop durchführen.
   Hinweis: Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: 1024 × 1024 Pixel, 400 Hz, bidirektionalen Modus, 16 Linien, zoom 8 X 12 x.
3. Vor Beginn der FLIM Messung, führen Sie eine Vorprüfung um eine Echtzeit-Aufzeichnung der exponentiellen Zerfall, zu zeigen, indem er auf " Setup FLIM " und " Erwerb " und drücken " laufen FLIM Test ". Optimieren Sie FLIM Parameter für die Probe durch die Beurteilung der zwei Hauptparameter wie folgt.
   1. Optimieren die Wiederholrate der WLL mit der Erregung Wellenlänge auf die Lebensdauer der Probe abgestimmt (siehe Hinweis unten). In der Software confocal Mikroskop die Intensität Laser mit den entsprechenden Button, der in der Regel heißt " laser-Einstellung " in der ' Bild Erwerb ' Menü. Berechnen Sie dann, ein Verfall Kurve (oder Histogramm zeigt alle Photon zählt) mit Hilfe der FLIM-Software (siehe Abbildung 4A -B).
      Hinweis: Verwenden der WLL im Pulsmodus für Erregung. Die Software muss mit einem Puls-Picker für WLL, die Auswahl an die Wiederholrate ermöglicht ausgestattet werden (80, 40, 20 oder 10 MHz). Die Erregung Wellenlänge bei der Fluoreszenz-Spender, GLP, ist 488 nm. Die Verfall-Kurve ist mit Arbeitsbereich FLIM Software aufgezeichnet. Der Parameter (_D, _DA τ τ) zeigt exponentiellen Zerfall Zeiten (z. B. Fluorochrom Lebensdauer); Parameter (A) repräsentiert die Amplitude der Verwesung Fluorochrom (siehe Beispiele der FLIM Daten für GLP-Tags p53 und mCherry-Tags 53BP1 in Abbildung 4A -B).
   2. Überprüfen die Zählrate Wiederholung mit dem Software-Erwerb-Tool (Wählen Sie Wiederholung Rate-Modus). Wählen Sie die hellsten Pixel in der Probe; der Bogen für die hellsten Pixel muss unter 10 % der gesamten Fluoreszenzintensität sein.
4. Klicken Sie auf " Messung ", und drücken Sie " laufen FLIM ".

6. Spender Lebensdauer mit einem FLIM Skript und Berechnung der FRET-Effizienz

1. starten die Bund-FLIM-Software und öffnen Sie die ' Spender ' Arbeitsbereich.
2. Wählen Sie die " Analyse " / " Imaging " Registerkarte im Menü und drücken Sie zunächst die FLIM-Skript " beginnen ". Für optimale FRET-FLIM Einstellungen verwenden bekannte Protein Interaktionspartnern.
   Hinweis: Die Bund-FLIM-Effizienz für die bekannten Interaktion Partner GFP-p53 und mCherry-53BP1 war (34,1 ± 2,3) % ( Abbildung 4).
3. Verwenden Sie nur die Spender-Emission-Kanal (Kanal 1 oder 2) und drücken Sie " berechnen schnell FLIM ".
   Hinweis: Das Bild und das Diagramm werden beide aktualisiert.
4. In the Bund-FLIM Software, legen Sie die Intensitätsskala (0 - 4000 zählt) und die Lebensdauer-Skala (0 - 5 ns) manuell in der Software. Mit diesem Ansatz, visualisieren die Zelle von Interesse und setzen die Bund-FLIM Messung.
   Hinweis: Diese Einstellung verhindert Unterschiede in der Fluoreszenzintensität zwischen den einzelnen Zellen in der Zellpopulation.
5. Zerfall im Formular wählen Sie das passende Modell.
   Hinweis: Wir empfehlen n exponentiellen Reconvolution und Auswahl der Modellparameter " n ". Eine optimale Passform hat folgenden Kriterien: die angepassten Kurve Überlagerungen der Verfall Kurve gut und χ ² - Wert ist gleich 1 ( Abbildung 4 b).
6. Wählen Sie die " Schwelle " / " Verwendung Schwelle " und setzen Sie den Schwellenwert auf 75. Starten Sie " erste Fit ".
   Hinweis: Die SPT64-Software berechnet die durchschnittliche Spender Lebensdauer ohne Bund (" Amplitude gewichtete durchschnittliche Lebensdauer ", τ _Av.Amp)

7. FRET-Effizienz mit dem FLIM-FRET-Skript

1. Wählen Sie den Spender/Akzeptor-Arbeitsbereich und öffnen Sie " Analyse " | " Imaging " | " Lebens ärgern Image ".
2. Nur den Spender als der aktive Kanal auswählen und anpassen Pixel Binning, abhängig von der Photon Anzahl/Pixel. Führen Sie dann die Softwaremodus namens " berechnen FastFLIM ". Wenn das Photon Anzahl/Pixel im Bild niedrig ist, erhöhen Sie das Pixel-Binning auf 4 Punkte.
3. Stellen Sie die Intensität auf 0 - 200 zählt und die Lebensdauer auf 0 - 5 ns.
4. Aktivieren " Verwendung Schwelle " und geben Sie einen Schwellenwert von 75.
5. Legen das passende Modell zu " Multi-exp Spender ", geben Sie die Modellparameter " n ", geben Sie τ _Av.Amp (Schritt 6.6) als ein τ _D, und aktivieren Sie " ersten passen ".
6. Stellen Sie die Parameter Bkgr _Dec, Shift _IRF und Bkgr _IRF, konstante Werte durch das Häkchen entfernen.
   Hinweis: Die Mehrheit der Parameter konstant eingestellt so weit wie möglich. Dieser Ansatz reduziert die statistische Schwankungen. Drücken Sie in diesem Fall nicht " erste Passform " wieder. Es folgen Beschreibungen der genannten Parameter: IRF = Instrument Antwortfunktion, BkgrDec = Hintergrund von der exponentiellen Fit, ShiftIRF = IRF Verlagerung von der exponentiellen Reconvolution passen, BkgrIRF = IRF Hintergrund vom exponentiellen Reconvolution passen. Alle drei Parameter werden berechnet und können behoben werden, mit Hilfe der Software zur weiteren Analyse.
7. Presse " berechnen FRETŔ einen Bund Bild (im Bereich FLIM Bild dargestellt) und FRET-Effizienz-Histogramm berechnet und ein Bund Abstand Histogramm dargestellt ( Abbildung 4). Wenn die Bildanalyse abgeschlossen ist, drücken Sie " speichern Ergebnis ".
   Hinweis: Während der Bund Experimente ist es notwendig zu berücksichtigen, dass fluoreszierende Proteine reversibel Übergänge zwischen Leuchtstoff (hell) und nicht-fluoreszierende (dunkel) Staaten auszustellen. Diese Eigenschaft nennt man " blinkt ", FRET-Effizienz ist betroffen von diesem Phänomen (eine Erklärung für diesen Effekt wurde bereitgestellt von Vogerl Et Al. ²⁴).

8. FRAP Analyse

1. Ort der Dish auf den Mikroskoptisch transfizierten Zellen, die mit dem Ausdruck Eindringmittel tagged Proteins des Interesses zu finden, und führen Sie Bildaufnahme mit Hellfeld Mikroskopieren mit der standard-Mikroskop-Lampe (siehe Abbildung 2Aa-b) und Fluoreszenz-Mikroskopie-Modi.
   1. Für die Bildaufnahme, verwenden die Weißlicht-Laser (WLL) mit confocal Mikroskop (oder einem Laser der Auswahl entsprechend der ausgewählten Fluorochrom) verbunden. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: 512 × 512 Pixel, 1000 Hz, bidirektionalen Modus, Linie Durchschnitt 1, zoom 8 X 12 x.
   2. Mindestens 15 prebleaching Bilder (bei ~ 10 % Laserleistung) und definieren die Region of Interest (ROI) im Menü Bild Erwerb.
2. Für Immunofluoreszenz Experimente verwenden ein Argonlaser (488 nm). Wenden Sie die folgenden Einstellungen: Frame Auflösung 512 × 512 Pixel, 1000 Hz, bidirektionalen Modus, zoom 8 X bis 10 x.
   Hinweis: Fluorochromes wie GFP, mCherry und RFP können begeistert sein, von einem Argonlaser arbeiten bei 488 nm oder 514 nm.
3. Verwenden die FRAP Softwaremodus des Mikroskops Wahl. Während die Immunofluoreszenz festlegen den Argonlaser ' s macht auf Maximum mit der Laser-Einstellknopf. Bildaufnahme Abständen 0,256 s, bei 10 % Laserleistung durchführen.
   Hinweis: Für postbleaching Schritte, verwenden Sie das standard-Image Akquisitionsmodus des konfokalen Mikroskops Wahl.
   1. Monitor Fluoreszenz Erholungszeit nach Immunofluoreszenz (bis zu 45-50 s nach dem Bleichen Eingriff).
      Hinweis: Wie in Abbildung 4 dargestellt, unterscheidet sich die Erholungszeit nach Immunofluoreszenz für mCherry-markierten 53BP1 auf spontane DNA-Läsionen und UVA-Bestrahlung-induzierte Herde. mCherry-53BP1 bei UVA Läsionen erholte sich schnell im Vergleich zu mCherry-53BP1 Ansammlungen an spontan auftretender DNA-Reparatur Herde; siehe Abbildung 4 und Foltankova Et al. ²⁵
4. die Daten vom Mikroskop Software (oder Software der Wahl) in eine Tabelle exportieren und führen Sie statistische Analyse.

Ergebnisse

Verwenden erweiterte konfokalen Mikroskopie, beobachteten wir eine Ansammlung von mCherry-Tags 53BP1 und mCherry-PCNA Proteine bei der DNA-Läsionen. Analysen wurden von lokalen Microirradiation von lebenden Zellen durchgeführt. Der nuklearen Verteilungsmuster der DNA-Reparatur-Proteine in einzelne Zellzyklus Phasen zu erkennen, wir nutzten die Fucci zelluläre System, mit dem es möglich festzustellen, die G1, frühen S, ist und G2-Phasen der Zelle Zyklus (Abbildung...

Diskussion

Mikroskopiertechniken stellen grundlegende Werkzeuge in den Forschungslabors. Hier eine kurze Beschreibung der Methoden für die Untersuchung von Protein-Einstellung verwendet und Kinetik bei DNA-Läsionen wird vorgestellt. Wir vor allem unsere experimentelle Erfahrung auf dem Gebiet der lokalen Microirradiation lebender Zellen zur Kenntnis genommen, und wir besprechen die Untersuchung von Protein-Kinetik von FRAP und Protein-Protein Interaktion auf DNA-Läsionen mit Akzeptor-bleichen Bund²⁸ und s...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell cultivation
HeLa	ATCC	CCL-2TM
ES-D3 [D3]	ATCC	CRL-11632TM
HeLa -Fucci cells			http://ruo.mbl.co.jp/bio/e/product/flprotein/fucci.html
DMEM	PAN-Biotech	P03-0710
DMEM high glucose	Sigma-Aldrich	D6429-500ML
Fetal bovine serum (FBS)	HyClone	SV30180.03
ES Cell FBS	Gibco	16141-079
Non-Essential Amino Acids (NEAA)	Gibco	11140-035
mLIF (mouse Leukemia Inhibitor Factor)	Merck Millipore	ESG1107
MTG (1-Thioglycerol)	Sigma-Aldrich	M6145-25ML
Penicillin-Streptomycin Solution	Biosera	XC-A4122/100
Trypsin - EDTA	Biosera	XC-T1717/100	dilute with 1 × PBS in ratio 1:6
Nunclon cell culture dishes	Sigma-Aldrich	P7866	cultivation of mESCs D3 cells
µ-Dish 35m+A15:I35m Grid-500	Ibidi GmbH	81166	microscopic dish
0.2% Gelatine	Sigma-Aldrich	G1890-100G	dilute in destille water and autoclaved
Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell transfection
GFP-p53 plasmid	Addgene	12091
mCherry-PCNA plasmid			generous gift from Cristina Cardoso, Technische Universität Darmstadt
mCherry-53BP1 plasmid	Addgene	19835
Metafecetene	Biontex Laboratories GmbH	T020–2.0
10 × PBS	Thermo Fisher Scientific	AM9625	for transfection use 1 × PBS diluted in nuclease-free water
5-bromo-2’-deoxy-uridine	Sigma-Aldrich	11296736001
Name	Company	Catalog Number	Comments
Confocal microscopy
Microscope Leica TCS SP5	Leica Microsystems
Microscope Leica TCS SP8	Leica Microsystems
White-light laser	Leica Microsystems
355-nm laser	Coherent Inc.		laser power 80 mW
405-nm laser	Leica Microsystems		laser power 50 mW
Name	Company	Catalog Number	Comments
Immunofluorescence staining
Coverslip	VWR International Ltd	631-1580
4% paraformaldehyde	Affymetrix	19943 1 LT
Triton X100	MP Biomedicals	2194854
Saponin from quillaja bark	Sigma-Aldrich	S4521
BSA	Sigma-Aldrich	A2153
53BP1	Abcam	ab21083	primary antibody
AlexaFluore 647	Thermo Fisher Scientific	A27040	secondary antibody
Vectashield	Vector Laboratories Ltd	H-1000	mounting medium