Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מתווה את זרימת העבודה של הגן מבוססת על CRISPR/Cas9 עריכת המערכת עבור התיקון של מוטציות נקודה בתרבית של תאים. כאן, אנו משתמשים בגישה קומבינטורית לעריכת ג'ין עם נתונים היסטוריים אסטרטגיה ניסיוני המשכית למדידת ויאסין היווצרות באתר היעד — בעיקרו של דבר, ניתוח מוטגנזה מכוונת באתר.

Abstract

ג'ין קומבינטורית עריכת שימוש CRISPR/Cas9 ו- oligonucleotides חד גדילי היא אסטרטגיית יעיל עבור התיקון של מוטציות נקודת בסיס יחיד, אשר לעיתים קרובות אחראים על מגוון רחב של הפרעות תורשתיות אנושי. באמצעות מערכת מודל מבוססת תא ומבוססת, נקודת המוטציה של הגן eGFP מוטציה עותק יחיד משולב לתוך תאים HCT116 תוקנו באמצעות גישה זו קומבינטורית. הניתוח של תאים שיוחלף ו שלא תוקנו מגלה את מידת הדיוק של ג'ין עריכה והן על ההתפתחות של נגעים גנטי, כאשר indels נוצרות בתאים שלא תוקנו רצף הדנ א סביב אתר היעד. . הנה, המתודולוגיה מסוימים להשתמש בה כדי לנתח את הגישה קומבינטורית ג'ין עריכה של מוטציה, בשילוב עם אסטרטגיה ניסיוני מפורט מדידה ויאסין היווצרות באתר היעד, מחולקת לרמות. פרוטוקול זה מתווה של זרימת עבודה עבור חקירות שמטרתה לפתח הגן מבוססת על CRISPR/Cas9 עריכה עבור טיפול אנושי והגישה למעין. המסקנה של עבודה זו היא שמוטגנזה מכוונת באתר הזה מתרחש כתוצאה CRISPR/Cas9 פעילות במהלך התהליך של תיקון נקודת מוטציה. עבודה זו מציב במקום מתודולוגיה מתוקננים כדי לזהות את מידת מוטגנזה מכוונת, שאמור להיות היבט חשוב וביקורתי של כל גישה מיועד ליישום קליני.

Introduction

חלוצי מחקרים על-ידי Mandecki (1986) הראו שינויים קבועים ב- DNA פלסמיד באמצעות oligonucleotides והפך חיידקים1, תוך ולדר ולדר (1986) ביצעו מחקרים דומים שמרים2. זמן קצר לאחר מכן, שרמן ועמיתיו פרסם סדרת מאמרים שבהם חד גדילי oligonucleotides הוכנסו לתוך תאי שמרים כדי לבצע שינויים heritable גנים3. בונים על העבודה הזרע בתאי חיידקים, Kmiec ועמיתיו החל לפתח oligonucleotides יחיד-הסוכן ייחודי זה מכוונת לתיקון בסיס יחיד תאים בתרבית של4. תפיסה זו התבססה על נתונים ביוכימיים שהראו כי מולקולות RNA הנושאת לאגד צמוד יותר לאתר היעד יותר מאלה של DNA בסיסים. אמנם היו דיווחים רבים של עריכת ג'ין הצלחה באמצעות chimeric oligonucleotides5,6,7, רמות עריכה נותרה משתנה מאוד בין ניסויים על פני תא היעד שונה שילובים.

דנ א חד גדילי התורם הוא העדיף התורם כפול גדילי DNA כי זה פחות סביר להשתלב באופן אקראי האתרים שבתוך הגנום8. עם זאת, הציג exogenously oligonucleotides חד גדילי נוטים להשפלה מהירה באמצעות הסלולר nucleases. יש כבר מועסקים מספר אסטרטגיות כדי להגן על טרמיני של oligonucleotides מפני השפלה. המוגנים אקסונוקלאז, חד-גדילי DNA המכיל את הרצף הרצוי היה מספיק להשיג יעילות העריכה 0.1-1% טווח6. שיפור ולא עקבית יותר טכניקות תרביות תאים, בשילוב עם המפרט פנוטיפי, איפשרה עקבית יותר עריכה על-ידי מספר מחקר קבוצות8,9,10,11, 12,13.

במהלך 10 השנים האחרונות, חלה מאמץ משמעותי כדי להפוך את התאים היעד יותר בעניין לעריכת ג'ין. אסטרטגיה אחת מעסיקה את האפנון של מחזור התא15,14,, או16. בזמן עריכת תדרים בתנאים תגובה נורמלית עם חד-גדילי oligonucleotides (ssODNs) מוחדרים בתרבית של תאים בתרבית שהורחקה בין 0.1% ל- % 1, התדרים של ג'ין עריכה מוגברת 3 - ל 5 פי כאשר את oligonucleotides הוכנסו לתוך התאים במהלך המעבר שלהם באמצעות שלב S. בסדרת ניסויים נפרדים, Brachman ו- Kmiec (2005) הראו כי רמות גבוהות יחסית של ג'ין מדויק עריכה (3-5%) התקבלו כאשר 2'3 ' dideoxycytosine (ddC), נדגרה בתוך תאים עבור 24 שעןת לפני התוספת של oligonucleotide17 . ddC מקטין את קצב תנועת מזלג שכפול ה-DNA, רומז כי הגן עריכה על-ידי ssODNs ב שכפול התאים סביר כולל שילוב של ODNs למחוזות של שכפול active11,18. נלקח יחד, מחקרים אלה הולידו את הרעיון כי תורם DNA הופך ישולבו מזלג שכפול הולך וגדל במסגרת מנגנון הפעולה של ג'ין עריכה, נכון באופן עצמאי אם הפסקה גדילי כפול הוא נוכח או לא19. לכן, התיקון של מוטציה או ההחלפה של מקטע של DNA בתוך הכרומוזום מתרחשת דרך ה-DNA זיווג ועל מסלול יחיד-strand התבוללות.

גרימת אקראי כפול-גדילי DNA מעברי בגידול תאים עם סוכנים מולקולה קטנה יוצר סביבה שבה אירועים שכפול ה-DNA הם התקועה התא מנסה לתקן את הנזק20,21. את ההאטה חלוף של מזלגות שכפול מאפשר חדירה ניצול של המבנה כרומטין מאת oligonucleotides עריכה חד-גדילי, שיפור הנגישות היעד15. יצירת זוגיות גדילי DNA נשבר על ידי תרופות כגון VP16, bleomycin, או camptothecin22,23, הוכח לעורר גנים עריכת רמות על ידי כמעט 10-fold, עד 6-8%. עם זאת, אקראי כפול-גדילי DNA מעברי הם לא רצויים בסביבה טיפולית.

גן עריכה עם nucleases לתכנות, oligonucleotides הוא גם מגורה במהלך חלוקת התא24,25. בעת משלוח מבוססי חומצת גרעין שימש לביצוע תיקון מכוון הומולוגיה בתאים של HCT 116 מסונכרן, ריברה-טורס ועמיתיו הוכיחו עליית באותו מיקוד פעילות כאשר nucleases אפקטור כמו מפעיל שעתוק (TALENs) הועסקו עם oligonucleotides חד-גדילי, שניהם מוחדרים של שכפול התא האוכלוסייה26,27 . לאחרונה, Bialk ועמיתיו הראו כי התיקון של מוטציות בסיס יחיד עם oligonucleotides חד גדילי ושורה של מקובצים באופן קבוע interspaced חזרה palindromic קצר Cas9 (CRISPR/Cas9) מולקולות מתקיים עם יעילות גבוהה יותר כאשר האוכלוסייה התא הוא למעבר שלב S28. מולקולת CRISPR מורכבת של RNA ופונקציות כדי לזהות את האזור בתוך המטרה רצף ה-DNA המיועד המחשוף. Cas9 הוא אנזים בקטריאלי שתפקידו קליב שני גדילי ה-DNA בתגובה exchange חד-תאית. לפיכך, CRISPR עמדות המתחם על המטרה גנומית, נוקלאז Cas9 ביצוע מעבר כפול גדילי. . לין ואח (2014) גם הדגימו את החשיבות של מחזור התא להשגת תדרים גבוהים של ג'ין עריכה, שימוש שונה CRISPR/Cas9 ribonulceoprotien (RNP) בתיווך מורכבת מערכת ב- fibroblasts neonatal העיקרי, תאי גזע עובריים, ו שאר קווי תא24. לכן, הקשר שנוצר בין גנים עריכה והתקדמות מחזור התא לעריכה סוכן בודד הגן חל ג'ין קומבינטורית עריכת שימוש nucleases לתכנות ותבניות DNA התורם. בעוד הגישה קומבינטורית לעריכת ג'ין איחד את מגוון של שותפים עם תבנית ה-DNA התורם, רוב העובדים בתחום להשתמש CRISPR/Cas9 לספק את הפונקציה הפסקה גדילי כפול. בחירה זו, המושתתת על נוחות השימוש של כלי זה גנטי מסוים ואת הגמישות שבה זה יכול להיות מועסק כדי לבטל את פונקציית ג'ין או להציג פיסת דנ א זר לתוך אתר מסוים. הדור של נוק אאוט טכנית מושווה קל תחליף ג'ין, איפה שיתוף עותקים "נכונה" או נורמלי של גנים לתוך האתר המחלה צריך להתבצע בדייקנות. מספר חוקרים בזיהוי, ללמוד את השימוש בסמים ספציפיים, ריאגנטים המאפשרים את התיקון של בסיסים מוטציה החדרת רצפים גנטי רגיל במצב תקין תדירויות גבוהות29.

לאחרונה, ריברה-טורס. et al. 30 פעם ג'ין קומבינטורית עריכה, ניצול כפול גדילי הפסקת הפעילות של מערכת CRISPR/Cas9 מעוצב במיוחד, המידע הגנטי התורם oligonucleotide חד גדילי DNA תבנית, לתקן נקודת מוטציה ב-עותק יחיד של הגן משופרת חלבון נמכרות ירוק (eGFP) משולב לתוך התאים HCT116. החוקרים ניצלו את הקו תא דגם מאופיין היטב הזה כדי להעריך את ייחודה של פצילות סביב אתר היעד. הנתונים חושפים כי הטרוגניות באתר היעד קיים, במיוחד בתאים שאינם מכילים מוטציה המתוקן. כתב יד זה, פירוט ומיקוד על המתודולוגיה בשימוש על ידי עובדים אלו כדי לבדוק באתר הטרוגניות mutational שנוצרו על-ידי עריכת ג'ין CRISPR/Cas9.

Protocol

בפרוטוקול הבא כרוך בעבודה עם תאים בתרבית של; צפויה היכרות עם התרבות סטרילי טכניקה תא.

1. שורת התאים ותנאי תרבות

  1. להפוך 500 מל בינוני על התרבות של תאים של HCT 116: מקוי ' s 5A ששינה בינוני בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 2 מ מגלוטמין ו 1% פניצילין (זה לגמרי בינוני).
    הערה: גדלים של HCT 116-19 בתאים בקבוקון T-75 או T-175 לפני ציפוי. 90% confluent, כל הבקבוק T-75 תניב 8.4 x 10 6 תאים, בערך 5 ס מ-10 הלוחות, ומתי כל T-175 תניב 18.4 x 10 6 תאים, בערך 15 ס מ-10 צלחות.

2. קציר תאים מן הבקבוק

  1. האחות של המדיום, לשטוף עם Dulbecco ' יח Phosphate-Buffered מלוחים ללא סידן magniesium (PBS) (10 מ"ל T-75 או 25 מ עבור T-175), ואת וביופסיה.
  2. הוסף טריפסין dropwise את. הבקבוק באמצעות פיפטה 2-mL (2 מ"ל T-175 או 1 מ"ל עבור T-75). מקם את הבקבוקון באינקובטור 37 ° C ו- 5% CO 2 עבור 5 דקות כדי לאפשר את התאים לנתק.
  3. הקש את הבקבוק כדי לוודא כי כל התאים הם יצא ממקומו, ואז להרוות בינונית מלאה על ידי פיזור זה על פני השטח כולו + בקבוקי שתייה צידניות (8 מ ל T-175 או 4 מ"ל T-75).
  4. פיפטה לאורך מספר פעמים כדי לשבור את התא הגושים ולהעביר לתאים צינור חרוטי 15-mL
  5. לפני ספינינג התאים למטה, לקחת µL 10 מ 15-mL חרוט, ולשלב אותו עם µL 10 של trypan blue לספור את התאים. גלולה התאים על ידי ספינינג למשך 5 דקות ב 125 x g ו-16 ° C.

3. ספירת התאים

  1. µL 10 העברה של התאים מעורבב עם trypan כחול hemocytometer. לספור את 4 רשתות מסביב למסגרת (כל רשת מכיל 16 ריבועים).
    1. בספירה תא הממוצעת של כל קבוצה של 16 ריבועים פינה.
    2. הכפל ב- 10,000 (10 4).
    3. להכפיל הנפח הכולל של מדיום נהגו לקצור את התאים לתיקון הדילול של התוספת trypan blue.
      הערה: התבנית המשוואה לחישוב לאמצעי האחסון resuspend התאים כדלקמן:
      figure-protocol-1849
      figure-protocol-1923

4. ציפוי התאים

  1. עבור כל ס מ-10 צלחת של תאים לסינכרון, הוסף 5 מ של בינוני מלא מיקרומטר 6 של aphidicholin (12 µL מניה 2.5 מ מ 200-הוכחה אתנול).
  2. העברת 100 µL תא מתיחה מחדש של גלולה, 2.5 x 10 6 תאים, כל ס מ-10 צלחת, מערבולת בעדינות כדי לערבב.
  3. דגירה הלוחות-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 עבור 16-24 h לסנכרן את התאים בגבול G1/S.

5. שחרור תאים מן סינכרון Aphidicolin

  1. 4 שעות לפני מיקוד, תשאף המדיום, לשטוף עם PBS, מחוק לגמרי, טוב, מגניב, הוסף 5 מ של בינוני מלא
  2. למקם אותו בחזרה בחממה ב 37 ° C ו- 5% CO 2 במשך 4 שעות

6. RNA Complexing

  1. הזן רצף גנים מוטציה eGFP למעבדה ג'אנג ' s באופן מקוון מחולל 25 (http:// crispr.mit.edu/) ובחרו המדריך CRISPR רצפים לאגד עם הקרבה לאתר היעד. להשיג את המדריך CRISPR רצפים של מקור מסחרי.
  2. אחסן CRISPR RNA (crRNA), טרנס-הפעלת crRNA (tracrRNA), חלבון Cas9 ב- 20 ° C ושימוש על פי יצרן הצעות. צינור
    1. לערבב הרנ א בריכוזים equimolar ל 45 מיקרומטר. 6.75 להוסיף µL של מלאי מיקרומטר 200 של crRNA ושל µL 6.75 של מלאי מיקרומטר 200 של tracrRNA כדי צנטריפוגה 1.5-mL. להוסיף µL 16.50 טה המאגר כדי להפוך נפח סופי של 30 µL.
  3. חום ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות חום בלוק או PCR מכונת.
    התראה: חם!
  4. להתקרר לטמפרטורת החדר.
    הערה: אם משתמש המכונה PCR, להגדיר את הקירור עד 0.2 ° C/s.
  5. לבצע את הפעולות הבאות עבור כל דגימה.
    1. µL 2.22 לדלל של מתחם 2.78 µL טה מאגר (10 מ מ. טריס, pH 8.0 ו- 0.1 מ מ EDTA; pH 8.0) באמצעי אחסון הסופי של 5 µL crRNA:tracrRNA.
    2. µL 1.67 לדלל של חלבון Cas9 של מניה מיקרומטר 60 ב 3.33 µL בינוני נמוך-סרום לנפח סופי של 5 µL.
  6. µL 5 שילוב של חלבון Cas9 עם µL 5 של RNA ומורכבת

7. קציר התאים עבור מיקוד

  1. וביופסיה המדיום, תשטוף עם 5 מ של PBS, וארוקן את PBS, ולהוסיף 1 מ"ל של טריפסין ומחוממת מראש כל צלחת 10-ס מ. ! תחזירו את הצלחות בחממה ב CO 37 ° C ו-5% 2 עבור 5 דק
  2. הקש על הצלחת ס מ-10 כדי לוודא כל התאים הם יצא ממקומו, ואז להרוות עם 4 מיליליטר בינוני מלא על ידי פיזור זה על פני השטח כולו של הצלחת-
  3. פיפטה לאורך מספר פעמים לשבור את התא הגושים ולהעביר את התאים ל צינור חרוטי 15-mL-
  4. לפני ספינינג התאים למטה, קח 10 µL מהצינור חרוט 15-mL, ולשלב אותו עם 10 µL של trypan blue לספור את התאים. גלולה התאים על ידי ספינינג למשך 5 דקות ב 125 x g וטמפרטורת החדר.
  5. תשאף המדיום, לשטוף עם 5 מ של PBS. גלולה התאים על ידי ספינינג-125 גרם x עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.

8. ספירת התאים

  1. µL 10 העברה של התאים מעורבב עם trypan כחול hemocytometer. לספור את 4 רשתות מסביב למסגרת (כל רשת מכיל 16 ריבועים).
    1. בספירה תא הממוצעת של כל קבוצה של 16 ריבועים פינה.
    2. הכפל ב- 10,000 (10 4).
    3. להכפיל הנפח הכולל של מדיום נהגו לקצור את התאים לתיקון הדילול של התוספת trypan blue.
      הערה: בעקבות היא תבנית המשוואה לחישוב לאמצעי האחסון resuspend את התאים. מחדש להשעות את המספר הנדרש של תאים ללא סרום מקוי ' s 5A ששינה בינונית.
      figure-protocol-5124
      figure-protocol-5198

9-פילוח דגימות

  1. העברת 100 µL של התא השעיה (5 x 10 5 תאים) משלב 8.1 על כל cuvette 4-מ מ הפער אלקטרופורציה. להוסיף 10 µL של RNP מורכבות שלב 6.7 ל- 100 µL של תאים על צפיפות תא 5 x 10 5. להוסיף ODN (2 מיקרומטר) כדי שכל דוגמית.
    הערה: בפקד חיובית, להוסיף 1 µL של eGFP-µg 1/µL לבטא פלסמיד
    1. המדף לקחת מכונת אלקטרופורציה בקלילות קפיצי כל דגימה, למקם אותם בבית הבליעה. Electroporate-250 V, LV; 2 פעימות, 1 s; 13 ms; הדופק unipolar.
  2. העברת ארון התקשורת חזרו ליער. העברת כל מדגם טוב המכיל 2 מ של מדיום מלאה אניn צלחת 6-. טוב. דגירה-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO 2 במשך 72 שעות לפני בדיקת רמות תיקון.

10. ניתוח של ג'ין לערוך תאים ויעילות תרביות תאים

  1. תשאף המדיום ולשטוף את התאים עם 2 מ"ל ל- PBS. האחות של PBS ולהוסיף 500 µL של טריפסין ומחוממת מראש מכל קידוח של צלחת 6-. טוב. ! תחזירו את הצלחות בחממה ב CO 37 ° C ו-5% 2 עבור 5 דק
  2. הקש על הלוח כדי לוודא כל התאים הם יצא ממקומו, ואז להרוות עם 1 מ"ל של מדיום מלאה על ידי פיזור זה על פני השטח כולו של הבאר.
  3. להעביר את התאים לתוך צינור 1.5-mL צנטריפוגה צניפה-g x 5,000 עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  4. תשאף המדיום. מחדש להשעות בגדר תא ב- 500 µL מאגר FACS (BSA 0.5% 2 מ מ EDTA, יודיד propidium µg/mL 2 PBS).
  5. למדוד קרינה פלואורסצנטית את התא (eGFP +) על ידי cytometry זרימה.
    1. לחשב את היעילות תיקון כאחוז של תאי eGFP-חיוביות חיים הכולל מעל המספר הכולל של תאים חיים בכל מדגם, כפי שמתואר ריברה טורס ואח 30.

11. ניתוח רצף הדנ א

  1. Electroporate של HCT מסונכרן ואשר פורסמו 116-19 תאים על ריכוז של 5 x 10 5   תאים/100   µL, עם RNP מורכבים-100 pmols ו 72NT ODN ב 2.0 מיקרומטר.
  2. להעביר את התאים ללוחות 6-ובכן ולאפשר להם להתאושש במשך ה 72
  3. למיין את התאים בנפרד לתוך צלחות 96-ובכן באמצעות סדרן FACS עם 488 ננומטר לייזר (100 מגה-וואט) עבור eGFP + /-, כפי שמתואר ריברה-טורס ואח 30.
    הערה: לא כל בארות יגדל בהצלחה.
  4. להרחיב את התאים מעל 6 שבועות ולקצור כפי שמתואר בשלב 7-
  5. מן הבארות יש צמיחה, לבודד gDNA הסלולר באמצעות בידוד ה-DNA זמינים מסחרית של קיט (ראה את הטבלה של חומרים) ומגבירים את אזור סביב המטרה הבסיס באמצעות PCR (718 bp; פריימר לפנים 5 '- ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3 ', להפוך פריימר 5 ' - ACTTGTACAGCTCGTCCATGC - 3 ').
  6. ניתוח רצפי הדנ א לבצע על הדגימות.

תוצאות

השתמשנו מערכת מודל ללמוד ג'ין עריכה בתרבית של תאים, אשר נשענת על התיקון של מוטציה מוטבע בתוך הגן eGFP משולב כעותק יחיד בתאים HCT116. חשוב לציין כי זהו גן עותק יחיד; לפיכך, ניתן לבצע תצוגה פחות מסובך של DNA השינויים או מוטגנזה מכוונת. איור 1A מציג את רצף גנים מוטציה eGFP עם הבסיס יישוב, בסיס שלישי stop codon תג, המסומנים באדום. Oligonucleotide 72-בסיס, אשר משלים חלקית סטרנד עיבד של הגן eGFP (72NT) והוא נועד לעודד את ההחלפה בסיס מ G ל- C, בנוסף מודגם. בנוסף, CRISPR, מיועד לשמש כ ג 2, עם הרצף protospacer המצוין בעוד 5 דקות ל 3' כיוון, מתואר גם באיור 1A. כדי לבצע את התגובה הזו לעריכת ג'ין, השתמשנו ribonucleoprotein (RNP) המורכב CRISPR ה-RNA (cr) ו- RNA את tracr (tr) מצמידים Cas9 מטוהרים חלבון (איור 1B), במקום להשתמש וקטור בתרבית של הביטוי המורכב של הגן Cas9, המתאים ספציפית המדריך רצף ה-RNA.

כאשר החלקיק RNP מעוצב במיוחד מועבר עם oligonucleotide חד גדילי לתאים HCT116 על ידי אלקטרופורציה, ג'ין עריכה, שמעידים התיקון של המוטציה בסיס יחיד ב- eGFP, הוא ציין לאחר 72 h של דגירה באמצעות זרם cytometer. תיקון פונקציונלי הוא נצפות על ידי הופעתם של זריחה ירוק בתאי יישוב, התאים ניתן גם להפריד מן האוכלוסייה כולה על-ידי מיון בגלל זה קרינה פלואורסצנטית. כפי שמוצג באיור2, תגובה הדרגתית במינון ניתן לראות את רמות מתואמת של עלייה RNP, 72NT. יחס מולקולרית, picomoles של RNP, micromolar ריכוז 72NT כפי שהוא מוצג באיור, מבוססים על המינונים אופטימלית בשימוש תגובות לעריכת הגנים התלויים המבוא של Cas9, מדריך ספציפי RNA transfected הביטוי וקטורים. שיבוץ באיור 2 מוצג תגובה לעריכת ג'ין ביצעו בהיעדרו של החלקיק RNP. כאן, כ- 1% של תאים יישוב מתוקנות כאשר ריכוז גבוה יותר 10-fold oligonucleotide 72NT משמש התגובה לעריכת ג'ין. הסוכן יחיד.

על מנת לקבוע אם קיימת הטרוגניות גנטית-האפקט מוטגנזה מכוונת באתר כביכול את אתר היעד-החלטנו לבחון את התוצאה של ג'ין עריכה פעילות בתאים בודדים. זמן מפרך הרבה יותר מאשר בחינת האוכלוסייה הכללית, מידה נכון של טביעות גנטיות או נגעים ניתן לקביעה כאשר הגנום של תאים clonally המורחב נבדק. אנחנו חזר על הניסוי המתואר באיור 2, הפעם רק באמצעות pmol 100 של RNP מורכבים µmol 2.0 של oligonucleotide 72NT. כמו לעיל, 116 של HCT התאים היו מסונכרנים במשך 24 שעות ביממה עם aphidicholine, נעצר בגבול G1/S. 4 שעות לאחר מכן, התאים שוחררו ואת הכלים לעריכת הגן הוצגו על ידי אלקטרופורציה. 72 שעות מאוחר יותר, התאים נותחו באמצעות FACS וממוינות בנפרד 96-ובכן לוחות (התהליך הניסויי מודגם באיור3). תאים הצגת פלורסצנטיות ירוק היו למיין לפי cytometry זרימה לתוך בארות בודדים של צלחת 96-ובכן משובט הרחבה. חשוב, התאים חסר ביטוי eGFP היו גם מבודד, ממוינים באופן דומה עבור הרחבת תחת באותם התנאים.

לאחר 14 ימים של צמיחה, רוב שיבוטים בודדים התרחבה במידה מספקת כדי לאפשר בידוד ה-DNA. ככזה, נבחרו 16 שיבוטים של הדגימות eGFP-חיובית, תקינות גנטית סביב אתר היעד נותחה על ידי רצפי DNA. מידע המקיפים את רצף ה-DNA של אללים בתוך האוכלוסייה נוצרה באמצעות סנגר רצף, באמצעות תוכנת ויזואליזציה רצף כדי להשוות את רצף אלל wildtype (איור 4A). האתר לחתוך של המתחם RNP מסומן על ידי חץ שחור, ממוקם על הירוק בר (2C crRNA). כמו גם באיור איור 4A, כל התאים eGFP-חיוביות 16 להכיל את ההחלפה נוקלאוטיד החזוי באתר היעד. השאריות C המומר מסומן באדום, הפרופיל שיא המשקף את השינוי המדויק מסופק מתחת רצף eGFP-חיוביות. באופן דומה, 15 שאינם המשובטים מבודד, מספיק מורחבת כדי לאפשר מיצוי DNA וירוק רצף, נותחו עבור הטרוגניות באתר היעד. כפי שחזיתי, בערך חצי הדגימות, אין החלפת בסיס DNA נצפתה. זה משתקף בשיעור שמירה על השאריות G באתר היעד, כפי שמוצג באיור 4B. שארית הרחבות המשובטים נבדק בניסויים אלה מוצגים אוכלוסיה הטרוגנית של מוטציות מחיקה, לכן החשבונאי היעדר קרינה פלואורסצנטית ירוק. הגודל מחיקה נע בין לבסיס אחד הבסיסים 19. חשוב לציין כי רק בחנו 15 דוגמאות של תאי eGFP-חיובי, בעוד אנו מאמינים כי זה די נציג של הסוג של נגעים גנטי שהשאירו פעילות CRISPR/Cas9, קיימת אפשרות כי סוגים אחרים או צורות של indels יכול להיות נוכח באוכלוסייה יישוב.

יחדיו, התוצאות המוצגות באיור 4 לאשר את המדידה פנוטיפי ב eGFP פילוח המערכת. המרה של הג ג נוקלאוטיד מאפשר את הופעתה של זריחה ירוק בתאים HCT116 המתוקן. אין החלפת בסיס סביב אתר היעד נצפתה שיבוטים מבודד על הניסוי הזה או בכל הניסויים הקודם27,28. הנתונים גם להוכיח כי תאים נכשל לעבור ג'ין עריכה דרך נקודת-מוטציה תיקון יישארו שלא תוקנו אך, במקרים מסוימים, לא מסקרן, עם מגוון של הטרוגניות גנטית סביב אתר היעד.

figure-results-4839
איור 1. (א) מודל המערכת עבור ג'ין עריכה של הגן המוטנטי eGFP. הקטעים המתאימים של wildtype ושל eGFP מוטציה ג'ין עם codon יישוב, ממוקם במרכז של הרצף, מוצגים ירוק ואדום, בהתאמה. נוקלאוטיד ממוקד עבור exchange הוא מודגש ומסומן בקו תחתון. בסיסים המסומן ב הכחולים מייצגים את רצף protospacer CRISPR 2C, וסמן כל הבסיסים כתום האתר פאם. Oligonucleotide להשתמש בניסויים אלה הוא בסיסים 72 אורך, הנושאת קישורים phosphorothioate ששינה בבסיסים טרמינל 3; 72-מר מטרות סטרנד (NT) שאינם עיבד (72NT). (B) CRISPR/Cas9התגובה הרכבה ribonucleoprotein. crRNA מספק יעד ירידה לפרטים (סעיף 20 בסיסים, אדום) התואמים את רצף protospacer 2C, תחום אינטראקציה (כחול) tracrRNA (ירוק). crRNA ו- tracrRNA הם annealed בריכוזים equimolar. חלבון Cas9 (אפור) נוסף כדי להשלים את מכלול RNP. מדריך RNAs (gRNAs) ישיר והפעלת endonuclease של Cas9, אשר לאחר מכן קליב המטרה ה-DNA. החלק התחתון של האיור מראה את רצף זרע 2C הרצף tracrRNA. איור זה שונה מריברה-טורס, ש. et al. (2017). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-6102
באיור 2. גן עריכה הוא למינון כאשר בבימויו של RNP את ssODN. מסונכרן, שוחררה של HCT 116-19 התאים היו electroporated עם 24-120 pmol של RNP CRISPR/Cas9 ו- 0.6-3.0 מיקרומטר של 72mer. לאחר תקופת החלמה 72-h, פעילות גנים לעריכת נמדדה באמצעות cytometer של זרימה. ג'ין עריכה מוצג את היעילות תיקון (%), שקבע את מספר התאים eGFP-חיוביות קיימא מחולק על ידי המספר הכולל של התאים קיימא באוכלוסייה. קווי שגיאה מיוצרים משלוש קבוצות של נקודות נתונים שנוצר מעל 3 ניסויים נפרדים באמצעות חישובים בסיסיים של שגיאה סטנדרטית. שיבוץ: יחיד-הסוכן עריכה ג'ין. פעילות גנים לעריכת בבימויו של oligonucleotide חד גדילי (72NT) בהיעדר RNP מורכבות בתנאים זהים מוצג כפונקציה של הגדלת ריכוז. איור זה שונה מריברה-טורס, ש. et al. (2017). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-7135
איור 3. אסטרטגיית ניסיוני עבור בידודו של תא בודד שיבוטים. תאים מפגין eGFP ביטוי זכו חיובית, ממוינים שימוש cytometer זרימה של תאים בודדים לתוך בארות בודדים עבור משובט הרחבה. התאים חסר ביטוי eGFP היו מבודדים, ממוינים באופן דומה, התרחבה תחת באותם התנאים. הדנ א אז היה מבודד, הגן eGFP היה מוגבר ונחשפו סנגר רצף לנתח את פעילות הגן לעריכת סביב אתר היעד. איור זה שונה מריברה-טורס, ש. et al. (2017). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

figure-results-7845
באיור 4. (א) ניתוח allelic eGFP-חיוביות תאים מורחבת כאוכלוסייה המשובטים. Clonally מבודדים, מורחב eGFP-חיוביות (שש עשרה שכפולים) היו ניתח באתר המקיף את בסיס יישוב ואת ה-DNA מכל אחד, שנקטפו, מטוהרים, מוגבר, ודוגמאות וסודרו. ניתוח allelic בוצע באמצעות סנגר רצף, באמצעות תוכנת ויזואליזציה רצף, בהשוואה רצף אלל wildtype, המומחש בחלק העליון של האיור. האתר לחתוך של המתחם RNP מסומן כמו חץ שחור קטן הממוקם על הירוק בר (2C crRNA). (B) ניתוח allelic של תאים eGFP-שלילי מורחבת כאוכלוסייה המשובטים. 15 דוגמאות בודדות, מורחב מ שיבוטים שמקורם האוכלוסייה שלא תוקנו, היו נבחרים באופן אקראי וניתח עבור ויאסין היווצרות באתר המקיף של נוקלאוטיד היעד. כמו לעיל, ניתוח allelic בוצע באמצעות סנגר רצף, באמצעות תוכנת ויזואליזציה של רצף. שוב, רצף אלל wildtype בחלק העליון של הדמות, יחד עם האתר לחתוך RNP, מוצגים. איור זה שונה מריברה-טורס, ש. et al. (2017). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

ג'ין עריכה התפתחה כענף מדעי המיינסטרים בעיקר בשל הופעתה של המערכת CRISPR/Cas9. יש כבר לשנות את מסלול יוצא דופן זה, אשר מקלה על החסינות המאמצת תאים חיידקיים, ייעודו ככלי מולקולרית כדי לאפשר שינוי גנומית האדם הכרומוזומים. הפונקציה הטבעית של CRISPR/Cas9 הוא כדי לבטל את ה-DNA הנגיפי על ידי החדרת כפול גדילי DNA מעברי שמוביל פיצול30,31. פעילות זו גורמת להרס של פולשים DNA אקסוגני ומוביל חסינות prokaryotic שמדחיק זיהום לאחר מכן על ידי אותו החלקיק ויראלי. למרבה הפלא, מערכת זו מוצגים התנהגות pneumonic, כי זה יכול להפעיל מחדש את gRNA CRISPR מסוים שנוצר על-ידי אירועים קודמים של זיהום.

היעילות והדיוק של שיבוש גנטי על ידי CRISPR/Cas9 נעשה שימוש במערכות רבות גנטי האיקריוטים שבו המטרה היא לבטל את תפקוד הגן32,33. כאשר חזרה למצבה הבזליים, התהליך מורכבת משני שלבים הבסיסית. הראשון הוא הפסקה כפולה-גדילי, ואילו השני מסתמך על התהליך הטבועה של קצה שאינם הומולוגיים להצטרף (NHEJ) כדי להשלים את ההסתרה. ברוב המקרים, התוצאות כפול גדילי הפסקה ביצירת בלנט-הסתיים, מנותק מקטעי כרומוזומלית, אנזימים המעורבים NHEJ מגיבים מעבר כרומוזומלית, לפעול מתאחדות את קצוות שבורים. תהליך זה יכול לעיתים כרוכים האובדן של נוקלאוטידים בודדים באתר קטועה. האובדן של בסיסים אפילו כמה יכול לגרום frameshift ויחדל ביטוי פונקציונאלי. השימוש CRISPR/Cas9 כדי ליצור נוקאאוט גנטי ומרבה את התהליך הטבעי של NHEJ יש מהפכה גנטיקה האיקריוטים; האובדן של DNA באתר היעד הוא צפוי והן הצפוי.

בניגוד נוקאאוט גנטי, מספר חוקרים כבר עוסקת בניסיון לנתב מחדש ולשנות את הייעוד CRISPR/Cas9 פעילות לקראת התהליך של תיקון מכוון הומולוגיה. מטרת הלימודים היא תיקון גנים. באסטרטגיה זו, CRISPR/Cas9 בשילוב עם תבנית ה-DNA התורם המספק מידע גנטי כדי לתקן שגיאה מולדת או להכניס מוטציות גנים בריא. מוקדם יותר דווח המדגיש את יכולת יוצאת דופן של CRISPR/Cas9 כדי לעודד תיקון מכוון הומולוגיה מצוינת (ישירות או בעקיפין) כי התהליך התרחשה ב24,אופנה מאוד מדויק34. המעבדה שלנו למד תיקון מכוון הומולוגיה או תיקון ג'ין בעזרת oligonucleotides חד גדילי בניסיון להגדיר את מנגנון של הרגולציה המעגלים המקיפים אותה15,17,18 ,23. אנחנו התמקדו בעיקר הגן עריכה מוטציות נקודה בודדת, מאחר שזוהי מוטציה גנטית הבסיסיים ביותר ידוע להיות אחראי על הפרעות תורשתיות רבות. הידע הבסיסי שלנו. ג'ין עריכה הובילו אותנו לחקור את מידת הדיוק של פעילות CRISPR/Cas9 תגובות אלו, מאז הפונקציה CRISPR/Cas9 בתוצאות נוקאאוט גנטי להיווצרות של indels. השתמשנו מערכת מודל מוגדרים היטב, במקום גן שאינו ניתן לבחירה אך הרלוונטית קלינית, ללמוד באתר מוטגנזה מכוונת אופנה רדיוקציוניסטי בהחלט. באמצעות גן מטרה פשוטה, על אילו גנים תיקון ניתן למדוד ברמות שני genotypic ו פנוטיפי, אנחנו הסיק כי הטרוגניות המתרחשים באתר היעד יכול להיות מזוהה באופן אמין וחזק.

הנתונים שלנו מאשרים כי הגן ומבוססת עריכת המערכת, המורכב eGFP מוטציה גן משולב לתוך תאים HCT116, יכול לספק למעין מידע לגבי הדור של נגעים גנטיות ותהליך מוטגנזה מכוונת באתר. Oligonucleotide CRISPR/Cas9, חד-גדילי התורם במולקולות דנ א עובדים במשולב יכול להוביל התיקון מדויקת של נקודת המוטציה בגן eGFP. אנו מציעים מודל חדש עבור התיקון של מוטציות נקודה, נתיב מולקולרי שבו ה-DNA של התורם פועלת כתבנית השכפול עבור התיקון של הבסיס מוטציה, תהליך אנו יש להגדירו המדויק30. האוכלוסייה יישוב, לא מפגין את פנוטיפ המתוקן, מציג מגוון רחב של תאים המכילים הטרוגנית ו נרחב החל indels DNA סביב אתר היעד. ב חצי לערך שיבוטים מבודד מן האוכלוסייה שלא תוקנו, מחיקה מוטגנזה מכוונת נצפתה ב אתר היעד. מאז הדו ח הקודם לא מצביעים כי oligonucleotides חד גדילי מתנהג כמו כלי עריכת ג'ין. הסוכן יחיד יכול לגרום indels באתר היעד, אנו מסיקים כי פעילות CRISPR/Cas9 אחראי על מוטציות אלה.

כתב יד זה, אנו מספקים מתודולוגיה מפורט כך הטרוגניות גנטית באתר היעד ניתן למדוד באופן אמין וחזק. בעוד כמות עצומה של תשומת לב הוקדשה הניתוח מיפוי של מוטגנזה מכוונת מחוץ לאתר, סביר כי מוטציה הטרוגנית שנוצרו באותו אתר היעד יהיה השפעה רבה יותר על ההצלחה או הכישלון של ג'ין עריכה בזירה קליניים. ייתכן שתידרש כדי לשפר את מידת הדיוק של התיקון מכוון הומולוגיה של שגיאות מולדות תאים בתרבית של35טכנולוגיות נוספות או ששונה Cas9 חלבונים. חלק טכנולוגיות אלה כוללים את השימוש oligonucleotides עזר לשמש גשר, מחזיק יחד את הקצוות כרומוזומלית והימנעות בפעולה הרסניים של NHEJ. הגדרת מידת הטרוגניות באתר היעד גנים לעריכת פעילות, חייב להיות חלק חשוב של כל פרוטוקול המיועד התערבות טיפולית.

Disclosures

המחברים שאין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים יש אין התודות.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
McCoy’s 5A Modified mediumATCC30-2007
Fetal Bovine Serum (FBS)ATCC30-2020
L-glutamineATCC30-2214
Penicillin-Streptomycin SolutionATCC30-2300
Dulbecco's Phosphate Buffered SalineATCC30-2200No Calcium or magnesium
Trypsin EDTA SolutionATCC30-2101
Aphidicolin 1mgThermo FisherAC611970010
Alt-R CRISPR crRNA, 10 nmolIDTNo catalog number since its made to your specific gene target.
CRISPR-Cas9 tracrRNA, 20 nmolIDT1072533
S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 500 µgIDT1074182
IDTE BufferIDT11-01-03-01
Zeus Electroporation Cuvettes 0.4 CmVWR10497-474
Gene Pulser Xcell Electroporation SystemsBioRad1652660
Bovine serum albumin
lyophilized powder, crystallized, ≥98.0% (GE)		Sigma05470-1G
EDTA (0.5 M), pH 8.0ThermoFisher ScientificAM9260G
Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in WaterThermoFisher ScientificP3566
DNeasy Blood & Tissue Kit (250)Qiagen69581
6-well Standard Line Multiwell Cell Culture PlatesVWR10062-892
Petri DishesFisher12-565-90
Conical Tubes (15 mL) (racked)Thermo FisherAM12500
Trypan Blue Solution, 0.4%Thermo Fisher15250061
Reduced Serum MediumThermo Fisher31985062

References

  1. Mandecki, W. Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis. Proc Natl Acad Sci. 83 (19), 7177-7181 (1986).
  2. Walder, R. Y., Walder, J. A. Oligodeoxynucleotide-directed mutagenesis using the yeast transformation system. Gene. 42 (2), 133-139 (1986).
  3. Moerschell, R. P., Tsunasawa, S., Sherman, F. Transformation of yeast with synthetic oligonucleotides. Proc Natl Acad Sci. 85 (2), 524-528 (1988).
  4. Yoon, K., Cole-Strauss, A., Kmiec, E. B. Targeted gene correction of episomal DNA in mammalian cells mediated by a chimeric RNADNA oligonucleotide. Genetics. 93, 2071-2076 (1996).
  5. Beetham, P. R., Kipp, P. B., Sawycky, X. L., Arntzen, C. J., May, G. D. A tool for functional plant genomics: chimeric RNA/DNA oligonucleotides cause in vivo gene-specific mutations. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (15), 8774-8778 (1999).
  6. Bertoni, C., Morris, G. E., Rando, T. A. Strand bias in oligonucleotide-mediated dystrophin gene editing. Hum Mol Gen. 14 (2), 221-233 (2004).
  7. Alexeev, V., Yoon, K. Stable and inheritable changes in genotype and phenotype of albino melanocytes induced by an RNA-DNA oligonucleotide. Nat Biotechnol. 16 (13), 1343-1346 (1998).
  8. Zorin, B., Hegemann, P., Sizova, I. Nuclear-gene targeting by using single-stranded DNA avoids illegitimate DNA integration in Chlamydomonas reinhardtii. Eukaryot Cell. 4 (7), 1264-1272 (2005).
  9. Brachman, E. E., Kmiec, E. B. DNA replication and transcription direct a DNA strand bias in the process of targeted gene repair in mammalian cells. J Cell Sci. 117 (Pt 17), 3867-3874 (2004).
  10. Pierce, E. A., et al. Oligonucleotide-directed single-base DNA alterations in mouse embryonic stem cells. Gene Ther. 10 (1), 24-33 (2003).
  11. Radecke, S., Radecke, F., Peter, I., Schwarz, K. Physical incorporation of a single-stranded oligodeoxynucleotide during targeted repair of a human chromosomal locus. J Gene Med. 8 (2), 217-228 (2006).
  12. Bertoni, C., Rustagi, A., Rando, T. A. Enhanced gene repair mediated by methyl-CpG-modified single-stranded oligonucleotides. Nucleic Acids Res. 37 (22), 7468-7482 (2009).
  13. Andrieu-Soler, C., et al. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33 (12), 3733-3742 (2005).
  14. Olsen, P. A., Randol, M., Krauss, S. Implications of cell cycle progression on functional sequence correction by short single-stranded DNA oligonucleotides. Gene Ther. 12 (6), 546-551 (2005).
  15. Engstrom, J. U., Kmiec, E. B. DNA replication, cell cycle progression and the targeted gene repair reaction. Cell Cycle. 7 (10), 1402-1414 (2008).
  16. Aarts, M., te Riele, H. Parameters of oligonucleotide-mediated gene modification in mouse ES cells. J Cell Mol Med. 14 (6b), 1657-1667 (2010).
  17. Brachman, E. E., Kmiec, E. B. Gene repair in mammalian cells is stimulated by the elongation of S phase and transient stalling of replication forks. DNA Repair. 4 (4), 445-457 (2005).
  18. Engstrom, J. U., Suzuki, T., Kmiec, E. B. Regulation of targeted gene repair by intrinsic cellular processes. BioEssays. 31 (2), 159-168 (2009).
  19. Parekh-Olmedo, H., Ferrara, L., Brachman, E., Kmiec, E. B. Gene therapy progress and prospects: targeted gene repair. Gene Ther. 12 (8), 639-646 (2005).
  20. Olsen, P. A., Randol, M., Luna, L., Brown, T., Krauss, S. Genomic sequence correction by single-stranded DNA oligonucleotides: role of DNA synthesis and chemical modifications of the oligonucleotide ends. J Gene Med. 7 (12), 1534-1544 (2005).
  21. Wang, Z., Zhou, Z. -. J., Liu, D. -. P., Huang, J. -. D. Double-stranded break can be repaired by single-stranded oligonucleotides via the ATM/ATR pathway in mammalian cells. Oligonucleotides. 18 (1), 21-32 (2008).
  22. Ferrara, L., Kmiec, E. B. Camptothecin enhances the frequency of oligonucleotide-directed gene repair in mammalian cells by inducing DNA damage and activating homologous recombination. Nucleic Acids Res. 32 (17), 5239-5248 (2004).
  23. Ferrara, L., Parekh-Olmedo, H., Kmiec, E. B. Enhanced oligonucleotide-directed gene targeting in mammalian cells following treatment with DNA damaging agents. Exp Cell Res. 300 (1), 170-179 (2004).
  24. Lin, S., Staahl, B., Alla, R. K., Doudna, J. A. Enhanced homology-directed human genome engineering by controlled timing of CRISPR/Cas9 delivery. eLife. 3, 04766 (2014).
  25. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nature Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  26. Rivera-Torres, N., et al. The position of DNA cleavage by TALENs and cell synchronization influences the frequency of gene editing directed by single-stranded oligonucleotides. PLoS One. 9 (5), (2014).
  27. Strouse, B., Bialk, P., Niamat, R. a., Rivera-Torres, N., Kmiec, E. B. Combinatorial gene editing in mammalian cells using ssODNs and TALENs. Sci Rep. 4 (ii), 3791 (2014).
  28. Bialk, P., Rivera-Torres, N., Strouse, B., Kmiec, E. B. Regulation of Gene Editing Activity Directed by Single-Stranded Oligonucleotides and CRISPR/Cas9 Systems. PloS One. 10 (6), e0129308 (2015).
  29. Yu, C., et al. Small Molecules Enhance CRISPR Genome Editing in Pluripotent Stem Cells. Cell Stem Cell. 16 (2), 142-147 (2015).
  30. Rivera-Torres, N., Banas, K., Bialk, P., Bloh, K. M., Kmiec, E. B. Insertional Mutagenesis by CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Gene Editing in Cells Targeted for Point Mutation Repair Directed by Short Single-Stranded DNA Oligonucleotides. PLoS One. 12 (1), e0169350 (2017).
  31. Mali, P., et al. CAS9 transcriptional activators for target specificity screening and paired nickases for cooperative genome engineering. Nat Biotechnol. 31 (9), 833-838 (2013).
  32. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  33. Ran, F. A., et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature. 520 (7546), 186-191 (2015).
  34. Richardson, C. D., Ray, G. J., DeWitt, M. A., Curie, G. L., Corn, J. E. Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnol. 34 (3), 339-344 (2016).
  35. Slaymaker, I. M., Gao, L., Zetsche, B., Scott, D. A., Yan, W. X., Zhang, F. Rationally engineered Cas9 nucleases with improved specificity. Science. 351 (6268), 84-88 (2016).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

126CRISPR Cas9oligonucleotides

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved