점 돌연변이 수리 CRISPR/Cas9 및 SsODN 인간 세포에 의해 촉매의 기능으로 현지 변이 검사 하는 표준 방법론

요약

이 프로토콜 편집 시스템 복구에 대 한 포유류 세포에 있는 점 돌연변이의 CRISPR/Cas9 기반 유전자의 워크플로 설명 합니다. 여기, 우리 유전자 편집 대상 사이트에서 indel 형성을 측정 하기 위한 상세한 후속 실험 전략으로 조합 방식을 사용-본질적으로, 현장 mutagenesis 분석.

초록

조합 유전자 편집 CRISPR/Cas9를 사용 하 여 단일 가닥 oligonucleotides 단일 자료 점 돌연변이, 종종 다양 한 인간 상속 된 장애에 대 한 책임은의 교정에 대 한 효과적인 전략 이다. 잘 설립 셀 기반 모델 시스템을 사용 하 여, HCT116 세포에 통합 단일 복사 돌연변이 eGFP 유전자의 점 돌연변이 복구 되었습니다이 조합 방식을 사용 하 여. 수정 하 고 수정 되지 않은 세포의 분석 대상 사이트를 둘러싼 DNA 시퀀스에서 수정 되지 않은 셀에서 indels를 만든 경우 유전자 편집의 정밀도 유전자 변의 개발 보여준다. 여기, 측정 대상 사이트에서 indel 형성 하는 상세한 실험 전략 함께 점 돌연변이의 유전자 편집이 조합 접근을 분석 하는 데 사용 하는 특정 방법론 설명 이다. 이 프로토콜 기초 접근 및 인간 치료에 대 한 편집 CRISPR/Cas9 기반 유전자를 개발 하기 위한 수사에 대 한 워크플로 설명 합니다. 이 작품의 결론 그 현장 mutagenesis 일어난다 CRISPR/Cas9 활동 결과로 포인트 돌연변이 복구의 과정에서 이다. 이 작업 장소에 임상 구현에 대 한 향하는 모든 접근의 중요 하 고 중요 한 부분 이어야 한다 mutagenesis의 정도 식별 하는 표준화 된 방법론을 박 았.

서문

Mandecki (1986)에 의해 연구를 개척 oligonucleotides 박테리아¹, Walder 동안 변모와 Walder (1986) 효 모²에서 비슷한 연구를 실시를 사용 하 여 플라스 미드 DNA에 영구적인 변화를 설명 했다. 잠시 후, 셔먼과 동료 출판 일련의 논문 단일 가닥 oligonucleotides 유전자³상속 변경 하 효 모 세포에 도입 되었다. 미생물 세포에서 정액 작품에 건물, Kmiec와 동료 포유류 세포⁴단일 기본 복구를 지시 하는 독특한 단일 에이전트 oligonucleotides 개발 하기 시작 했다. 이 개념은 베어링 RNA 분자 DNA 기초의 구성 보다는 대상 사이트에 더 긴밀 하 게 바인딩하는 생 화 확 적인 데이터를 기반으로 합니다. 공상 oligonucleotides^5,,67를 사용 하 여 유전자 편집 성공의 수많은 보고 했지만 편집 수준 남아 실험 사이 및 다른 목표/셀에 걸쳐 매우 다양 조합입니다.

기증자가 단일 가닥 DNA는 DNA 이중 가닥 기증자에 게 선호 무작위로⁸게놈 내의 사이트를 통합 하는 때문입니다. 그러나, 것 도입된 단일 가닥 oligonucleotides 셀룰러 nucleases에 의해 급속 한 저하 하는 경향이 있다. 저하에서 oligonucleotides의 termini를 보호 하기 위해 몇 가지 전략을 채용 했습니다. Exonuclease 보호, 단일 가닥 DNA을 원하는 시퀀스를 포함 하는 0.1-1에서 편집 효율성을 얻기 위해 충분 한 % 범위⁶. 개선 하 고 보다 일관성 있는 transfection 기법, phenotypic 해독과 함께 더 일관 된 여러 연구 그룹^{8,,910,11, 편집 허용 12,13}.

지난 10 년 동안 더 많은 의무가 유전자 편집 대상 셀 수 있도록 상당한 노력이 하고있다. 한 전략은 세포 주기^14,,1516의 변조를 사용합니다. 에 도입 단일 가닥 oligonucleotides (ssODNs)와 정상적인 반응 조건 하에서 주파수를 편집 하는 동안 경작된 한 포유류 세포 0.1%와 1% 증가 3-에 5 배 때 편집 하는 유전자의 주파수 사이 였다는 oligonucleotides S 단계를 통해 그들의 전환 중 세포에 도입 되었다. 별도 일련의 실험, Brachman 및 Kmiec (2005) 시연 (3-5%)를 편집 하는 정확한 유전자의 상대적으로 높은 수준의 2'3 ' dideoxycytosine (ddC)는 oligonucleotide^{17의 추가 이전 24 시간에 대 한 셀에 알을 품을 때 가져온} . ddC는 DNA 복제 포크 운동, 제안 하는 활성 복제^11,18의 지역으로 ODNs의 설립을 포함 한다 유전자 복제 가능성이 셀에 ssODNs에 의해 편집의 속도 감소 시킨다. 이러한 연구 기증자 DNA 유전자 편집, 행동의 진정한 메커니즘의 일환으로 성장 복제 포크에 통합 된다 개념에 찍은 더블-좌초 휴식 있는지 여부 또는 아니라¹⁹의 독립적인 함께. 따라서, 점 돌연변이의 수정 또는 염색체 내 DNA의 세그먼트의 교체는 DNA 페어링 및 단일 가닥 동화 통로 통해 발생합니다.

유도 하는 성장 하는 작은 분자 에이전트와 셀에 임의의 이중 가닥 DNA 나누기는 DNA 복제 이벤트는 실속 된 셀 피해^20,21을 복구 하는 시도 환경을 만듭니다. 복제 포크의이 일시적인 침체 개선 대상 접근¹⁵단일 가닥 편집 oligonucleotides 여 chromatin 구조의 더 효율적인 침투를 수 있습니다. 이중 가닥 DNA의 창조 VP16, bleomycin, 같은 약물에 의해 휴식 또는 camptothecin^22,23, 거의 10 배 수준으로 편집 하는 유전자를 자극을 보여왔다 최대 6-8%. 그러나, 무작위 이중 가닥 DNA 틈 치료 설정에서 바람직하지 않습니다.

프로그래밍 가능한 nucleases와 oligonucleotides 편집 진은 또한 세포 분열^24,25. 동안 자극 핵 산 기반 배달 했다 동기화 된 HCT 116 셀에 수리 homology 감독을 수행 하는 데 사용 됩니다 때 리 베라-토레스와 동료 시연 활동을 대상으로 동일한 증가 때 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 nucleases (TALENs) 단일 가닥 oligonucleotides 복제 세포 인구^26,27 에 둘 다 고용. 더 최근에, Bialk와 동료 단일 가닥 oligonucleotides와 단일 기본 돌연변이의 수리 및의 배열을 클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복 Cas9을 보여주었다 (CRISPR/Cas9) 분자 일어난다 더 높은 효능 때 셀 인구가 S 단계²⁸을 이동 하 고 있다. CRISPR 분자 RNA 및 기능 대상 분열에 대 한 지정 된 DNA 시퀀스 내에 있는 영역을 식별 하는 구성 됩니다. Cas9는 세균성 효소의 기능은 nucleolytic 교환 반응에 이중 가닥 DNA를 쪼개 다입니다. 따라서, CRISPR, 게놈 목표에 복잡 한 위치 하 고 Cas9 nuclease 더블-좌초 휴식을 실행 합니다. 린 외. (2014) 또한 세포 주기 유전자의 높은 주파수를 달성 하기 위한의 중요성을 설명 했다 기본 신생아 섬유 아 세포, 인간 배아 줄기 세포에에서는 수정 된 CRISPR/Cas9 ribonulceoprotien (RNP) 복잡 한 중재 전달 시스템을 사용 하 여 편집 및 다른 셀 라인²⁴. 따라서, 유전자 편집 및 단일 에이전트 유전자 편집에 대 한 세포 주기 진행 간에 설정 된 관계 조합 유전자 프로그래밍 가능한 nucleases 및 기증자 DNA 서식 파일을 사용 하 여 편집에 적용 됩니다. 동안 유전자 편집에 조합 접근을 가져왔다 함께 기증자 DNA 템플렛으로 파트너의 다양 한, 분야에 대부분 노동자 더블-좌초 휴식 기능을 제공 하 CRISPR/Cas9를 사용 합니다. 이 선택이 특정 유전자 도구와 함께 그것은 채택 될 수 있다 유전자 기능을 사용 하지 않도록 설정 하거나 특정 사이트에 DNA의 외국 작품을 소개 하는 유연성의 사용의 용이성에 입각 한입니다. 기술적으로 녹아웃의 세대 유전자 대체, 어디 질병 사이트에 유전자의 "올바른" 또는 정상의 합동 실행 되어야 한다 정밀도와 쉽게 비교 합니다. 연구원의 수는 식별 하 고 특정 약물과 돌연변이 기지의 교정 및 높은 주파수²⁹에서 적절 한 위치에 정상 유전자 시퀀스의 삽입 시 약의 사용을 공부.

최근, 리 베라-토레스 외. ³⁰ 사용 조합 진 편집, 특별히 설계 된 CRISPR/Cas9 시스템 및 유전 정보를 복구 하는 단일 가닥 oligonucleotide 기증자 DNA 템플렛에 의해 제공의 더블-좌초 휴식 활동을 활용 한 점 돌연변이향상 된 녹색 형광 단백질 (eGFP) 유전자의 단일 복사본은 HCT116 셀에 통합. 저자가 잘 특징 모델 셀 라인 평가 대상 사이트를 둘러싼 분열의 특이성을 이용을 했다. 데이터는 대상 사이트에서이 존재, 특히 수정된 지점 돌연변이 포함 하지 않는 셀에서에서 공개. 이 원고에서 우리는 상세 하 고 집중이 노동자 현장 mutational이 CRISPR/Cas9 유전자 편집에 의해 만들어진 검사 하는 데 사용 하는 방법론에 따라.

프로토콜

다음 프로토콜 포유류 세포를 가진 작업을 포함, 살 균 기술/셀 문화 친숙 예상.

1. 셀 라인 문화 조건과

1. HCT 116 셀의 문화에 대 한 매체의 하 게 500 mL: 맥 코이 ' s 5A 매체 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 2 m L-글루타민, m 및 1% 페니실린 (이것은 완전 한 보완 수정 매체).
   참고: HCT 도금 전에 T-75 또는 T-175 플라스 크에 116-19 세포 성장. 때 90% 합칠 각 T-75 플라스 크 8.4 10 ⁶ 셀, 대략 5 10 cm 접시, x를 얻을 것입니다 그리고 각 T-175 18.4 x 10 ⁶ 셀, 약 15 10 cm 접시를 얻을 것입니다.

2. 플라스 크에서 세포를 수확

1. 매체 떨어져 발음, Dulbecco로 씻어 ' 칼슘과 magniesium (PBS) (10 mL T-75 또는 T-175 25 mL), 및 aspirate 없이 Phosphate-Buffered 염 분 s.
2. 추가 트립 신 2 mL 피 펫 (2 mL T-175 또는 T-75 1 mL)을 사용 하 여 플라스 크에 dropwise 분리를 셀 수 있도록 5 분 동안 37 ° C, 5% CO ₂ 배양 기에 플라스 크를 놓습니다.
3. 모든 셀 제거 되 고 다음 완전 한 매체 (8 mL T-175 또는 4 mL T-75) 플라스 크의 전체 표면에 걸쳐 분산 하 여 담금질 되도록 플라스 크를 누릅니다.
4. 헤어 셀 덩어리 지 고 15 mL 원뿔 튜브에 세포를 전송에 여러 번 왔다 갔다 피 펫
5. 셀 회전 하기 전에 아래로, 15 mL 원뿔에서 10 µ L 고 trypan 블루는 셀의 10 µ L 결합. 작은 셀 공의 125 g x 16에서 5 분 동안 회전에 의해 ° c.

3. 셀 계산

trypan 블루는 hemocytometer

1. 전송 10 µ L 셀의 혼합. (각 표에 포함 되어 있습니다 16 제곱) 외부 4 격자 계산.
   1. 16 모서리 사각형의 각 집합에서 평균 세포 수 걸릴.
   2. 10, 000을 곱합니다 (10 ⁴).
   3. Trypan 블루 추가 희석에 대 한 해결 하기 위해 세포를 수확 하는 데 사용 하는 매체의 총 볼륨 곱합니다.
      참고: resuspend 셀을 볼륨을 계산 하 방정식 형식 다음과 같습니다:
      
      

4. 셀을 도금

1. 동기화 할 셀의 각 10 cm 접시 추가 완전 한 매체의 5 mL 및 aphidicholin (200-증거 에탄올에 2.5 m m 재고 12 µ L)의 6 µ M.
2. 전송 100 µ L 다시 일시 중단 된 세포의 작은, 2.5 x 10 ⁶ 셀, 각 10 cm 접시와 부드럽게 혼합 하는 소용돌이.
3. 16-24 h g 1/S 국경에서 세포 동기화를 위한 37 ° C, 5% CO ₂ 접시를 품 어.

5. Aphidicolin 동기화에서 셀 공개

1. 대상으로, 이전 4 h 발음 매체, PBS로 세척, PBS, 발음 및 완전 한 매체의 5 mL을 추가
2. 37 ° C에서 4 h의 5% CO ₂ 배양 기에 다시 배치

6. RNA Complexing

1. 입력 장 실험실 돌연변이 eGFP 유전자 시퀀스 ' s 온라인 생성기 ²⁵ (http:// crispr.mit.edu/) 시퀀스를 대상 사이트에 가까운 근접에 바인딩하려면 CRISPR 가이드를 선택 하십시오. 상용 소스에서 CRISPR 가이드 시퀀스를 가져옵니다.
2. 는 CRISPR RNA (crRNA), 트랜스 활성화 crRNA (tracrRNA), 및 20 ° C에서 Cas9 단백질 저장 고 제조 업체의 제안에 따라 사용 합니다.
   1. 믹스 RNA crRNA의 200 µ M 재고 및 1.5 mL 원심 분리기에 tracrRNA의 200 µ M 주식 6.75 µ L의 45 µ M. 추가 6.75 µ L에 아데닌 농도에 관. 추가 30 µ L의 최종 볼륨을 테 버퍼의 16.50 µ L.
3. PCR 기계 나 열 블록에 5 분 동안 95 ° C에서 열.
   주의: 핫!
4. 실내 온도에 냉각 허용.
   참고: 경우 PCR 기계를 사용 하 여 0.2 ° C에 냉각 설정/s.
5. 각 샘플에 대 한 다음 단계를 수행합니다.
   1. 5 µ L의 최종 볼륨을 테 버퍼 (10 mM Tris, pH 8.0과 0.1 m m EDTA, pH 8.0)의 2.78 µ L에서 복잡 한 crRNA:tracrRNA의 µ L 희석 2.22.
   2. 희석 1.67 µ L Cas9 단백질의 낮은 혈 청 매체의 3.33 µ L에서 60 µ M 재고에서 5 µ L의 최종 볼륨을.
6. Complexed RNA의 5 µ L 함께 Cas9 단백질의 혼합 5 µ L

7. 타겟팅에 대 한 셀을 수확

1. Aspirate 매체, PBS의 5 mL로 세척 PBS, 발음 및 각 10 cm 접시에 미리 따뜻하게 trypsin의 1 mL을 추가. 5 분에 대 한 37 ° C, 5% CO ₂ 인큐베이터에 접시를 넣어
2. 모든 셀 제거 되 고 다음 완전 한 매체의 4 mL와 함께 접시의 전체 표면에 걸쳐 분산 하 여 냉각 되도록 10 cm에 탭.
3. 헤어 셀 덩어리 지 고 15 mL 원뿔 튜브에 세포를 전송에 여러 번 왔다 갔다 피 펫.
4. 셀 회전 하기 전에 아래로, 15 mL 원뿔 튜브에서 10 µ L 고 trypan 블루는 셀의 10 µ L 결합. 125 x g 및 실 온에서 5 분 동안 회전 하 여 셀을 펠 렛.
5. 매체를 발음 하 고 PBS의 5 mL로 씻어. 실 온에서 5 분 125 x g에서 회전 하 여 셀을 펠 렛.

8. 셀 계산

trypan 블루는 hemocytometer

1. 전송 10 µ L 셀의 혼합. (각 표에 포함 되어 있습니다 16 제곱) 외부 4 격자 계산.
   1. 16 모서리 사각형의 각 집합에서 평균 세포 수 걸릴.
   2. 10, 000을 곱합니다 (10 ⁴).
   3. Trypan 블루 추가 희석에 대 한 해결 하기 위해 세포를 수확 하는 데 사용 하는 매체의 총 볼륨 곱합니다.
      참고: 다음 계산 resuspend 셀을 볼륨을 방정식 형식입니다. 혈 청 무료 맥 코이에 셀의 필요한 수를 다시 중단 ' s 5A 수정 매체.
      
      

9. 샘플을 대상으로

1. 100을 전송 세포 현 탁 액 (5 x 10 ⁵ 셀) 단계 8.1에서에서 각 electroporation 4 m m 간격 베트 게의 µ L. 5 x 10 ⁵ 셀 밀도에서 세포의 단계 6.7 ~ 100 µ L에서 복잡 한 RNP의 10 µ L를 추가 합니다. ODN 추가 (2 µ M) 각 샘플.
   참고: 긍정적인 통제에 대 한 eGFP 1 µ g / µ L 플라스 미드
   1. 표현에서 1 µ L electroporation 기계 선반을 추가 가볍게 터치 하는 각 샘플을 챔버에 배치. Electroporate 250 V, 라스베가스; 2 펄스, 1 s; 13 ms; 유 니 폴라 펄스.
2. 랙 후드에 다시 전송. 완전 한 매체의 잘 포함 2 mL에 각 샘플을 전송 나n 6 잘 플레이트입니다. 보정 수준에 대 한 확인 하기 전에 72 h에 대 한 37 ° C, 5% CO ₂에서 품 어.

10. 유전자 편집 셀과 Transfection 효율의 분석

1. 발음 매체 및 2 mL의 PBS로 세포 세척. PBS를 발음 하 고 6 잘 플레이트의 각 음을 미리 데워 trypsin의 500 µ L를 추가 합니다. 5 분에 대 한 37 ° C, 5% CO ₂ 인큐베이터에 접시를 넣어
2. 되도록 모든 셀 dislodged 됩니다 다음 완전 한 매체의 1 mL와 우물의 전체 표면에 걸쳐 분산 하 여 냉각 접시를 누릅니다.
3. 1.5 mL 원심 분리기 튜브 및 실 온에서 5 분 동안 5000 x g에서 펠 릿으로 세포를 통과.
4. 발음 매체. FACS 버퍼 (0.5 %BSA, 2 mM EDTA, 그리고 PBS에서 2 µ g/mL propidium 요오드 화물)의 500 µ L에서 셀 펠 릿을 다시 중단.
5. Cytometry 셀 형광 (eGFP +) 측정.
   1. 리 베라 토레스 외 ³⁰에 설명 된 대로 각 샘플에서 라이브 셀의 총 수 총 라이브 eGFP 긍정적인 세포의 백분율로 보정 효율 계산.

11. DNA 순서 분석

1. Electroporate 동기화 하 고 발표 HCT 5 x 10 ⁵의 농도에 116-19 셀   셀/100   µ L, 100 pmols 및 72NT에서 복잡 한 RNP와 2.0 µ M에서 ODN.
2. 6 잘 플레이트 세포를 전송 하 고 72 h.를 복구 하도록 허용
리 베라-토레스 외 ³⁰에 설명 된 대로
3. 개별적으로 +, eGFP 488 nm (100 mw) 레이저와 FACS 정렬을 사용 하 여 96 잘 접시에 세포를 정렬.
   참고: 모든 우물에 성공적으로 성장 합니다.
4. 확장 셀 이상 6 주 하 고 7 단계에서 설명한 대로 수확.
5. 성장, 상업적으로 이용 가능한 DNA 분리를 사용 하 여 셀룰러 gDNA를 격리 하는 우물에서 키트 (테이블의 자료를 참조) 하 고 증폭 PCR을 통해 기본 대상 주변 지역 (718 혈압; 앞으로 뇌관 5 '- ATGGTGAGCAAGGGCGAGGA-3 ' 및 뇌관 5 역 '-ACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3 ').
6. 샘플에 수행 DNA 시퀀싱 분석.

결과

우리는 HCT116 셀에 단일 복사본으로 통합 eGFP 유전자 내에 포함 된 점 돌연변이의 교정에 의존 하는 포유류 세포에서 유전자 편집 공부 모델 시스템을 사용. 그것은 이것이 단일 사본 유전자; 따라서, DNA 변경 또는 mutagenesis의 보다 적게 복잡 한 보기를 만들 수 있습니다. 그림 1A 는 대상된 기지 정지 codon 태그, 빨간색으로 강조 표시의 3 루와 돌연변이 eGFP 유전자 시퀀스를 표시 합니다. 72 베이스 oligonucleotide eGFP 유전자 (72NT)의 비 복사할 가닥에 부분적으로 무료 이며 기본 exchange G에서 C 유도 하도록 설계 되었습니다, 또한 그림입니다. 또한, 한 5'에서 3' 방향, 표시 된 protospacer 순서를 가진 2 C로 지정 하는 CRISPR은 또한 그림 1A에 그려져 있습니다. 이 유전자 편집 반응을 수행 하기 우리는 Cas9 유전자의 구성 된 포유류 표정 벡터를 사용 하는 대신 CRISPR (cr) RNA와 순화 Cas9 단백질 (그림 1B)에 결합 하는 tracr (tr) RNA로 구성 된 ribonucleoprotein (RNP)를 사용 하 고 적절 한 특정 가이드 RNA 순서입니다.

특별히 설계 된 RNP 입자 electroporation, 편집, 유전자에 의해 HCT116 셀에 단일 가닥 oligonucleotide 함께 배달 되 면 eGFP에서 단일 기본 돌연변이의 수리에 의해 입증, 흐름을 사용 하 여 보육의 72 h 후 관찰 cytometer입니다. 기능 복구 대상된 셀,이 형광 때문에 정렬 하 여 전체 모집단에서 분리 될 수 있는 셀에에서 녹색 형광의 출현에 의해 관찰입니다. 그림 2에서 같이, 점진적인 복용량 응답 RNP와 72NT 증가의 조정된 수준으로 볼 수 있습니다. 분자 비율, RNP, picomoles 및 72NT는 그림에 표시 된 대로의 micromolar 집중 Cas9 및 transfected 식에서 특정 가이드 RNA의 도입에 의존 하는 유전자 편집 반응에 사용 되는 최적의 복용량에 기반 벡터 스 그림 2에서 인세트 표시 유전자 편집 반응 RNP 입자의 부재에 실시 됩니다. 여기, 대상된 세포의 약 1 %72NT oligonucleotide의 사진 높은 농도 단일 에이전트 유전자 편집 반응에 사용 될 때 수정 됩니다.

대상 사이트는 소위 현장 mutagenesis 효과에 유전이 있는지 여부를 확인 하기 위해-우리는 유전자 활동 개별 셀에서 편집의 결과 검사 하기로. 전체 인구, 유전 발자국 또는 병 변의 진정한 측정 검사 clonally 확장 된 세포의 게놈은 때 확인 될 수 있다 보다 훨씬 더 힘 드는 동안. 우리만 100 pmol RNP 복잡 한의 및 72NT oligonucleotide의 2.0 µmol을 사용 하이 여 그림 2에 설명 된 실험을 반복 했다. 로 위, HCT 116 셀 aphidicholine 24 h에 대 한 동기화 되었고 G1/S 국경에서 체포. 나중에 4 h, 셀 릴리스된 및 유전자 편집 도구 electroporation에 의해 소개 되었다. 72 시간 후, 셀 FACS를 사용 하 여 및 96 잘 접시 (실험 과정은 그림 3에 나와 있는)에 개별적으로 정렬 분석 했다. 셀 녹색 형광 표시 했다 cytometry 클론 확장을 위한 96 잘 접시의 개별 우물으로에 정렬 됩니다. 중요 한 것은, 셀 eGFP 식 부족 또한 고립 되었고 동일한 조건 하에서 확장에 대 한 비슷한 방식으로 정렬.

14 일 후의 성장, 개별 클론의 대부분 DNA 격리 수 있도록 충분히 확장 했다. 이와 같이 eGFP 긍정적인 샘플의 16 클론 선택 했다, 및 유전 무결성 대상 사이트를 둘러싼 DNA 연속 분석. 정보는 인구 내의 대립 유전자의 DNA 시퀀스를 둘러싼 생어 시퀀싱을 wildtype 대립 유전자 (그림 4A)의 순서를 비교할 시퀀스 시각화 소프트웨어를 사용 하 여 조립를 사용 하 여 생성 되었습니다. RNP 복잡 한 컷된 사이트 (2 C crRNA) 바 녹색에 있는 검은색 화살표로 표시 됩니다. 에서와 같이 또한 그림 4A, 모든 16 eGFP 긍정적인 세포 예측된 뉴클레오티드 교환 대상 사이트에 포함 되어 있습니다. 변환 된 C 잔류물 빨간색으로 강조 표시 됩니다 하 고 정확한 변화를 반영 하는 피크 프로필 eGFP 긍정적인 시퀀스 아래 제공 됩니다. 비슷한 패션에 15 비 녹색 클론 격리 충분히 DNA 추출 수 있도록 확장을 시퀀싱, 대상 사이트에이 대 한 분석 했다. 예측, 약 절반 샘플에서 아무 DNA 자료 교환 관찰 되었다. 이 그림 4B와 같이 대상 사이트에서 G 잔류물의 유지 보수에 반영 됩니다. 이 실험에서 시험 하는 클론 확장의 나머지 표시 녹색 형광의 부족에 대 한 회계 따라서 삭제 돌연변이의 유형이 다른 인구. 삭제 크기 19 기지 한 기지에서 ranged. 우리만 eGFP 긍정적인 세포의 15 샘플을 검사 하 고 우리가 믿는 동안이 CRISPR/Cas9 활동에 의해 남겨진 유전자 변의 종류의 매우 대표입니다, 가능성은 그 다른 유형 또는 indels의 형태를 주의 하는 것이 중요 하다 대상된 인구에 있을 수 있습니다.

함께 찍은, 그림 4 에 표시 된 결과 eGFP 타겟팅 시스템에서에서 phenotypic 판독을 확인 합니다. C 뉴클레오티드 G의 변환 수정된 HCT116 세포에서 녹색 형광의 출현을 수 있습니다. 이 실험에 대 한 격리 클론 또는 이전 실험^27,28없음 기본 대체 대상 사이트를 둘러싼 관찰 되었습니다. 또한이 데이터 셀 유전자 돌연변이 포인트 복구를 통해 편집을 실패 교정 하지만, 경우에 따라 불변 하지, 대상 사이트를 둘러싼 유전이 성분의 범위와 유지 하는 방법을 보여 줍니다.

그림 1입니다. (유전자 돌연변이 eGFP 유전자의 편집에 대 한 A) 모델 시스템. Wildtype 가진 시퀀스의 중심에 위치한 대상된 codon 돌연변이 eGFP 유전자의 적절 한 세그먼트는 각각 녹색과 빨강에 표시 됩니다. 뉴클레오티드 교환 대상으로 굵게 표시 하 고 밑줄. 블루 대표에는 강조 표시 된 기지 2 C CRISPR protospacer 시퀀스 및 오렌지 기지 강조 팸 사이트. 이 실험에서 사용 하는 oligonucleotide는 3 터미널 기지; 수정 phosphorothioate 결합을 베어링 길이 72 기지 72-메 르 대상으로 복사할 비 (NT) 스트랜드 (72NT). (B) CRISPR/Cas9ribonucleoprotein 어셈블리 반응입니다. crRNA 대상 특이성을 (20 기초, 빨간색 섹션)에 해당 하는 2 C protospacer 시퀀스와 상호 작용 도메인 (블루) tracrRNA (녹색)와 함께 제공 합니다. crRNA 및 tracrRNA 아데닌 농도에서 단련 된다. Cas9 단백질 (회색) RNP 조립을 완료에 추가 됩니다. 가이드 RNAs (gRNAs) 직접 고 Cas9 endonuclease 활성화는 다음 대상 DNA를 쪼개 다. 그림의 아래쪽 구역 2 C 씨 시퀀스 tracrRNA 시퀀스를 보여 줍니다. 이 그림에서 리 베라-토레스, 북 아 일 외. 수정 (2017). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 2입니다. 편집 진은 RNP와는 ssODN에 의해 지시 될 때 복용량 의존은. 동기화 및 발표 HCT 116-19 셀 electroporated CRISPR/Cas9 RNP의 24-120 pmol와 0.6-3.0 했다 72mer의 µ M. 72-h 회복 기간 후 진 편집 활동 교류 cytometer를 사용 하 여 측정 했다. 유전자 편집 가능한 eGFP 긍정적인 세포 인구에 있는 가능한 셀의 총 수로 나눈 수에 의해 결정 수정 효율 (%)로 표시 됩니다. 오차 막대는 표준 오차의 기본 계산을 사용 하 여 세 가지 별도 실험을 통해 생성 하는 데이터 포인트의 3 세트에서 생산 됩니다. 삽입: 단일 에이전트 유전자 편집. 단일 가닥 oligonucleotide (72NT) 동일한 조건 하에서 복잡 한 RNP의 부재에 의해 지시 하는 유전자 편집 활동 증가 농도의 기능으로 제공 됩니다. 이 그림에서 리 베라-토레스, 북 아 일 외. 수정 (2017). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 3입니다. 단일 세포 클론의 절연을 위한 실험 전략. 셀 eGFP 식 전시는 긍정적이 고 정렬 사용 하 여 교류 cytometer 단일 셀으로 개별 우물에 클론 확장으로 득점 했다. 셀 eGFP 식 부족 격리와 비슷한 방식으로 정렬 되었고 동일한 조건 하에서 확장. DNA는 다음 격리 되었고 eGFP 유전자 증폭 생어 대상이 대상 사이트를 둘러싼 진 편집 활동을 분석 하는 시퀀스. 이 그림에서 리 베라-토레스, 북 아 일 외. 수정 (2017). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

그림 4입니다. (A) 유전자 분석 eGFP 긍정적인 세포의 클론 인구로 확장. Clonally 고립 그리고 확장된 eGFP 긍정적인 샘플 (16 클론) 했다 각 대상된 자료와 DNA를 둘러싼 사이트에서 분석, 수확, 정화, 증폭, 시퀀스. 유전자 분석은 생어 시퀀싱, 시퀀스 시각화 소프트웨어를 사용 하 여 조립 및 시퀀스 그림의 상단에 설명 된다 wildtype 대립 유전자의 비교를 사용 하 여 실시 되었다. RNP 복잡 한 컷된 사이트 (2 C crRNA) 바 녹색에 있는 작은 검은 화살표로 표시 됩니다. (B) EGFP 부정적인 세포의 유전자 분석으로 클론 인구 확장. 15 개별 샘플, 수정 되지 않은 인구에서 발생 하는 클론에서 확장 했다 무작위로 선택 하 고 대상 뉴클레오티드를 둘러싼 사이트에서 indel 형성에 대 한 분석. 로 위, 유전자 분석 실행 되었다 생어 시퀀싱 및 시퀀스 시각화 소프트웨어를 사용 하 여 조립 사용 하 여. 다시 한번, RNP의 컷된 사이트 함께 그림 상단에 wildtype 대립 유전자의 순서 대로 표시 됩니다. 이 그림에서 리 베라-토레스, 북 아 일 외. 수정 (2017). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

토론

편집 하는 유전자는 주로 CRISPR/Cas9 시스템의 출현 때문에 주류 과학 교과로 떠오르고 있다. 세균성 세포의 입양 면역을 용이 하 게,이 놀라운 통로 인간의 염색체에 있는 genomic 변경을 활성화 하는 분자 도구로 용도가 변경 했다. CRISPR/Cas9의 자연 함수는 바이러스 성 DNA 이중 가닥 DNA 나누기 조각화^30,31선도 도입 하 여 사용 하지 않도록 합니다. 이 활동에서 외 인 DNA를 침입의 파괴 그리고 간결한 면역 같은 바이러스 성 입자에 의해 연속적인 감염을 억제 하는 리드. 놀랍게도,이 시스템 전시 폐 렴 성 문제, 그 이전 감염 이벤트에 의해 만들어진 특정 CRISPR gRNA를 다시 활성화할 수 있습니다.

효율성과 유전자 장애 CRISPR/Cas9에 의해 촉매의 정확도 사용 되었습니다 수많은 진 핵 유전자 시스템 목표 작동 유전자^32,33를 사용 하지 않도록 했다. 기저 수준으로 감소, 프로세스의 두 가지 기본 단계 구성 되어 있습니다. 첫 번째 두 번째 비 동종 끝 결합 (NHEJ) 녹아웃 완료의 고유의 프로세스에 의존 하는 동안 더블-좌초 휴식 이다. 대부분의 경우, 블런트-엔드의 창조에 더블-좌초 휴식 결과 버너 염색체 세그먼트, NHEJ에 관련 된 효소 염색체 틈에 반응 하 고 만들 깨진된 끝에 행동. 이 프로세스 때로는 절단된 사이트에서 개별 뉴클레오티드의 손실을 포함할 수 있다. 심지어 몇 기지의 손실 frameshift, 수 있고 기능 식 중단. NHEJ의 자연적인 과정을 참여 하 여 유전자 녹아웃을 만들 CRISPR/Cas9의 사용은 혁명 진 핵 세포 유전학; 대상 사이트에서 DNA의 손실 예측 가능 하 고 예상 되는.

유전자 녹아웃, 달리 연구자의 수 리디렉션 및 repurpose homology 감독 복구의 과정으로 CRISPR/Cas9 활동을 하려고에 종사 되었습니다. 연구의 목적은 유전자 수정입니다. 이 전략에 CRISPR/Cas9 선된 오류를 복구 하거나 건강 한 유전자에 돌연변이 삽입 하는 유전 정보를 제공 하는 기증자 DNA 템플렛와 결합 된다. 초기 보고서 homology 감독 수리를 진작에 CRISPR/Cas9의 놀라운 능력을 강조 표시 (직접 또는 간접적으로) 프로세스는 고도로 정밀한 패션^24,34에서 발생 했습니다. 우리의 실험실 homology 감독 수리 또는 유전자 수정 사용 하 여 단일 가닥 oligonucleotides 시도 메커니즘 및^{15,17,18 그것을 둘러싼 규제 회로 정의 공부 하고있다 ,23}. 우리 때문에 이것이 가장 기본적인 유전자 변이 많은 상속 된 장애에 대 한 책임 것으로 알려진 단일 지점 돌연변이 편집 진에 주로 집중 했다. 유전자 편집의 기본적인 지식을 우리의 indels의 형성에 유전자 녹아웃 결과에 CRISPR/Cas9 함수 이후 이러한 반응에 CRISPR/Cas9 활동의 정밀도 질문을 이끌었다. 우리 분명 reductionist 패션에서 현장 mutagenesis 연구, 선택 가능한 비 아직 임상 관련 유전자 보다는 잘 정의 된 모델 시스템 사용. 어떤 유전자에 따라 교정 모두 genotypic 및 phenotypic 수준에서 측정 될 수 있다 간단한 대상 유전자를 사용 하 여 우리 권유 대상 사이트에서 발생이 안정적이 고 강력한 패션에서 확인 될 수 있었다.

우리의 데이터 편집 시스템 확립 유전자 돌연변이 eGFP 구성 된 유전자 HCT116 셀에 통합 제공할 수 있는 유전 병 변 및 현장 mutagenesis의 프로세스의 생성에 관한 기초 정보를 확인 합니다. CRISPR/Cas9 및 단일 가닥 oligonucleotide 기증자 DNA 분자에서에서 일하고 eGFP 유전자의 점 돌연변이의 정확한 복구 될 수 있습니다. 우리는 기증자 DNA 돌연변이 기지, 우리가 정확한³⁰을 불리는 과정의 수리에 대 한 복제 서식 파일 역할을 있는 분자 통로 점 돌연변이의 수리에 대 한 새로운 모델을 제안 합니다. 수정 된 표현 형을 전시 하지 대상된 인구 이기종 포함 하 고 DNA indels 대상 사이트를 둘러싼에 이르기까지 널리 셀의 다양 한 표시 됩니다. 교정된 인구에서 고립 약 절반 클론 삭제 mutagenesis 대상 사이트에서 관찰 되었다. 이후 이전 보고서는 단일 가닥 oligonucleotides 역할을 단일 에이전트 유전자 편집 도구 대상 사이트에서 indels를 일으킬 수 있다, 우리는 결론 CRISPR/Cas9 활동은이 돌연변이 대 한 책임을 표명 했다.

이 원고 대상 사이트에서 유전자이 안정적이 고 강력한 패션에서 측정 될 수 있도록 자세한 방법을 제공 합니다. 동안 엄청난 양의 주의 분석에 지급 되었습니다 그리고 오프 사이트 mutagenesis의 매핑, 이기종 돌연변이 대상 사이트에서 만든 임상 분야에서 편집 하는 유전자의 성패에 큰 영향을 미칠 것 같다. 추가 기술 또는 수정된 Cas9 단백질 포유류 세포³⁵선 천 homology 감독 수리의 정밀도 개선 하는 데 필요한 수 있습니다. 이러한 기술 중 일부는 다리, 염색체 끝을 함께 들고 NHEJ의 파괴적인 행동을 피하고로 보조 oligonucleotides의 사용을 포함. 정의 진 편집 활동 결과로 대상 사이트에서이 정도 이며 치료 적 개입을 위한 어떤 프로토콜의 중요 한 부분이 되어야 합니다.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
McCoy’s 5A Modified medium	ATCC	30-2007
Fetal Bovine Serum (FBS)	ATCC	30-2020
L-glutamine	ATCC	30-2214
Penicillin-Streptomycin Solution	ATCC	30-2300
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline	ATCC	30-2200	No Calcium or magnesium
Trypsin EDTA Solution	ATCC	30-2101
Aphidicolin 1mg	Thermo Fisher	AC611970010
Alt-R CRISPR crRNA, 10 nmol	IDT		No catalog number since its made to your specific gene target.
CRISPR-Cas9 tracrRNA, 20 nmol	IDT	1072533
S.p. Cas9 Nuclease 3NLS, 500 µg	IDT	1074182
IDTE Buffer	IDT	11-01-03-01
Zeus Electroporation Cuvettes 0.4 Cm	VWR	10497-474
Gene Pulser Xcell Electroporation Systems	BioRad	1652660
Bovine serum albumin lyophilized powder, crystallized, ≥98.0% (GE)	Sigma	05470-1G
EDTA (0.5 M), pH 8.0	ThermoFisher Scientific	AM9260G
Propidium Iodide - 1.0 mg/mL Solution in Water	ThermoFisher Scientific	P3566
DNeasy Blood & Tissue Kit (250)	Qiagen	69581
6-well Standard Line Multiwell Cell Culture Plates	VWR	10062-892
Petri Dishes	Fisher	12-565-90
Conical Tubes (15 mL) (racked)	Thermo Fisher	AM12500
Trypan Blue Solution, 0.4%	Thermo Fisher	15250061
Reduced Serum Medium	Thermo Fisher	31985062