Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה משמש ערכה עבור הגדרת מערכת תפקודית ט-על שורות תאים סרטן והשימוש עוקבות, בפרט ללמוד את התפקיד של גידול נגזר התא חלבונים בגיוס ומונוציטים/מקרופאגים כדי microenvironment הגידול.

Abstract

siRNA בתיווך shRNA דפיקה למטה (KD) שיטות של ויסות גנים כלי יקר ערך להבנת תפקוד גנים וחלבונים בקרב אנשי עסקים ותיירים כאחד. עם זאת, במקרה כי KD של החלבון עניין השפעה קטלנית על תאים או ההשפעה הצפויה של KD שיטות KD תלויי-זמן, אהבה ללא תנאים אינם מתאימים. מערכות מותנה יותר המתאימים במקרים אלה, היה הנושא של עניין רב. אלה כוללים מערכות ביטוי Ecdysone-inducible, ציטוכרום P-450 אינדוקציה מערכת1, ומוסדרת טטרציקלין מערכות ביטוי גנים.

טטרציקלין מוסדר ג'ין ביטוי המערכת מאפשרת שליטה הפיך על ביטוי חלבון באמצעות אינדוקציה של הביטוי shRNA בנוכחות טטרציקלין. פרוטוקול זה, אנו מציגים עיצוב ניסיוני באמצעות מערכת ט'-על תפקודי בשורות תאים סרטניים אנושיים עבור בקרת מותנה גנים. ואז נדגים את השימוש במערכת זו במחקר של גידול התא-מונוציט אינטראקציה.

Introduction

הגידול הקשורים מקרופאגים (תאמי) תורמים להתפתחות הגידול באמצעות קידום הגידול, גרורות, ויסות התגובה החיסונית2. סרטן תאי ומונוציטים דלקתיות מגויסת, אשר לחדור הגידול, להבדיל לתוך תאמי pro-tumorigenic3. חדירה של הגידול עם תאמי בקורלציה עם התוצאה הקלינית המסכן, נקשר את התפקיד לדיכוי המערכת החיסונית של מקרופאגים4,5. עם זאת, המנגנון של הגיוס של מקרופאגים לגידול לא נידונות טוב, הבנה טובה יותר של המסלולים המעורבים חיוני לקידום בהמשך השדה, טיפולים המבטיחים. אחד האתגרים ללמוד אינטראקציות בין תאים סרטניים ותאים רגילים ב microenvironment הגידול (טיים) הוא המורכבות של מנגנונים, מעורב, הדורשים גישות במבחנה המאפשרים ניתוח crosstalk תאים. כאן אנו מציגים מתודולוגיה צדדי שניתן להחיל כדי לחקור את ההשפעה paracrine של סרטן התא, נגזר, חלבון המופרש על הגירה של סוגי תאים אחרים כמו מקרופאגים, במבחנה. באמצעות מערכת איפה הביטוי של shRNA נגד סרטן התא-derived חלבון מעורב בגיוס ומונוציטים תחת השליטה של האמרגן inducible טטרציקלין, הוא quantitated את ההשפעה paracrine של החלבון המופרש על ומונוציטים. ב פרוטוקול זה, שכפול הרצפים shRNA לתוך טטרציקלין וקטור מוסדר מוצג ואחריו לדור של שורות תאים סרטן יציב. עוד, הטיהור ומונוציטים אנושי ראשוני ואת וזמינותו הקאמרית של בוידן משמשים כדי לנתח את ההשפעה paracrine של חלבון תאי סרטן נגזר על העברה של ומונוציטים.

Downregulation של חלבון קידוד גנים מוחל בדרך כלל עם siRNA וטכניקות shRNA, אבל לא בלי מגבלות בשימוש בו. לטווח ארוך הדפיקה למטה (KD) של גנים עשויים להפיק תגובות מסתגלת משני תאים להפריע תוצאות ניסויית. חוסר שליטה טמפורלית על ביטוי גנים מקל מאתגר ללמוד את התפקיד דינמי של חלבון לאורך זמן או את התפקיד של חלבון חשובה לקיום התא. בעיה זו חשובה במיוחד ויוו הגדרות, איפה התפקיד של חלבון התפתחות גידולים והתקדמות עשויים לדרוש את downregulation של הביטוי של החלבון עניין רק לאחר הגידול הוא הוקם. KD מותנה יש את היתרון של מניעת מוקדם מדי קטלני תופעת KD על תאים, וכדי לאפשר ניתוח של תפקידו של החלבון בתוך בשלבים שונים של הגידול, בעוד KD ללא תנאים עלולה לגרום חוסר התפתחות גידולים.

מספר מערכות KD מותנה פותחו כדי לטפל המגבלות של KD יציב. מערכות ביטוי של גנים מותנה כוללים Ecdysone-inducible ביטוי מערכות, ציטוכרום P-450 אינדוקציה מערכת1, ו טטרציקלין מוסדר מערכות ביטוי גנים. מערכות ביטוי של גנים מוסדר טטרציקלין מאפשרים שליטה על הבעת shRNA על תוספת של אנטיביוטיקה טטרציקלין (או שלה אנלוגי יותר יציב - דוקסיציקלין). ב ט-על מערכות, הביטוי של shRNA מושרה בנוכחות טטרציקלין/דוקסיציקלין והתוצאה היא ביטוי גנים KD, ואילו במערכות ט-OFF, הביטוי של shRNA מדוכא בנוכחות טטרציקלין והתוצאה היא ביטוי גנים. החיסרון של מערכת inducible-טטרציקלין הוא שדווחה בעבר רמות נמוכות של ביטוי shRNA בהיעדרו של דוקסיציקלין - כביכול leakiness6,7. ט-מופעל המערכת המתוארות כאן, על הממשל של טטרציקלין, הכריכה של טטרציקלין צורונים ביטוי (טטריס למצוא) בחלבון רצף רכיב (TRE) ט מגיב בתוך H1 הוא אזור יזם shRNA עניין לדכא. התוצאה היא ביטוי של shRNA וניגוד של תרגום של החלבון עניין ב-8,באופן תלוי-טטרציקלין9.

מערכות אחרות-טט-על זמינות לכלול בו זמנית טוק-של TetO רצף בין תיבת טטה רצף proximal רכיב (פסי) ובין תיבת טטה שעתוק להתחיל פותח ע י צ'אן ואח. 10 מערכת זו דורשת פחות רעיל במינונים של טטרציקלין להסדיר ביטוי shRNA, עם זאת, תחת מצב שאינו-induced, רמות נמוכות של shRNA באים לידי ביטוי. Krüppel-הקשורים box (קראב) המבוסס על ט'-על מערכת11 כולל קראב, חלבון אצבע אבץ, אשר נושאים גנים הממוקמים בתוך טווח 3 kb של אתר האיגוד קראב כדי דיכוי גנים ברמת השעתוק. TTRKRAB chimeric חלבון יכול להיקשר TetO, עקב מגוון רחב של יכולת לשליטה דנ א, TetO לא צריך להיות מוגבל בין שעתוק באתר, יזם את ומתחילים יש השפעה נמוכה על הפעילות של האמרגן. תחת המדינה הלא-induced, מערכת לשליטה זו התערבות RNA דווח כדי להציג רמה נמוכה יותר של ביטוי דלף shRNA11,12; עם זאת, זה דורש גישה שיבוט רציפים, שני-וקטור. בהשוואה בעבר מפותחות מערכות KD מותנה כגון Ecdysone-inducible ביטוי המערכת או P-450 ציטוכרום אינדוקציה המערכת, המערכת מוסדר טטרציקלין יש את היתרון של הפיכות בחוסנו, ולכן ביותר בשימוש שגרתי מערכת13. המערכת בשימוש פרוטוקול זה יש יתרון כפול TetO טוק-אין מערכת ומערכת קראב ט-על כמו זה דורש וקטור ישר קדימה, יחיד שיבוט, ומאפשר דור מהירה של שיבוטים מרובים, זה מוצגים רמות נמוכות מאוד של leakiness, היעדרות של דוקסיציקלין.

טיים היא קריטית להתפתחות של סרטן. כדי להקל על הגידול, תאים סרטניים לגייס ומונוציטים דלקתיות על ידי הפרשת חלבונים chemotactic. ומונוציטים מגויס לחדור את הגידול, להבדיל לתוך תאמי pro-tumorigenic שתורמים הגידול של גרורות. מחקרים במבחנה של גיוס תא החיסון לנצל את מבחני ההעברה, עם בוידן assay קאמרית להיות נרחב בשימוש14,15,16,17. ב הזה assay, מקור חלבון chemoattractant, לדוגמה, תאים סרטניים, או חלבון מטוהרים, ממוקם בתחתית המצודה. תאים חיסוניים ממוקמים בחדר העליון מופרדות על-ידי נקבובי ממברנה מ והתא התחתון. תאים נודדות לכיוון מעבר הצבע הגוברת של chemoattractant, ואלה שנמצאו בצד התחתון של הקרום צבעונית, ספרתי מתחת למיקרוסקופ. כאן אנחנו לבדוק את תפקוד chemoattractant Plasminogen Activator מעכב 1 (פאי-1) על ומונוציטים על ידי יצירת שורות תאים סרטן יציב, inducible שבו הביטוי של פאי-1 מוסדר על ידי תוספת דוקסיציקלין. אנו משתמשים ומונוציטים ראשי האדם בוידן קאמרית ההעברה וזמינותו כדי להעריך את התפקיד של פאי-1 בהעברה מונוציט. ההבדלים בין האנושי ומונוציטים ראשי שורות תאים monocytic בשימוש נרחב כמו THP1 דווחו וכוללים דפוסי ביטוי ציטוקינים שונים18; לדוגמה, לעומת 5-10 קיפול עלייה TNF-α רמות הביטוי על ידי תאים THP1 ומונוציטים האנושי19. תאים THP1 נגזרים מתוך תאי סרטן אנושיים monocytic, כדי לשמור על, להתרבות עם ממוצע מכפיל את עצמו בתקופה של 19-50 גובה20. להפך, ומונוציטים האנושי מאופיינים על ידי אורך חיים קצר, בהעדר גורמי גדילה. מאז ומונוציטים וגופם מטוהר מהדם של תורמים, כמות נכבדה של השתנות מתרחשת בין האנשים, בהתאם לשיטת טיהור, זיהום, עם סוגי תאים אחרים עלולה להתרחש. למרות זאת, ומונוציטים ראשיות הרלוונטיות, זה מומלץ להשתמש או לאשר את התוצאות שהושגו עם הקווים תא monocytic באמצעות ומונוציטים הראשית in המחקר הביולוגי19. כאן נתאר פרוטוקול לטיהור של האדם העיקרי ומונוציטים מדם היקפי. שיטות אלטרנטיביות מונוציט טיהור כוללות צפיפות הדרגתי והצמדות פרוטוקולים צעד שני ההליך עם מעברי צבע יחיד של Ficoll-Hypaque ואחריו הדרגתיות Percoll21. הטוהר של האוכלוסייה מונוציט מתקבל על ידי טווחים אלה שיטות בין 70-90%. השיטה המתוארת כאן משתמש הדרגתי צפיפות ואחריו בחירת מערכת החיסון שלילית22 , ומאפשרת הטיהור של monocytes האנושית ללא קשר ישיר עם נוגדנים, ובכך הימנעות שלהם הפעלה בשוגג, וכתוצאה מכך > 95% טהור אוכלוסיית ומונוציטים.

פרוטוקול המובאת כאן משמש להגדרת מערכת ט-אן פונקציונלי של ביטוי גנים KD בשורות תאים סרטניים אנושיים כדי לחקור את האפקט chemoattractant של סרטן, נגזר על ידי החלבון פאי-1 על ומונוציטים. פאי-1 הוא overexpressed על ידי מגוון רחב של גידולים, הביטוי שלה באופן פרדוקסאלי בקורלציה עם התוצאה הקלינית המסכן23,24. תפקיד פרו-tumorigenic פאי-1 הוא תוצאה של pro-אנגיוגנזה שלה ופונקציות אנטי-מוות25,26. פאי-1 הוכח לתרום דלקת על ידי קידום הגיוס של מקרופאגים לאתר של דלקת27. פאי-1 הוצגה כדי לקדם את שריר חלק cellmigration28,29 ו להשתתף ההעברה מקרופאג התלויים30מק-1. פאי-1 ביטוי הוכח גם לשפר במידה ניכרת את הגיוס של Raw 264.7 מקרופאגים לתוך גידולים מלנומה B16F1031. עם זאת, תפקידו של פאי-1 ב- TAM ההעברה לא נחקר בפירוט. אנו משתמשים בפרוטוקול המתואר כדי לענות על השאלה של פאי-1 מושך ומונוציטים תאים סרטניים. מתודולוגיה זו מאפשרת ניתוח crosstalk בין הגידול טיים על ידי החלבון המופרש של תאים סרטניים ואף ניתוח המרכיבים של טיים.

Protocol

המקטע פרוטוקול העושה שימוש אנושי ומונוציטים המתקבל מתנדבים בריאים עוקב אחר הקווים המנחים של הילדים החולים בלוס אנג'לס האנושי מחקר בועדת האתיקה, אושרה על ידי ועדת הבדיקה מוסדיים תחת החומר האנושי פרוטוקול מספר: CCI 08-00208.

1. הכנת שורות תאים סרטן עם shRNA מוסדר טטרציקלין ביטוי

  1. שיבוט של shRNA פאי-1 לתוך ט-pLKO-פורו וקטור 8 , 9
    1. עיצוב oligomers shRNA המכילים גילואני לסביבהRI המחשוף באתר-בקצה 5', את רצף הגיוני, לולאה נוקלאוטיד 6, ואודות הרצף antisense.
      הערה: oligonucleotides טיפוסית מתוכננים כדלהלן: oligo קדימה: 5' CCGG - bp 19-21 לחוש - CTCGAG - 19-21 bp antisense - TTTTT, oligo הפוכה: 5' AATTAAAAA-19-21 bp לחוש - CTCGAG - 19-21 bp antisense 3'. פרוטוקול מפורט על העיצוב אוליגומר ניתן למצוא ב- 8. במחקר זה נבדקו 3 shRNA רצפים נגד פאי-1 עבור האפקט שתיקה החזק ביותר: shRNA 132, shRNA 2, shRNA 333ו מקושקשות33 כלולים בטבלה 1.
    2. Anneal את oligomers shRNA ונעמד shRNA oligomers.
      1. לשקם oligonucleotides 100 מיקרומטר במים ומערבבים oligonucleotide לפנים µL 1 µL 1 oligonucleotide הפוכה, 8 µL H2O.
      2. כדי anneal את oligonucleotides, מערבבים את הדברים הבאים: תערובת oligonucleotide µL 1, 5 µL מאגר 10 מ מ טריס (hydroxymethyl) aminomethane (טריס) pH 7.5, 50 מ מ נתרן כלורי (NaCl), 10 מ מ מגנזיום כלוריד (MgCl2), 1 מ dithioerythritol (DTE), 44 µL H 2 אואן
      3. דגירה התערובת ב תגובת שרשרת (PCR) פולימראז הצנטרפוגה תרמי ב 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, לכבות את המכשיר ולהמתין עד לטמפרטורת החדר (RT).
    3. Precipitate annealed oligonucleotides על-ידי הוספת 3 מ' 5 µL סודיום אצטט µL pH 5.2 עד 50 annealed oligonucleotides.
      1. להוסיף 100 µL קר 100% אתנול (EtOH), תקופת דגירה של 30 דקות ב- 80 ° c צנטריפוגה ומפרידה benchtop במהירות המרבית במשך 30 דקות ב 4 º C.
      2. להסיר את תגובת שיקוע, להוסיף 500 µL קר 70% EtOH, צנטריפוגה למשך 30 דקות, הסר את תגובת שיקוע ולאחר להמיס צניפה 20 µL H2O.
      3. להעריך את ריכוז annealed oligonucleotides מאת ספקטרופוטומטר, מודדים את ספיגת-260 ננומטר. Oligonucleotides שתדללו את הריכוז הסופי של 1 ng/µL.
    4. להכין בינוני לוריא Bertani (LB) פלטות אגר ליברות.
      1. LB בינוני, התמוססות טריפטון 10 גרם, 5 g שמרים לחלץ, 10 גרם NaCl ב- 1 ליטר של מים. להתאים את ה-pH של המדיום כדי pH 7.0 באמצעות 1 N NaOH, החיטוי.
      2. עבור לוחות אגר ליברות, להוסיף 15 גרם/ליטר של אגר LB בינוני. אוטוקלב וקריר עד כ 50 מעלות צלזיוס. להוסיף אנטיביוטיקה ויוצקים את הצלחות.
    5. פסים חיידקים transduced עם וקטור ט-pLKO-פורו (ראה את הטבלה של חומרים) על LB צלחת אגר בתוספת 100 אמפיצילין µg/mL, דגירה בין לילה (O/N) ב 37 º C.
    6. לחסן בינוני LB 100 מ ל בתוספת אמפיצילין µg/mL 100 (LB/אמפיצילין) עם המושבה 1 מהצלחת ולגדול O/N ברעידות ב 37 º C.
    7. IsolateTet-pLKO-פורו מתרבות חיידקי 100 מ ל באמצעות ערכת בידוד פלסמיד.
    8. הכנת התגובה הגבלה עבור וקטור ט-pLKO-פורו עם אנזימי הגבלה EcoRI, AgeI כדלקמן: 1 µL EcoRI, 1 µL AgeI, מאגר 10 x 5 µL, ה-DNA פלסמיד µL 1 (1 µg), µL H 422O. דגירה 1 h ב- 37 מעלות צלזיוס. כדי לקבל מספיק של וקטור cleaved, להכין עד 5 x 50 µL תגובות.
    9. השתמש agarose.1% ג'ל לטיהור cleaved וקטור של הג'ל agarose באמצעות ערכת טיהור DNA. כדי להגדיל את התשואה של ה-DNA, למזער את agarose DNA יחס הג'ל באמצעות מסרק ג'ל agarose של בארות גדול, על-ידי הסרת בזהירות מרבית agarose הלהקה באמצעות אזמל.
    10. מכינים את תערובת התגובה מצדו כדלקמן: 1 ng annealed oligonucleotides, 50 ng cleaved וקטור, 2 µL 10 x ליגאז מאגר, ליגאז 1 µL ומים עד µL 20. מאתרים ומפסיקים את הווקטור עם annealed shRNA oligonucleotides בגיל 16 ° C O/ש
      1. להכין בנוסף, תגובת שליטה שלילי ללא oligonucleotides עבור וקטור uncleaved cleaved חלקית, מחוברים עצמית זה יביא במושבות חיובי כוזב.
    11. באמצעות טכניקות שינוי רגיל, להפוך את תערובות מצדו כשיר מבחינה כימית תאים חיידקיים שנועדו למנוע רקומבינציה הומולוגית של וקטורים lentiviral המכיל חזרה ישירה.
    12. לגדול חיידקים על צלחות עם אמפיצילין O/N ב- 37 מעלות צלזיוס.
      הערה: אם מתרחשת צמיחה של המושבות בלוויין, חזור על הטרנספורמציה ולגדול על חיידקים ב 30 ° C כדי להאט את הצמיחה, ובכך למנוע בלוויין מושבות.
    13. כדי לוודא מצדו מוצלחת, לבחור בין 10-20 מושבות יחיד, לחסן תרבויות ליברות/אמפיצילין 2 מ"ל, צלחת אמפיצילין כמו צלחת מניות (כדי לשמש כפיל חיובי מאוחר יותר). לגדול תרבויות נוזלי ברעידות O/N ב- 37 מעלות צלזיוס. דגירה הלוח O/N ב- 37 מעלות צלזיוס.
    14. לאטום את הצלחת עם מצלמות-מיקרוסקופים וחנות ב 6 º C.
    15. לבודד דנ א פלסמיד מתרבויות נוזלי באמצעות ערכת בידוד פלסמיד.
    16. לבצע ניתוח ההגבלה של דנ א פלסמיד מבודד מן המושבות עמידים אמפיצילין באמצעות האנזים XhoI. עבור כל שיבוט, להכין את תערובת התגובה הבאה: 0.5 µL XhoI, µL 2.5 10 x מאגר, ה-DNA פלסמיד µL 1 (0.5 µg), ו- 21 µL H2O. Incubate עבור h 1-37 מעלות צלזיוס. לנתח את התוצאה של התגובה הגבלה על-ידי הפעלת את התגובה על ג'ל agarose 1%.
      הערה: הגבלת ניתוח של וקטור WT ביקע מאת XhoI יפיק שברי 3: 8,447, 1,800 ו 200 bp. הרצף סטופר ב ט-pLKO-פורו וקטור של 1,800 bp אינה נמצאת חיובית שיבוטים המכיל shRNA-פאי-1 והתוצאה לעכל XhoI את שברי DNA של הגודל: 8,447, 190 ו- 130 bp. כפי שמוצג באיור1, השבר bp 2000 לא נמצא ב- DNA מבודד ממספר מושבות אמפיצילין עמיד: 3, 8 ו- 11. בהתאם לעיצוב של oligonucleotides, האורך והמספר של קטעים שהושג ב- DNA של מושבות חיובי עשוי להשתנות.
    17. לאמת את. הכנסה של הרצף shRNA לתוך הווקטור ט-pLKO-פורו על ידי רצף8,9.
    18. לחסן 100 מ ל LB/אמפיצילין תרבות עם המושבה המכילה השיבוט הנכון ולגדול O/N ב- 37 מעלות צלזיוס.
    19. לבודד דנ א פלסמיד באמצעות ערכת בידוד פלסמיד.
  2. דור של חלקיקים lentivirus.
    1. מעיל תבשיל תרביות רקמה 15 ס מ עם פולי-L-ליזין על ידי כיסוי השטח של המנה עם פתרון סטרילי מים של 0.01% פולי-L-ליזין ו המקננת ב RT במשך 15 דקות להסיר את הפתרון על ידי השאיפה, מילה נהדרת את הכלים.
    2. זרע 5 x 106 293 כליות עובריים אנושיים תאים תאים (HEK293) המנה פולי-L-ליזין-מצופה 15 ס מ, תרבות בינוני בינוני (DMEM) ששינה הנשר של Dulbecco בתוספת 10% FBS ו 1% פניצילין/סטרפטומיצין מיקס (עט/דלקת) ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2 עד שיגיעו 70% confluency.
    3. כדי לייצר חלקיקים נגיפיים, transfect תאים HEK293 עם 25 µg pLKO-ט-ב-shRNA, 25 psPAX µg, (אריזה פלסמיד), ו 5 µg pMD2.G פלסמידים (מעטפה לביטוי פלסמיד) באמצעות ריאגנט תרביות תאים.
      הערה: psPAX ו- pMD2.G פלסמידים הן מתנה מן המעבדה דידייר Trono (אקול פוליטכניק Federale דה לוזאן, שווייץ).
    4. לגרום HEK293 תאים למחרת על ידי שינוי של המדיום כדי DMEM בתוספת 10 מ מ נתרן butyrate ו- 20 מ מ HEPES pH 7.2 ולאחר culturing במשך 8 שעות.
    5. לשטוף את התאים בתמיסת באגירה פוספט (PBS) ולהוסיף 25 מ של טרי DMEM בינוני המכיל 20 מ מ 4 חומצה-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES) pH 7.2. לאחר דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 48 שעות, בזהירות לאסוף בינוני המכיל וירוס על ידי pipetting; הימנע נשפך.
    6. לסנן את המדיום שנאספו דרך פילטר מזרק מיקרומטר 0.45 כדי להסיר תאים HEK293. המדיום המכיל נגיפים יכולים להיות שימוש באופן מיידי או המאוחסנים ב- 80 ° C לשימוש מאוחר יותר.
  3. דור של שורות תאים stably transfected
    1. זרע תאי סרטן המעי הגס HCT116, תאים סרטניים בשד מד א-MB-231-50,000 תאים/היטב במדיום DMEM בתוספת 10% סרום שור עוברית (FBS) ו 1% עט/סטרפ בצלחת 12-. טוב. דגירה ב 37 ° C-5% CO2 עד שהתאים confluent 60-70%.
    2. לשטוף תאים עם PBS ולהוסיף 1 מ"ל של וירוס המכילות בינוני סרטן תאים, דגירה O/N ב 37 ° C-5% CO2. כפקד, להוסיף 1 מ"ל של מדיום DMEM טריים, בתוספת 10% FBS ו 1% עט/סטרפ כדי בארות 2 עם תאים סרטניים.
    3. הסר בזהירות את המדיום המכיל וירוס על ידי השאיפה. לשטוף את התאים עם PBS ושנה את המדיום DMEM עם 10% (v/v) ללא טטרציקלין FBS (חינם ט) ו- 1% עט/סטרפ.
    4. לאחר 72 h, לשטוף תאים עם PBS ושנה את המדיום DMEM 10% FBS נטולת ט 1% עט/דלקת, puromycin 1 µg/mL עבור בחירת התאים transfected-וירוס.
      1. בהתאם לקו תא בשימוש, להתאים את הריכוז puromycin עבור בחירה אופטימלית על ידי בדיקת טווח ריכוז puromycin (0.1 0.5, 1, 2, 5 µg/mL) בתאים שאינם transduced ובחירה הריכוז הנמוך ביותר שבו אין תאים שליטה לשרוד אחרי 3 ימים של תרבות.
    5. בחר תאים transduced-וירוס על ידי culturing תאים בנוכחות puromycin 3-14 ימים. כפקדי, להכין שתי בארות נוספות עם תאים שאינם transduced, אחת בינונית המכיל puromycin ואחד ללא puromycin. להתבונן חלקית הריגת התאים על ידי puromycin בתוך הבאר עם תאים transduced-וירוס לעומת שליטה בארות.
      הערה: תאים שאינם transduced לא יגדל בנוכחות puromycin.
    6. ודא את היעילות של KD מותנה puromycin עמידים סרטן המעי הגס HCT116, תאים סרטניים בשד מד א-MB-231.
      הערה: ריכוז דוקסיציקלין יעיל תשתנה בהתאם לקו תא בשימוש, עליך להיות טיטרציה (בדרך כלל מ- 100 ננוגרם למ"ל ל 2 µg/mL).
      1. לקבוע את הריכוז דוקסיציקלין שאינו רעיל לתאים אך יעיל downregulating הביטוי של החלבון עניין. פרוטוקול זה, היה µg 1/mL בהצלחה בשימוש במבחנה.
      2. התרבות התאים עבור 72 h נוכחות, היעדר דוקסיציקלין µg/mL 0.1, 1 ו- 2. בדוק את רמת הביטוי של החלבון downregulated (כאן, פאי-1) בתא lysate על-ידי המערב כתם ניתוח. השוואה בין תאים HCT116 ומד א-MB-231 מותנה הבעת shRNA לתאי בקרה מקושקשות.
  4. הכנת בינוני ממוזגים
    1. זרע עונה 1 פרק 106 תאים stably transfected עם דוקסיציקלין מוסדר lentiviruses המכיל pLKO-shRNA במנות 10 ס מ.
    2. לגדול שורות תאים במדיום המכון ממוריאל פארק רוזוול (RPMI) עם 10% FBS נטולת ט ו 1% עט/סטרפ היעדרות, נוכחות של דוקסיציקלין 1 µg/mL 72 h ב 37 ° C-5% CO2, הוספת דוקסיציקלין טריים מדי יום.
      הערה: RPMI בינוני הוא תואם עם תרבות תנאי ומונוציטים. דוקסיציקלין הוא תרכובת רגיש אור. להגן על התרבויות תא האור על ידי כיסוי ברדיד אלומיניום ולהימנע עבודה תחת לחץ ישיר לאור החשיפה.
    3. לאסוף את המדיום על ידי pipetting, לסנן דרך מסנן מיקרומטר 0.45, להקפיא ב-80 מעלות צלזיוס ב- aliquots.

2. בידוד של Monocytes של דם אנושי

  1. לבודד ומונוציטים מדם היקפי אנושי.
    הערה: ומונוציטים ראשי האדם מבודדים מ- 7 מ של כדוריות הדם הלבנות מרוכז במסנן ליקוציט שהתקבלו מתורמים בריאים טסיות. בהתאם התורם, מסנן ליקוציט אחד מייצר בין עונה 1 פרק 109 2 x 109 תאי תאי דם היקפיים (PBMCs), כ-10% מהם מהווים ומונוציטים.
    1. להכין את תחנת העבודה בזרם שכבתית בארון.
    2. לעקר את המספריים והזרימה שכבתית ארון עם אור אולטרה סגול (UV) למשך 30 דקות.
    3. לרסס את המסנן ליקוציט עם 70% EtOH ו- air-dry הפנימי זרימה שכבתית בארון.
    4. חותכים בשני הקצוות של המסנן ליקוציט במספריים ולרוקן את התוכן של המסנן לתוך צינור 50 מ.
    5. לדלל 90 מ על-ידי הוספת PBS המכיל 1% (v/v) FBS (PBS/FBS).
    6. להכין 3 x 50 מ"ל צינורות עם פתרון הדרגתי של צפיפות 15 מ"ל. שכבת לאט 30 מ של דם PBS/FBS מדולל על צפיפות פתרון מעבר צבע באמצעות בקר פיפטה שוכן על זרימת הכבידה כדי למנוע ערבוב של השכבות.
    7. צנטריפוגה ברוטור הנדנדה ב g 400 x-RT בלי בלמים במשך 25 דקות.
    8. . היפטר השכבה העליונה ולהעביר השכבה האמצעית המכיל PBMCs לרכבת התחתית מ"ל.
    9. הוסף ש-PBS/FBS עד 50 מ"ל, צנטריפוגה ב 120 x g ב- RT במשך 10 דקות להסיר את תגובת שיקוע המכיל טסיות. חזור על שלב זה פעמיים נוספות.
    10. Resuspend בגדר ב 50 מ של PBS/FBS ולספור את PBMCs באמצעות hemocytometer. צנטריפוגה-120 g x-RT, resuspend בגדר ב- PBS/FBS המכיל חומצה ethylenediaminetetraacetic 1 מ מ (EDTA) (PBS FBS EDTA) כדי ריכוז הסופי של 5 x 107 תאים/מ ל....
    11. להשתמש ערכת מבחר שלילי להעשיר ומונוציטים על ידי דלדול של תאים שאינם monocytic.
      הערה: הערכה שלילית הבחירה משתמשת קוקטייל של נוגדנים (CD2 CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123, glycophorin A) T תאי NK תאים, נויטרופילים, B תאים, גרנולוציטים, אריתרוציטים. מתחמי נוגדן לאגד את פני השטח של תאים אלה שאינם monocytic, החלקיקים המגנטיים לתוספי. כאשר הצינור נמצא במחלקה מגנט, החרוזים לדבוק דפנות הצינור ולהסיר את התאים הלא-monocytic מן הפתרון.
      1. הוסף 50 µL הנוגדן קוקטייל 1 מ"ל של 5 x 107 PBMCs/mL, מערבבים עם פיפטה, ו תקופת דגירה של 10 דקות-RT. להוסיף 50 µL beads מגנטי PBMCs עם הנוגדן קוקטייל, לערבב עם פיפטה ולאחר תקופת דגירה של עוד 10 דקות-RT.
      2. להוסיף PBS/FBS/EDTA 25 מ ל והמקום התערובת PBMC ב מגנט שיכול להכיל שפופרת 50 מ. תקופת דגירה של 10 דקות-מגנטי RT. חרוזים לדבוק דפנות הצינור, sequester את התאים הלא-monocytic של הפתרון.
    12. באמצעות פיפטה 25 מ ל, להסיר הפתרון המכיל ומונוציטים מהצינור בהמגנט. יש להיזהר לא לגעת בדפנות הצינור עם פיפטה.
    13. Centrifuge הפתרון ב 250 g x-RT, להסיר את תגובת שיקוע, resuspend את גלולה המכילה ומונוציטים בינוני RPMI המכיל 10% FBS נטולת ט ו 1% עט/סטרפ.

3. בוידן קאמרית ההעברה Assay

  1. להכין 1% (w/v) אלבומין שור (BSA) פתרון על ידי המסת 1g של BSA ב- 100 מ של מים הנדסה גנטית, לסנן דרך הנקבובית 0.2 µm גודל לחטא.
  2. דגירה את הכיסויים נקבובי ממברנה ב 1% BSA פתרון סטרילי O/N עבור שיפור הדבקות של מקרופאגים הקרום. לשימוש ומונוציטים/מקרופאגים, 5-8 מיקרומטר נקבובית גודל מוסיף.
    1. למלא צלחת תרביות רקמה סטרילי עם 1% פתרון BSA ולמקם את הכיסויים בצלחת. החל µL 200 1% פתרון BSA בתוך השרוול.
  3. לשטוף את הכיסויים פעמיים על-ידי הצבתם תבשיל מלא PBS סטרילי, PBS החלה בתוך המסנן.
  4. זרע תאים HCT116 או מד א-MB-231 40,000 0.5 mL RPMI בינוני המכיל 10% FBS נטולת ט ו 1% עט/סטרפ לכל טוב, לתוך צלחת 24-. ובכן, כן. לחלופין, במקום 0.5 מיליליטר בינוני ממוזגים שנוצר קודם לכן בבאר כמקור של chemoattractant.
  5. ביום הבא, ומונוציטים צלחת 8,000 ב- מוכנה להוסיף נפח 0.3 mL של המדיום RPMI המכיל 10% FBS נטולת ט ו 1% עט/דלקת, שהפקידים, דגירה ב 37 ° C-5% CO2.
  6. לאסוף את התוספות לאחר 48 שעות.
    הערה: האורך של ניסוי חייב להיות מוטבת בהתאם לתנאים הספציפיים תאים נעשה שימוש, על ידי ביצוע ניסוי זמן-קורס שבו מוסיף נאספים בזמנים שונים הדגירה.
    1. לנער את המדיום עודף, בדיוק לפלח השטח הפנימי עם המוליך שקצהו כותנה כדי להסיר תאים לא להעביר.
    2. כתם הצד החיצוני של התוספות בשיטת Giemsa רייט.
    3. בזהירות הר 3 שקופיות מוסיף/זכוכית בשמן צמיגות גבוהה מיקרוסקופ טבילה, מוודא כי הצד של המסנן עם מקרופאגים שהועברו פונה.
  7. תמונה השקופיות באמצעות מיקרוסקופ אור במטרה X 20. תצלמי תמונות של שדות 9/מסנן. לספור מקרופאגים שהועברו במסנן/9 שדות.

תוצאות

שלושה רצפים shRNA נבדקו עבור היעילה KD של פאי-1. בשביל זה, shRNA רצפים נגד פאי-1 ומקושקשת (טבלה 1) היו משובטים לתוך ט-pLKO-פורו ביטוי וקטור בעקבות הפרוטוקול המתואר לעיל. הקו תא fibrosarcoma HT-1080 היה stably transfected עם בונה שנוצר, התאים שטופלו דוקסילין למשך 3 ימים. הביטוי של פאי-1 אומתה על י...

Discussion

מורכבת של מגוון רחב של סוגי תאים, טיים חיוני להתפתחות של סרטן. לבירור תנאי הגידול האופטימלית, תאים סרטניים מושכים ומונוציטים באמצעות הפרשת גורמים chemotactic. כאן אנו מציגים פרוטוקול ללמוד את המנגנון של גיוס מונוציט מאת גידול תאים במבחנה. למטרה זו, נעשה שימוש בשילוב של ג'ין inducible ביטוי במער?...

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgements

המחברים רוצה להכיר ז'קלין רוזנברג להגהת כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי לנו מחלקת הבריאות ושירותי האנוש של/לאומי מכוני הבריאות בעזרת מענק לך DeClerck (להעניק 5R01 CA 129377) ושל קרן מרטל. טי-ג'יי. MH Kubala היא זוכת פרס מחקר לאגודה לפיתוח הקריירה של מכון המחקר סבן-החולים בלוס אנג'לס לילדים.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Tet-pLKO-puro lentiviral vectorAddgene21915
FBS (Tetracycline-free)Omega ScientificFB-15
HistopaqueSigma10771-500ML
EasySep Human Monocyte Enrichment KitStemCell19059
EasySep MagnetStemCell18002
EcoRI HFNEBR3101S
AgeI HFNEBR3552S
Cut Smart bufferNEBB7200S
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362
PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup SystemPROMEGAA9281
psPAX vectorAddgene12260
pMD2.G vectorAddgene12259
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coliThermo Fisher ScientificC737303
Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stainProtocol123-869
HEK293 cellsATCCCRL-1573
PBSCorning21-031-CV
XhoI restriction enzymeNEBR0146S
LigaseNEBM0202S
Ligase bufferNEBM0202S
EDTA 0.5 M solutionThermo Fisher ScientificR1021
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
The Big Easy" EasySep MagnetStem Cell18001
0.1% Poly-L-Lysine solutionSigma-AldrichP8920
Sodium AcetateSigma-AldrichS7670
Sodium butyrateSigma-AldrichB5887
0.45 μM syringe filtersVWR International28145-479
NaOHSigma-AldrichS5881-500g
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)Invitrogen15504-020
Sodium Chloride(NaCl)Sigma-AldrichS7653-5 kg
Magnesium Chloride (MgCl2)Sigma-AldrichM8266-100g
dithioerythritol (DTE)Sigma-AldrichB8255-5g
ethanol (EtOH)Sigma-Aldrich792780
tryptoneAmrescoJ859-500g
yeast extractFluka70161-500g
Bacto agarBD214010
ampicillinSigma-AldrichA9393-5g
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Corning10-013-CV
phosphate-buffered saline (PBS)Corning21-031-CV
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Sigma-AldrichH3375
puromycinSigma-AldrichP9620
Doxycycline hyclateSigma-AldrichD9891-25g
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)Corning10-040-CV
0.5 M EDTA pH 8.0Thermo Fisher ScientificR1021
Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET MembraneBecton Dickinson353097
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA7906
Cotton-Tipped Applicator MedlineMDS202000
Protocol Hema 3 STAT pack Fisher Scientific Company123-869
Resolve Immersion Oil, High ViscosityRichard Allan ScientificM4004
Penicillin StreptomycinGibco15140122

References

  1. Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. Conditional transgenic technologies. J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).
  2. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
  3. Franklin, R. A., et al. The cellular and molecular origin of tumor-associated macrophages. Science. 344 (6186), 921-925 (2014).
  4. Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27 (4), 462-472 (2015).
  5. Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
  6. Mizuguchi, H., Hayakawa, T. Characteristics of adenovirus-mediated tetracycline-controllable expression system. Biochim Biophys Acta. 1568 (1), 21-29 (2001).
  7. Meyer-Ficca, M. L., et al. Comparative analysis of inducible expression systems in transient transfection studies. Anal Biochem. 334 (1), 9-19 (2004).
  8. Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
  9. Wee, S., et al. PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (35), 13057-13062 (2008).
  10. Chen, Y., Stamatoyannopoulos, G., Song, C. Z. Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro. Cancer Res. 63 (16), 4801-4804 (2003).
  11. Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. J Virol. 77 (16), 8957-8961 (2003).
  12. Solari, V., et al. MYCN-dependent expression of sulfatase-2 regulates neuroblastoma cell survival. Cancer Res. 74 (21), 5999-6009 (2014).
  13. Liao, Y., Tang, L. Inducible RNAi system and its application in novel therapeutics. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 630-638 (2016).
  14. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
  15. Jungi, T. W. Assay of chemotaxis by a reversible Boyden chamber eliminating cell detachment. Int Arch Allergy Appl Immunol. 48 (3), 341-352 (1975).
  16. Jung, H. S., et al. Monoclonal antibodies against autocrine motility factor suppress gastric cancer. Oncol Lett. 13 (6), 4925-4932 (2017).
  17. Park, H., et al. Effect of Sorbus commixta on the invasion and migration of human hepatocellular carcinoma Hep3B cells. Int J Mol Med. , (2017).
  18. Schildberger, A., Rossmanith, E., Eichhorn, T., Strassl, K., Weber, V. Monocytes, peripheral blood mononuclear cells, and THP-1 cells exhibit different cytokine expression patterns following stimulation with lipopolysaccharide. Mediators Inflamm. 2013, 697972 (2013).
  19. Heil, T. L., Volkmann, K. R., Wataha, J. C., Lockwood, P. E. Human peripheral blood monocytes versus THP-1 monocytes for in vitro biocompatibility testing of dental material components. J Oral Rehabil. 29 (5), 401-407 (2002).
  20. Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  21. de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
  22. Flo, R. W., et al. Negative selection of human monocytes using magnetic particles covered by anti-lymphocyte antibodies. J Immunol Methods. 137 (1), 89-94 (1991).
  23. Grondahl-Hansen, J., et al. Plasminogen activator inhibitor type 1 in cytosolic tumor extracts predicts prognosis in low-risk breast cancer patients. Clin Cancer Res. 3 (2), 233-239 (1997).
  24. Borgfeldt, C., Hansson, S. R., Gustavsson, B., Masback, A., Casslen, B. Dedifferentiation of serous ovarian cancer from cystic to solid tumors is associated with increased expression of mRNA for urokinase plasminogen activator (uPA), its receptor (uPAR) and its inhibitor (PAI-1). Int J Cancer. 92 (4), 497-502 (2001).
  25. Devy, L., et al. The pro- or antiangiogenic effect of plasminogen activator inhibitor 1 is dose dependent. FASEB J. 16 (2), 147-154 (2002).
  26. Bajou, K., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 protects endothelial cells from FasL-mediated apoptosis. Cancer Cell. 14 (4), 324-334 (2008).
  27. Xu, X., Wang, H., Wang, Z., Xiao, W. Plasminogen activator inhibitor-1 promotes inflammatory process induced by cigarette smoke extraction or lipopolysaccharides in alveolar epithelial cells. Exp Lung Res. 35 (9), 795-805 (2009).
  28. Ji, Y., et al. Pharmacological Targeting of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Decreases Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (11), 2167-2175 (2016).
  29. Carmeliet, P., et al. Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice. Circulation. 96 (9), 3180-3191 (1997).
  30. Cao, C., et al. Endocytic receptor LRP together with tPA and PAI-1 coordinates Mac-1-dependent macrophage migration. EMBO J. 25 (9), 1860-1870 (2006).
  31. Thapa, B., Koo, B. H., Kim, Y. H., Kwon, H. J., Kim, D. S. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates infiltration of macrophages into melanoma via phosphorylation of FAK-Tyr(9)(2)(5). Biochem Biophys Res Commun. 450 (4), 1696-1701 (2014).
  32. Kortlever, R. M., Higgins, P. J., Bernards, R. Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence. Nat Cell Biol. 8 (8), 877-884 (2006).
  33. Fang, H., Placencio, V. R., DeClerck, Y. A. Protumorigenic activity of plasminogen activator inhibitor-1 through an antiapoptotic function. J Natl Cancer Inst. 104 (19), 1470-1484 (2012).
  34. Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56 (3), 236-240 (1994).
  35. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
  36. Bauer, M., Goldstein, M., Heylmann, D., Kaina, B. Human monocytes undergo excessive apoptosis following temozolomide activating the ATM/ATR pathway while dendritic cells and macrophages are resistant. PLoS One. 7 (6), e39956 (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

129shRNA1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved