Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu iletişim kuralı olarak bir düzeni kanser hücre satırları ve sonraki kullanımı, işlevsel bir Tet-ON sistemi kurmak için özellikle monosit/makrofajlar tümör microenvironment için işe alım içinde tümör hücre kaynaklı proteinlerin rolü eğitimi için hizmet vermektedir.

Özet

siRNA ve gen ifadesinin düzenlenmesine (KD) yöntemleri yıkmak shRNA-aracılı protein ve gen işlevini anlamak için çok değerli araçlardır. Ancak, KD ilgi proteinin hücre öldürücü etkisi veya KD beklenen etkisini durumda Saat-bağımlı, koşulsuz KD yöntemleri uygun değildir. Koşullu sistemleri bu gibi durumlarda en uygun ve çok ilgi konusu olmuştur. Bunlar Ecdysone-indüklenebilir overexpression sistemleri, sitokrom P-450 indüksiyon sistemi1, ve tetrasiklin gen ifade sistemleri düzenlenir.

Düzenlenmiş tetrasiklin gen ifade sistem indüksiyon shRNA ifade tetrasiklin huzurunda tarafından protein ifade üzerinde ters çevrilebilir kontrol sağlar. Bu protokol için biz gen ekspresyonu koşullu düzenlenmesi için insan kanser hücre hatlarında fonksiyonel Tet-ON sistemiyle bir deneysel tasarım mevcut. Sonra tümör hücre-monosit etkileşim çalışma programında küçük bir sistem kullanımını göstermektedir.

Giriş

İlişkili tümör makrofajlar (TAMs) teşvik ederek tümör gelişmeye katkıda tümör büyüme, metastaz ve bağışıklık yanıtı2düzenleyen. Kanser tümör sızmak ve pro-tumorigenic TAMs3ayırt askere inflamatuar monosit hücreleri. TAMs ile tümör infiltrasyonu zavallı klinik sonuçlar ile karşılıklı olarak ilişkilendirir ve makrofajlar4,5immünsüpresif rolüne bağlı. Ancak, makrofajlar tümöre alımı mekanizmaları değil de incelenmiştir ve ilgili yollar daha iyi bir anlayış daha fazla alan ve umut verici tedavilerin ilerlemesi için çok önemlidir. Bir tümör hücreleri ve tümör microenvironment (TME) normal hücreleri arasındaki etkileşimler eğitim sorunları karmaşıklığına mekanizmaları ve hücreleri crosstalk diseksiyon izin vitro yaklaşımlar gerektiren yer var. Burada bir kanser hücre kaynaklı etkisini parakrin, salgılanan protein geçiş makrofajlar, vitrogibi diğer hücre türleri üzerinde çalışmaya uygulanan çok yönlü bir metodoloji mevcut. ShRNA karşı bir kanser hücre kaynaklı protein monosit işe dahil ifade tetrasiklin indüklenebilir düzenleyicinin kontrolü altında nerede bir sistemi kullanarak, monosit salgılanan protein parakrin etkisi quantitated. Bu protokol için düzenlenmiş vektör sunulan tetrasiklin içine shRNA dizileri klonlama istikrarlı kanser hücre hatları nesil tarafından takip. Ayrıca, birincil insan monosit ve Boyden odası tahlil arıtma monosit geçirilmesi üzerinde bir kanser hücresi elde edilen protein parakrin etkisini analiz için kullanılır.

Genlerin kodlama protein downregülasyon sınırlamalar rağmen kullanımı olmadan siRNA ve shRNA teknikleri ile yaygın olarak uygulanır. Uzun süreli knock-down (KD) genlerin deneysel sonuçlarla müdahale hücre ikincil adaptif yanıt temin. Gen ifadesinin üzerinde geçici kontrol eksikliği zamana veya rol bir proteinin hücre hayatta kalmak için çok önemli bir protein dinamik rolü çalışmaya zor yapar. Bu sorun, sadece tümör kurulduktan sonra bir protein tümör gelişimi ve ilerlemesi rolü downregülasyon ifade ilgi proteinin nerede gerektirebilir vivo içinde ayarları'nda, özellikle önemlidir. Koşullu KD çok erken bir öldürücü etkisi KD, hücrelerde ve koşulsuz KD içinde tümör geliştirme eksikliği neden olabilir ederken rol protein analizi farklı aşamalarında tümör büyüme, içinde etkinleştirmek için önleme avantajına sahiptir.

Koşullu KD sistemleri bir dizi istikrarlı KD sınırlamaları gidermek üzere geliştirilmiştir. Koşullu gen ifade sistemleri Ecdysone indüklenebilir overexpression sistemleri, sitokrom P-450 indüksiyon sistemi1, ve tetrasiklin gen ifade sistemleri düzenlenir. Tetrasiklin düzenlenir gen ifade sistemleri shRNA antibiyotik tetrasiklin (veya onun daha istikrarlı analog - Doksisiklin) eklenmesi üzerine ifade üzerinde denetim sağlar. Tet-ON sistemlerinde shRNA ifade tetrasiklin/Doksisiklin bir gen ekspresyonu KD, sonuçlanan huzurunda indüklenen Tet-OFF sistemlerinde iken, shRNA ifade gen ifadesinde kaynaklanan tetrasiklin huzurunda bastırılır. Tetrasiklin-indüklenebilir sistem yokluğunda Doksisiklin - sözde leakiness6,7, shRNA ifade daha önce bildirilen düşük seviyelerde dezavantajıdır. Tet-ON sistem burada, yapısal ifade tetrasiklin önleyici (tetra) protein Tet-yanıt veren öğe (TRE) sıra faiz shRNA organizatörü bölgedir H1 içinde bağlama tetrasiklin, yönetim anlatılan bastırılmış. ShRNA ifadesi ve çeviri tetrasiklin bağlı şekilde8,9ilgi protein inhibisyonu sonuçlanır.

Eşzamanlı knock-in sırası TATA kutusu ve proksimal sıra öğesi (PSE) arasında arasında TATA kutusu ve transkripsiyon başlamadan Chan ve arktarafından geliştirilen site TetO, diğer kullanılabilir Tet-ON sistemleri içerir. 10 bu toksik doz tetrasiklin shRNA ifade, ancak, Sigara kaynaklı bir devlet altında düzenleyen shRNA seviyeleri düşük daha az ifade gereklidir. Temel Krüppel ilişkili kutusu (KRAB) Tet-ON sistem11 KRAB, konular genlerin transkripsiyon bastırma KRAB bağlama siteye 3 kb aralığı içinde yer alan bir çinko parmak protein içerir. Chimeric protein tTRKRAB TetO için bağlayabilirsiniz, ve büyük-yelpazesine nedeniyle DNA kontrol edilebilir, TetO değil transkripsiyon arasında sınırlı olmak site ve düzenleyici başlangıç ve düzenleyici faaliyete düşük etkisi. Sigara kaynaklı durumu altında bu kontrol edilebilir RNA müdahale sistemi shRNA11,12Sızan ifade alt düzey göster rapor edilmiştir; Ancak, bir sıralı, iki-vektör klonlama yaklaşım gerektirir. İle karşılaştırıldığında daha önce geliştirilen koşullu KD sistemleri Ecdysone indüklenebilir overexpression sistemi veya sitokrom P-450 indüksiyon sistemi gibi tetrasiklin düzenlenir sistem sağlamlık ve reversibility bir avantaja sahiptir ve bu nedenle En iyi sistem13rutin olarak kullanılan. Bu protokol için kullanılan sistem gibi yalındır, tek vektör klonlama, birden fazla klon, hızlı üretimi izin gerektirir ve leakiness içinde çok az düzeyde sergileyen çift TetO çakma sistemi ve KRAB Tet-ON sistem üzerinden avantajı vardır Doksisiklin yokluğu.

TME kanseri gelişimi için önemlidir. Tümör büyümesini kolaylaştırmak için kanser hücrelerinin inflamatuar monosit kemotaktik protein salgılayan tarafından işe almak. İşe monosit tümör sızmak ve tümör büyümesini ve metastaz katkıda pro tumorigenic TAMs içine ayırt etmek. Vitro çalışmalar bağışıklık hücre alımı geçiş deneyleri kullanmak, Boyden ile14,15,16,17odası tahlil yaygın olarak kullanılır. Bu tahlil, chemoattractant protein kaynağı, örneğin, kanser hücrelerini veya saf protein alt Kamara içinde yer alıyor. Bağışıklık hücreleri geçirgen membran üzerinden alt bölme ile ayrılmış üst odası yer alır. Doğru chemoattractant, ve bu membran alt tarafında bulunan artan Degrade geçiş hücreleri lekeli ve mikroskop altında sayılır. Burada plazminojen aktivatör inhibitörü 1 (PAI-1) chemoattractant fonksiyonu monosit üzerinde nerede ifade PAI-1 Doksisiklin ek tarafından düzenlenmiştir istikrarlı, indüklenebilir kanser hücre hatları oluşturarak test ediyoruz. İnsan birincil monosit Boyden odası geçiş assay olarak PAI-1 rolde monosit geçiş değerlendirmek için kullanıyoruz. İnsan birincil monosit ve THP1 gibi yaygın olarak kullanılan Monositik hücre hatları arasındaki farklılıkları bildirilmiştir ve farklı sitokin ifade desenleri18içerir; Örneğin, 5-10 kat artış TNF-α ifade düzeylerinde THP1 hücreleri tarafından insan monosit19' a karşılaştırılır. THP1 hücreleri insan lösemi Monositik hücrelerden türetilir, kolay korumak ve 19-50 h20saat iki katına ortalama ile çoğalırlar. Tam tersine, insan monosit yokluğunda büyüme faktörleri, kısa bir ömrü ile karakterizedir. Monosit bireyler arasında ve arıtma yöntemine bağlı olarak değişkenlik adil bir miktar oluşur bağış, kandan arındırılmış bu yana diğer hücre tipleri ile kontaminasyon oluşabilir. Bununla birlikte, birincil monosit ilgilidir ve kullanın veya birincil monosit Biyolojik araştırma19' kullanarak Monositik hücre hatları ile elde edilen sonuçları onaylamak için tavsiye edilir. Burada insan birincil monosit periferik kandan arınma için bir protokol açıklayın. Monosit arınma alternatif yöntemleri yoğunluk gradient ve yapışma protokolleri ve iki adım prosedürü Ficoll-Hypaque bir Percoll degrade21tarafından takip tek degradelerle içerir. Bu yöntemleri aralıkların % 70-90 arasında elde edilen monosit nüfus saflığı. Burada açıklanan yöntemi ile negatif bağışıklık seçimi22 takip yoğunluğu degradesi kullanan ve antikorlar ile doğrudan temas olmadan insan monosit arıtma böylece yanlışlıkla onların harekete geçirmek kaçınarak ve sonuçlanan sağlar bir > % 95 monosit saf nüfusu.

Burada sunulan Protokolü gen ekspresyonu KD insan kanser hücre hatlarında için işlevsel bir Tet-ON sistemi oluşturmak için kanser kaynaklı salgılanan protein PAI-1 monosit chemoattractant etkisini incelemek için kullanılır. PAI-1 tümörler çeşitli tarafından overexpressed ve onun ifade paradoksal zavallı klinik sonuç23,24ile karşılıklı olarak ilişkilendirir. PAI-1 pro-tumorigenic rolü, pro-anjiogenik bir sonucudur ve anti-apoptotik25,26çalışır. PAI-1 makrofajlar iltihap27sitesine istihdamı teşvik ederek iltihap için katkıda bulunmak için gösterilmiştir. PAI-1 düz kas cellmigration28,29 teşvik etmelerini ve Mac-1 bağımlı makrofaj geçiş30' gösterildi. PAI-1 overexpression zamanda ham 264.7 makrofajlar işe alım B16F10 Melanom tümörler31içine önemli ölçüde artırmak için gösterilmiştir. Ancak, PAI-1 rolde TAM geçiş ayrıntılı olarak araştırmış değil. Olup PAI-1 monosit kanser hücrelerine çeken soruyu cevaplamak için açıklanan protokolünü kullanır. Bu metodoloji diseksiyon tümör ve TME arasında çapraz karışma kanser hücrelerinde salgılanan protein susturmak ve TME bileşenlerini analiz sağlar.

Protokol

İnsan monosit sağlıklı gönüllülerden elde kullandığı protokolü bölümünde çocukların hastane Los Angeles insan araştırma Etik Komitesi kuralları izler ve insan malzeme altında Kurumsal değerlendirme Komitesi tarafından onaylandı Protokol numarası: CCI 08-00208.

1. kanser hücre hatları ile tetrasiklin düzenlenir shRNA ifade hazırlanması

  1. ShRNA PAI-1 Tet-pLKO-puro vektör içine klonlama 8 , 9
    1. Ben ve EkoRI bölünme 5' ucuna, anlamda dizisi, 6 nükleotit döngü ve antianlamlı sıra site yaşiçeren shRNA reaksiyonlar tasarlayın.
      Not: Aşağıdaki gibi tipik oligonucleotides tasarlanmıştır: ileri oligo: 5' CCGG - 19-21 bp, 19-21 bp Antisens - TTTTT, ters oligo - CTCGAG - hissediyorum: 5' AATTAAAAA-19-21 bp - CTCGAG - 19-21 bp Antisens 3' hissediyorum. Detaylı iletişim kuralı oligomer tasarım için 8' de bulunabilir. Bu çalışmada 3 shRNA dizileri PAI-1 karşı en güçlü silencing etkisi için test edilmiştir: shRNA 132, shRNA 2, shRNA 333ve şifreli33 Tablo 1' de dahil edilir.
    2. ShRNA reaksiyonlar tavlama ve şifreli shRNA reaksiyonlar.
      1. Oligonucleotides su 100 µM için sulandırmak ve mix 1 µL ileri Oligonükleotid, 1 µL ters Oligonükleotid ve 8 µL H2O.
      2. Oligonucleotides tavlamak için aşağıdaki mix: 1 µL Oligonükleotid karışımı, 5 µL arabellek 10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) pH 7.5, 50 mM Sodyum Klorür (NaCl), 10 mM magnezyum klorür (MgCl2), 1 mM dithioerythritol (DTE) ve 44 µL H 2 O
      3. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) termal cycler 95 ° c 5 min için karışımı kuluçkaya, enstrüman geçiş ve oda sıcaklığında (RT) ulaşılana kadar bekleyin.
    3. Tavlanmış oligonucleotides oligonucleotides 5 µL 3 M sodyum asetat pH 5.2-50 µL komplementer ekleyerek çökelti.
      1. 100 µL soğuk % 100 etanol (alkol) ekleyin ve-80 ° C'de 30 dk için kuluçkaya Maksimum hızda benchtop santrifüj 4 ° C'de 30 dk santrifüj kapasitesi
      2. Süpernatant kaldırmak, soğuk %70 500 µL eklemek alkol, 30 dk, santrifüj süpernatant kaldırmak ve Pelet 20 µL H2o çözülür
      3. Spectrophotometry, 260 Absorbans ölçme tarafından tavlanmış oligonucleotides konsantrasyonu değerlendirmek nm. Oligonucleotides 1 ng/µL son konsantrasyonu sulandırmak.
    4. Luria Bertani (LB) orta ve LB Ağar kaplamalar hazırlamak.
      1. İçin LB orta, erime 10 g tryptone, 5 gr Maya ekstresi, 10 g NaCl 1 litre su içinde. Ortamın pH 1 kullanarak 7.0 için pH ayarlama N NaOH ve basınçlı kap.
      2. LB Ağar kaplamalar için 15 g/L agar LB orta ekleyin. Basınçlı kap ve serin aşağı yaklaşık 50 ° c Antibiyotik ekleyin ve tabakları dökün.
    5. Çizgi ile Tet-pLKO-puro vektör transduced bakteri ( Tablo reçetesigörmek) LB agar plaka 100 µg/mL Ampisilin ile desteklenmiş ve gecede kuluçkaya 37 ° C'de (O/N)
    6. 100 mL LB orta plaka 1 koloni ile 100 µg/mL Ampisilin (LB/Ampisilin) ile takıma aşılamak ve O/N 37 ° C'de sallayarak ile büyümek
    7. IsolateTet-pLKO-puro 100 mL bakteriyel kültüründen bir plasmid izolasyon kit kullanarak.
    8. EcoRI ve AgeI enzimleri ile Tet-pLKO-puro vektör kısıtlama reaksiyon aşağıdaki gibi hazırlamak: 1 µL EcoRI, 1 µL AgeI, 5 µL 10 x arabellek, 1 µL plazmid DNA (1 µg), 42 µL H2O. kuluçkaya 1 37 ° C'de s Yeterince i ciddi vektör elde etmek için 5 x 50 µL reaksiyonlar hazırlayın.
    9. % 1'özel jel i ciddi vektöründen bir DNA arıtma kit kullanarak özel jel arındırmak için kullanın. DNA verimini artırmak için özel jel DNA oranı büyük kuyu için bir özel jel tarak kullanarak ve çoğu özel bir neşter kullanarak grubun dikkatlice kaldırarak en aza indirmek.
    10. Tüp ligasyonu tepki mix aşağıdaki gibi hazırlamak: 1 komplementer ng oligonucleotides, 50 ng i ciddi vektör, 2 µL 10 x ligaz arabellek, 1 µL ligaz ve su kadar 20 µL. Ligate vektör ile tavlanmış shRNA oligonucleotides 16 ° C O/n
      1. Buna ek olarak, bir negatif kontrol tepki oligonucleotides yanlış pozitif kolonilerde neden olur uncleaved, kısmen i ciddi ve kendini ve birleştirilmiş vektör hesabı olmadan hazır olun.
    11. Standart dönüştürme teknikleri kullanarak, dönüşüm ligasyonu karışımları kimyasal olarak yetkili bakteri hücreleri doğrudan içeren lentiviral vektörlerin homolog rekombinasyon önlemek için tasarlanmış içine tekrar eder.
    12. Bakteri plakaları Ampisilin O/N 37 ° C'de ile büyümek
      Not: büyüme uydu kolonilerden ortaya çıkarsa, dönüşümün tekrarlayın ve bakteri 30 ° C'de büyüme yavaş ve böylece uydu kolonileri önlemek için büyümek.
    13. Başarılı tüp ligasyonu doğrulamak için 10-20 tek koloniler, aşı 2 mL LB/Ampisilin kültürler arasında ve Ampisilin plaka hisse senedi bir tabak (pozitif bir klon daha sonra kullanılmak üzere) seç. O/N 37 ° C'de sallayarak ile sıvı kültürleri büyümek Plaka O/N 37 ° C'de kuluçkaya
    14. Parafilm ve 6 ° C'de mağaza ile plaka mühür
    15. Sıvı kültürlerden plasmid izolasyon kit kullanarak plazmid DNA izole et.
    16. Plazmid DNA XhoI enzim kullanarak Ampisilin dayanıklı kolonileri izole kısıtlama çözümlemesi gerçekleştirin. Her klon için aşağıdaki reaksiyon karışımı hazırlayın: 0.5 µL XhoI, 2.5 µL 10 x arabellek, 1 µL plazmid DNA (0,5 µg) ve 21 µL H2O. Incubate 37 ° C'de 1 h için Kısıtlama reaksiyon sonucu üzerinde % 1'özel jel tepki çalıştırarak analiz.
      Not: XhoI tarafından i ciddi WT vektör analizini kısıtlama 3 parçaları oluşturur: 8,447, 1800 ve 200 bp. Tet-pLKO-puro vektör 1.800 satıcısı sırayla bp olumlu klonlar shRNA-PAI-1 içeren mevcut değildir ve XhoI Özet içinde DNA parçalarının boyutu neden olur: 8,447, 190 ve 130 bp. Şekil 1' de gösterildiği gibi 2.000 bp parçası Ampisilin dayanıklı kolonileri numaradan izole DNA'bulunamadı: 3, 8 ve 11. Oligonucleotides tasarımına bağlı olarak, uzunluk ve olumlu kolonilerden DNA elde edilen parça sayısı değişebilir.
    17. Tet-pLKO-puro vektör içine shRNA sıralarının uygun ekleme sıralama8,9tarafından doğrulayın.
    18. Doğru klon içeren koloni ile 100 mL LB/Ampisilin kültürü aşılamak ve O/N 37 ° C'de büyümek
    19. Plasmid izolasyon kit kullanarak plazmid DNA izole et.
  2. Lentivirus parçacıklar nesil.
    1. 15 cm doku kültürü çanak kat ile %0,01 steril su solüsyonu ile yemeğin yüzeyini örten tarafından Poly-L-lizin Poly-L-lizin ve RT 15 dk. için kuluçka çözüm aspirasyon tarafından kaldırmak ve bulaşıkları kuruması.
    2. Tohum 5 x 106 insan embriyonik böbrek 293 hücreler Poly-L-lizin-ceket 15 cm çanak hücrelerde (HEK293) ve Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM) orta kültüründe takıma %10 FBS ve % 1 ile penisilin/streptomisin mix (kalem/Strep) 37 ° c, % 5 CO Onlar % 70 confluency ulaşana kadar 2 .
    3. Viral parçacıkların üretmek için HEK293 hücreleri 25 µg pLKO-Tet-Tarih-shRNA, 25 µg psPAX, (plazmid paketleme) ve 5 µg pMD2.G plazmid (zarf ifade plazmid) transfection reaktif kullanarak transfect.
      Not: psPAX ve pMD2.G plazmidleri Didier Trono laboratuarından (Ecole Polytechnique Federale de Lozan, İsviçre) bir hediyedir.
    4. HEK293 hücreleri ile 10 mM sodyum bütrat ve 20 mM HEPES pH 7.2 ve kodlamayla 8 h için takıma DMEM için orta değiştirerek ertesi gün ikna etmek.
    5. Fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) hücrelerle yıkama ve taze DMEM orta içeren 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES) pH 7.2 25 mL ekleyin. 48 h 37 ° C'de kuluçka sonra dikkatli bir şekilde pipetting tarafından virüs içeren orta toplamak; sızıntıları önlemek.
    6. Toplanan orta HEK293 hücreleri kaldırmak için 0,45 µM şırınga filtre ile filtre. Viral parçacıkların içeren orta hemen veya daha sonra kullanmak üzere-80 ° C'de depolanan.
  3. Stabil transfected hücre hatları nesil
    1. Tohum HCT116 kolon kanser hücreleri ve MDA-MB-231 meme kanseri hücrelerinin 50,000 hücreler/iyi DMEM orta % 10 fetal sığır serum (FBS) ve % 1 ile desteklenmiş kalem/Strep bir 12-şey plaka. Hücreleri % 60-70 birleşmesi kadar % 5 CO2 37 ° C'de kuluçkaya.
    2. PBS hücrelerle yıkama ve virüs içeren 1 mL ekleyin orta ve kanser hücreleri ve O/N % 5 CO237 ° C'de kuluçkaya. Bir denetim olarak taze DMEM orta %10 FBS ve % 1 ile 1 mL ekleyin kalem/Strep 2 wells kanser hücreleri ile için.
    3. Virüs içeren orta aspirasyon tarafından dikkatli bir şekilde çıkarın. PBS hücrelerle yıkama ve orta DMEM için (v/v) % 10 ile tetrasiklin ücretsiz değiştirin (Tet-free) FBS ve % 1 kalem/Strep.
    4. 72 h sonra yıkayın PBS hücrelerle ve orta DMEM için % 10 değiştirmek Tet-Alerjik FBS % 1 kalem/Strep, virüs transfected hücrelerin seçimini için 1 µg/mL puromisindir.
      1. Kullanılan hücre kültürünü bağlı olarak en iyi seçim için puromisindir konsantrasyon puromisindir konsantrasyonları (0.1, 0.5, 1, 2 ve 5 µg/mL) dizi sigara transduced hücrelerde test ve nerede hiçbir kontrol hücreleri hayatta en düşük konsantrasyon seçme ayarlamak Kültür 3 gün sonra.
    5. 3-14 gün boyunca puromisindir huzurunda hücreler kültür tarafından virüs transduced hücreleri seçin. Denetimleri, iki ek wells hücreleri, bir puromisindir ve bir puromisindir olmadan içeren orta ile sigara transduced ile hazırlayın. Denetim wells için karşılaştırıldığında virüs transduced hücreleri ile puromisindir iyi tarafından kısmi öldürülmesi hücreleri gözlemlemek.
      Not: Sigara transduced hücreler puromisindir huzurunda genişleyemez.
    6. Puromisindir dayanıklı HCT116 kolon kanseri ve MDA-MB-231 meme kanseri hücreleri koşullu KD verimliliğini doğrulayın.
      Not: Doksisiklin etkin yoğunluğuna kullanılan hücre hattı ile değişir ve (arası 100 ng/mL 2 µg/ml) titre gerekir.
      1. Zehirli hücrelerin ama etkili bir downregulating protein ilgi ifade değil Doksisiklin konsantrasyonu belirlemek. Bu protokol için 1 µg/mL başarıyla kullanılan vitroyapıldı.
      2. 72 h için hücreleri 0.1, 1 ve 2 µg/mL Doksisiklin de kültür. İfade downregulated protein düzeyini doğrulayın (burada, PAI-1) Batı tarafından lysate hücredeki analiz leke. ShRNA şifreli denetim hücrelere koşullu ifade HCT116 ve MDA-MB-231 hücre karşılaştırın.
  4. Klimalı orta hazırlanması
    1. Tohum 1 x 106 hücre stabil Doksisiklin ile transfected pLKO-shRNA içeren lentiviruses 10 cm yemeklerinde düzenlenir.
    2. Roswell Park Memorial Enstitüsü (RPMI) orta %10 Tet-Alerjik FBS ve % 1 ile hücre hatlarında büyümek kalem/Strep devamsızlık ve 72 h % 5 CO2, 37 ° C'de 1 µg/mL Doksisiklin varlığı her gün taze Doksisiklin ekleme.
      Not: RPMI orta monosit kültür koşulları ile uyumludur. Doksisiklin ışık duyarlı bileşiktir. Alüminyum folyo ile kaplayan tarafından gelen ışık hücre kültürleri korumak ve çalışma altında doğrudan ışığa maruz kaçının.
    3. Pipetting tarafından orta toplamak, 0,45 µm filtre ile filtre ve aliquots içinde-80 ° C'de dondurmak.

2. izolasyon monosit insan kanı üzerinden

  1. Monosit insan periferik kandan yalıtmak.
    Not: İnsan birincil monosit 7 mL beyaz kan hücrelerinin sağlıklı trombosit bağış elde bir lökosit filtresi konsantre etkilenmezsiniz. Donör bağlı olarak 1 x 109 ve 2 x 109 periferik kan mononükleer hücre (PBMCs), hangi monosit teşkil yaklaşık % 10 arasında bir lökosit filtresi üretir.
    1. İş istasyonu kabine laminar akışı hazırlayın.
    2. Makas ve laminar akış kabine 30 dk için ultraviyole ışık (UV) ile sterilize.
    3. Lökosit filtresi sprey %70 alkol ve air-dry iç kabin laminar akış.
    4. Her iki ucunda da lökosit filtresi makasla kesmek ve filtrenin içeriği 50 mL tüp içine boşaltın.
    5. %1 (v/v) FBS (PBS/FBS) içeren PBS ekleyerek 90 mL seyreltik.
    6. 3 x 50 mL tüpler 15 mL yoğunluk gradient çözüm ile hazırlayın. PBS/FBS seyreltilmiş kan yavaş yavaş 30 mL katmanları karıştırma önlemek için çekim akışı degrade çözüm bir pipet denetleyicisi kullanarak ayarlayın yoğunluğu üzerinde katman.
    7. RT, 400 x g 25 min için fren olmadan, bir salıncak Open End santrifüj kapasitesi.
    8. Üst katmanı atmayın ve PBMCs bir taze 50 mL tüp içeren orta katman aktarın.
    9. PBS/FBS ilâ 50 mL ve 10 dakika süreyle RT de 120 x g, santrifüj trombosit içeren süpernatant kaldırmak ekleyin. Bu işlemi iki kez daha tekrarlayın.
    10. Pelet PBS/FBS 50 mL resuspend ve bir hemasitometre kullanarak PBMCs saymak. RT de 120 x g, santrifüj kapasitesi ve PBS/FBS 1 mM ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) (PBS/FBS/EDTA) 5 x 107 hücre/mL nihai bir konsantrasyon içeren Pelet resuspend.
    11. Monosit Monositik olmayan hücreleri tükenmesi tarafından zenginleştirmek için negatif seçim setini kullanın.
      Not: Negatif seçim kiti bir kokteyl T hücreler, NK hücreleri, nötrofiller, B hücreleri, granülosit ve eritrositler karşı antikor (CD2 CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123 ve glycophorin A) kullanır. Antikor kompleksleri bind Monositik olmayan bu hücrelerin yüzeyine ve dextran manyetik parçacıklar. Tüp bir mıknatıs yerleştirildiğinde, boncuk tüp duvarlar için uygun ve Monositik olmayan hücreleri çözümden kaldırmak.
      1. 5 x 107 PBMCs/mL için 1 mL 50 µL antikor kokteyl ekleyin, bir pipet ile karıştırmak ve RT. ekle 50 µL manyetik boncuklar antikor kokteyl ile PBMCs için 10 min için kuluçkaya, bir pipet ile karıştırın ve RT. adlı başka bir 10 min için kuluçkaya
      2. PBS/FBS/EDTA 25 mL ve 50 mL tüp kapasiteli bir mıknatıs PBMC karışımı bir yer kadar ekleyin. 10 dk RT. boncuk tüp duvarlar için uygun ve çözüm Monositik olmayan hücrelerden çekilmek manyetik az için kuluçkaya.
    12. 25 mL pipet kullanarak, monosit tüp içinde mıknatıs içeren çözüm kaldırın. Pipet ile tüp tarafına dokunmamaya dikkat et.
    13. Belgili tanımlık eriyik vasıl 250 x g RT, santrifüj kapasitesi, süpernatant kaldırmak ve monosit %10 Tet-Alerjik FBS ve % 1'i içeren RPMI ortamda içeren Pelet resuspend kalem/Strep.

3. Boyden odası geçiş tahlil

  1. %1 (w/v) sığır serum albumin (BSA) çözüm BSA 1 g ultrasaf su 100 ml çözülerek hazırlamak ve sterilize etmek için 0.2 µm gözenek boyutu filtre.
  2. %1 steril BSA çözüm O/N için geliştirilmiş makrofajlar bağlılığı membran geçirgen membran ekler kuluçkaya. Monosit/makrofajlar, 5-8 µm gözenek boyutu ekler kullanın.
    1. Steril doku kültürü çanak % 1 BSA çözüm ile doldurun ve ekler çanak yerleştirin. 200 µL % 1 BSA çözüm ekler içinde geçerli.
  3. Ekler iki kez onları steril PBS ve filtre içinde uygulanan PBS dolu bir tabak koyarak yıkayın.
  4. 40.000 HCT116 ya da MDA-MB-231 0.5 mL RPMI orta %10 Tet-Alerjik FBS ve % 1'i içeren hücrelerde tohum kalem/Strep başı kuyuda bir 24-şey plaka nüsha. Alternatif olarak, önceden oluşturulan şartına Orta 0.5 mL kuyuda chemoattractant kaynağı olarak yerleştirin.
  5. Ertesi gün, plaka 8.000 monosit olarak hazırlanan eklemek %10 Tet-Alerjik FBS ve % 1'i içeren RPMI Orta 0.3 mL hacminde kalem/Strep, nüsha ve % 5 CO237 ° C'de kuluçkaya.
  6. Ekler sonra 48 h toplamak.
    Not: Bir deneme uzunluğu bağlı olarak kullanılan, bir zaman ders deneme nerede ekler farklı kuluçka zamanlarda toplanır gerçekleştirerek hücre ve belirli koşulları optimize edilmiş olması gerekir.
    1. Fazla orta sallamak ve tam olarak değil göç hücreleri kaldırmak için bir pamuk uçlu aplikatör ile iç yüzeyi çalmak.
    2. Wright-Giemsa yöntemini kullanarak ekler dış tarafında leke.
    3. Dikkatle geçirilen makrofajlar filtresiyle yan yüzleri emin bir yüksek viskozite mikroskop daldırma yağ içinde 3 ekler/cam slayt bağlayın.
  7. 20 X amacı ile hafif bir mikroskop kullanarak slaytları görüntü. 9 alanlar/filtresi fotoğraf çekmek. 9 alanlar/filtresi geçirilen makrofajlar saymak.

Sonuçlar

Üç shRNA dizileri en verimli KD, PAI-1 için test edildi. Bunun için yukarıda açıklanan protokol sonrası Tet-pLKO-puro ifade vektör içine shRNA dizileri PAI-1 ve şifreli (Tablo 1) karşı klonlanmış. HT-1080 Fibrosarkom hücre kültürünü stabil oluşturulan yapıları ile transfected ve hücreleri 3 gün boyunca Doksisiklin ile tedavi edildi. PAI-1 ifade tarafından Western Blot ()şekil 2Adoğrulandı) ve PAI-...

Tartışmalar

Hücre tiplerinin çeşitli oluşur, TME kanseri gelişimi için çok önemlidir. Optimal büyüme koşullarını tespit etmek için kanser hücrelerinin monosit kemotaktik faktör salgılanmasını aracılığıyla çekmek. Burada monosit işe alım mekanizması tümör hücreleri vitrotarafından eğitim için bir iletişim kuralı mevcut. Bu amaçla, bir indüklenebilir gen ifade sistem, arıtma birincil insan monosit ve bir geçiş yöntemi, Boyden odası tahlil bir örnek olarak kullanılır.

Açıklamalar

Yazarlar ifşa gerek yok.

Teşekkürler

Yazarlar Jacqueline Rosenberg el yazması proofreading için kabul etmek istiyorum. Bu eser bize Bölümü Sağlık ve insan Hizmetleri/Ulusal Sağlık Enstitüleri YA DeClerck için hibe ile tarafından desteklenmiştir (5R01 CA 129377 vermek) ve TJ Martell Vakfı. MH Kubala Saban Araştırma Enstitüsü Çocuk Hastanesi Los Angeles adlı bir araştırma kariyer geliştirme Fellowship Ödülü alıcı olduğunu.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Tet-pLKO-puro lentiviral vectorAddgene21915
FBS (Tetracycline-free)Omega ScientificFB-15
HistopaqueSigma10771-500ML
EasySep Human Monocyte Enrichment KitStemCell19059
EasySep MagnetStemCell18002
EcoRI HFNEBR3101S
AgeI HFNEBR3552S
Cut Smart bufferNEBB7200S
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362
PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup SystemPROMEGAA9281
psPAX vectorAddgene12260
pMD2.G vectorAddgene12259
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coliThermo Fisher ScientificC737303
Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stainProtocol123-869
HEK293 cellsATCCCRL-1573
PBSCorning21-031-CV
XhoI restriction enzymeNEBR0146S
LigaseNEBM0202S
Ligase bufferNEBM0202S
EDTA 0.5 M solutionThermo Fisher ScientificR1021
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
The Big Easy" EasySep MagnetStem Cell18001
0.1% Poly-L-Lysine solutionSigma-AldrichP8920
Sodium AcetateSigma-AldrichS7670
Sodium butyrateSigma-AldrichB5887
0.45 μM syringe filtersVWR International28145-479
NaOHSigma-AldrichS5881-500g
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)Invitrogen15504-020
Sodium Chloride(NaCl)Sigma-AldrichS7653-5 kg
Magnesium Chloride (MgCl2)Sigma-AldrichM8266-100g
dithioerythritol (DTE)Sigma-AldrichB8255-5g
ethanol (EtOH)Sigma-Aldrich792780
tryptoneAmrescoJ859-500g
yeast extractFluka70161-500g
Bacto agarBD214010
ampicillinSigma-AldrichA9393-5g
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Corning10-013-CV
phosphate-buffered saline (PBS)Corning21-031-CV
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Sigma-AldrichH3375
puromycinSigma-AldrichP9620
Doxycycline hyclateSigma-AldrichD9891-25g
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)Corning10-040-CV
0.5 M EDTA pH 8.0Thermo Fisher ScientificR1021
Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET MembraneBecton Dickinson353097
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA7906
Cotton-Tipped Applicator MedlineMDS202000
Protocol Hema 3 STAT pack Fisher Scientific Company123-869
Resolve Immersion Oil, High ViscosityRichard Allan ScientificM4004
Penicillin StreptomycinGibco15140122

Referanslar

  1. Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. Conditional transgenic technologies. J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).
  2. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
  3. Franklin, R. A., et al. The cellular and molecular origin of tumor-associated macrophages. Science. 344 (6186), 921-925 (2014).
  4. Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27 (4), 462-472 (2015).
  5. Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
  6. Mizuguchi, H., Hayakawa, T. Characteristics of adenovirus-mediated tetracycline-controllable expression system. Biochim Biophys Acta. 1568 (1), 21-29 (2001).
  7. Meyer-Ficca, M. L., et al. Comparative analysis of inducible expression systems in transient transfection studies. Anal Biochem. 334 (1), 9-19 (2004).
  8. Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
  9. Wee, S., et al. PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (35), 13057-13062 (2008).
  10. Chen, Y., Stamatoyannopoulos, G., Song, C. Z. Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro. Cancer Res. 63 (16), 4801-4804 (2003).
  11. Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. J Virol. 77 (16), 8957-8961 (2003).
  12. Solari, V., et al. MYCN-dependent expression of sulfatase-2 regulates neuroblastoma cell survival. Cancer Res. 74 (21), 5999-6009 (2014).
  13. Liao, Y., Tang, L. Inducible RNAi system and its application in novel therapeutics. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 630-638 (2016).
  14. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
  15. Jungi, T. W. Assay of chemotaxis by a reversible Boyden chamber eliminating cell detachment. Int Arch Allergy Appl Immunol. 48 (3), 341-352 (1975).
  16. Jung, H. S., et al. Monoclonal antibodies against autocrine motility factor suppress gastric cancer. Oncol Lett. 13 (6), 4925-4932 (2017).
  17. Park, H., et al. Effect of Sorbus commixta on the invasion and migration of human hepatocellular carcinoma Hep3B cells. Int J Mol Med. , (2017).
  18. Schildberger, A., Rossmanith, E., Eichhorn, T., Strassl, K., Weber, V. Monocytes, peripheral blood mononuclear cells, and THP-1 cells exhibit different cytokine expression patterns following stimulation with lipopolysaccharide. Mediators Inflamm. 2013, 697972 (2013).
  19. Heil, T. L., Volkmann, K. R., Wataha, J. C., Lockwood, P. E. Human peripheral blood monocytes versus THP-1 monocytes for in vitro biocompatibility testing of dental material components. J Oral Rehabil. 29 (5), 401-407 (2002).
  20. Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  21. de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
  22. Flo, R. W., et al. Negative selection of human monocytes using magnetic particles covered by anti-lymphocyte antibodies. J Immunol Methods. 137 (1), 89-94 (1991).
  23. Grondahl-Hansen, J., et al. Plasminogen activator inhibitor type 1 in cytosolic tumor extracts predicts prognosis in low-risk breast cancer patients. Clin Cancer Res. 3 (2), 233-239 (1997).
  24. Borgfeldt, C., Hansson, S. R., Gustavsson, B., Masback, A., Casslen, B. Dedifferentiation of serous ovarian cancer from cystic to solid tumors is associated with increased expression of mRNA for urokinase plasminogen activator (uPA), its receptor (uPAR) and its inhibitor (PAI-1). Int J Cancer. 92 (4), 497-502 (2001).
  25. Devy, L., et al. The pro- or antiangiogenic effect of plasminogen activator inhibitor 1 is dose dependent. FASEB J. 16 (2), 147-154 (2002).
  26. Bajou, K., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 protects endothelial cells from FasL-mediated apoptosis. Cancer Cell. 14 (4), 324-334 (2008).
  27. Xu, X., Wang, H., Wang, Z., Xiao, W. Plasminogen activator inhibitor-1 promotes inflammatory process induced by cigarette smoke extraction or lipopolysaccharides in alveolar epithelial cells. Exp Lung Res. 35 (9), 795-805 (2009).
  28. Ji, Y., et al. Pharmacological Targeting of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Decreases Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (11), 2167-2175 (2016).
  29. Carmeliet, P., et al. Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice. Circulation. 96 (9), 3180-3191 (1997).
  30. Cao, C., et al. Endocytic receptor LRP together with tPA and PAI-1 coordinates Mac-1-dependent macrophage migration. EMBO J. 25 (9), 1860-1870 (2006).
  31. Thapa, B., Koo, B. H., Kim, Y. H., Kwon, H. J., Kim, D. S. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates infiltration of macrophages into melanoma via phosphorylation of FAK-Tyr(9)(2)(5). Biochem Biophys Res Commun. 450 (4), 1696-1701 (2014).
  32. Kortlever, R. M., Higgins, P. J., Bernards, R. Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence. Nat Cell Biol. 8 (8), 877-884 (2006).
  33. Fang, H., Placencio, V. R., DeClerck, Y. A. Protumorigenic activity of plasminogen activator inhibitor-1 through an antiapoptotic function. J Natl Cancer Inst. 104 (19), 1470-1484 (2012).
  34. Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56 (3), 236-240 (1994).
  35. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
  36. Bauer, M., Goldstein, M., Heylmann, D., Kaina, B. Human monocytes undergo excessive apoptosis following temozolomide activating the ATM/ATR pathway while dendritic cells and macrophages are resistant. PLoS One. 7 (6), e39956 (2012).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Kanser ara t rmalarsay 129ko ullu knock h cre gdoksisiklinshRNAa aPAI 1monositkanser h cre hatlar

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır