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In diesem Artikel

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  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll dient eine Regelung für die Einrichtung eines funktionalen Tet-ON Systems in Krebszelllinien und seine spätere Verwendung, insbesondere für die Untersuchung der Rolle der Tumor Zelle abgeleitet Proteine bei der Rekrutierung von Monozyten/Makrophagen, den Tumor Mikroumgebung.

Zusammenfassung

SiRNA und ShRNA-vermittelten niederzuschlagen (KD) Methoden der Genexpression regulieren sind wertvolle Werkzeuge für das Verständnis der Funktion der Gene und Proteine. Jedoch in dem Fall, dass das KD des Proteins des Interesses eine tödliche Wirkung auf Zellen hat oder die erwartete Wirkung der KD ist sind zeitabhängig, bedingungslose KD-Methoden nicht geeignet. Bedingte Systeme eignen sich eher in diesen Fällen und das Thema von großem Interesse gewesen. Dazu gehören Ecdyson-induzierbaren Überexpression Systeme, Cytochrom P-450 Induktion System1, und die Tetracyclin reguliert gen Expressionssysteme.

Das Tetracyclin reguliert gen Ausdruck System ermöglicht reversible Kontrolle über Protein-Expression durch Induktion der ShRNA Ausdruck im Beisein von Tetracyclin. In diesem Protokoll präsentieren wir ein experimentelles Design mit funktionalen Tet-ON System im menschlichen Krebszelllinien für bedingte Regulation der Genexpression. Dann zeigen wir den Einsatz dieses Systems in der Studie von Tumor-Zelle-Monocyte-Interaktion.

Einleitung

Tumor verbunden sind Makrophagen (TAMs) tragen zur Tumorentstehung durch die Förderung von Tumorwachstum und Metastasierung regulieren die Immunantwort2. Krebszellen Rekrut entzündliche Monozyten, die Tumor zu infiltrieren und Pro-tumorigenic TAMs3differenzieren. Infiltration des Tumors mit TAMs korreliert mit schlechten klinischen Verlauf und die immunsuppressive Rolle der Makrophagen4,5verbunden worden. Allerdings sind die Mechanismen der Rekrutierung von Makrophagen an den Tumor nicht gut erforscht und ein besseres Verständnis der beteiligten Bahnen ist entscheidend für die Weiterentwicklung des Feldes und vielversprechende Therapien. Eine der Herausforderungen bei der Untersuchung der Wechselwirkungen zwischen Tumorzellen und normalen Zellen im Tumor Mikroumgebung (TME) ist die Komplexität der Mechanismen und Zellen beteiligt, in-vitro- Ansätze, die Präparation der das Übersprechen zu ermöglichen. Hier präsentieren wir eine vielseitige Methode, die angewendet werden kann, um parakrine Wirkung von einem Krebs Zelle abgeleitet, sekretierten Proteine über die Migration von anderen Zelltypen wie Makrophagen, in Vitrozu untersuchen. Mit einem System, wo ist der Ausdruck der ShRNA gegen ein Krebs Zelle abgeleitete Protein beteiligt bei der Rekrutierung von Monozyten unter der Kontrolle des Tetracyclin induzierbaren Promotors, ist die parakrine Wirkung des sekretierten Proteins auf Monozyten quantitated. In diesem Protokoll folgte Klonen von ShRNA Sequenzen in der Tetracyclin-regulierten Vektor vorgestellt Generation der stabilen Krebszelllinien. Darüber hinaus die Reinigung des primären menschlichen Monozyten und eine Boyden Kammer Assay werden verwendet, um die parakrine Wirkung eine Krebszelle abgeleitete Protein zur Migration von Monozyten zu analysieren.

Herunterregulierung des Proteins Kodierung Gene wird häufig mit SiRNA und ShRNA Techniken, wenn auch nicht ohne Einschränkungen in der Verwendung angewendet. Der langfristigen Knock-Down (KD) von Genen kann sekundäre adaptive Reaktion der Zellen hervorrufen, die experimentellen Ergebnisse beeinträchtigen. Fehlende zeitliche Kontrolle der Genexpression macht es schwierig, die dynamische Rolle eines Proteins über die Zeit oder die Rolle eines Proteins entscheidend für das Überleben der Zellen zu studieren. Dieses Problem ist besonders wichtig in in-Vivo -Einstellungen, wo möglicherweise die Rolle eines Proteins in Tumorentstehung und Progression Downregulation des Ausdrucks des Proteins des Interesses erforderlich, nur nach Tumor festgestellt wird. Bedingte KD hat den Vorteil, verhindern eine zu frühe tödliche Wirkung von der KD auf Zellen und Analyse der Rolle des Proteins in verschiedenen Phasen des Tumorwachstums, zu ermöglichen, während bedingungslose KD mangelnde Entwicklung von Tumoren führen kann.

Eine Reihe von bedingten KD-Systeme wurden entwickelt, um die Einschränkungen des stabilen KD zu beheben. Die bedingte gen Expressionssysteme gehören Ecdyson-induzierbaren Überexpression Systeme, Cytochrom P-450 Induktion System1und Tetracyclin reguliert gen Expressionssysteme. Die Tetracyclin-regulierte Gene Expressionssysteme ermöglichen Steuerung Ausdruck der ShRNA nach Zugabe von Antibiotika Tetracyclin (oder seine stabiler analog - Doxycyclin). In Tet-ON Systemen, der Ausdruck der ShRNA induziert wird, in Anwesenheit von Tetracyclin/Doxycyclin, wodurch eine Genexpression KD, während in Tet-OFF-Systeme, ist der Ausdruck der ShRNA in Anwesenheit von Tetracyclin, wodurch in der Genexpression unterdrückt. Ein Nachteil von Tetracyclin-induzierbaren Systems ist bereits berichtet niedrigen Ebenen des Ausdrucks der ShRNA in Ermangelung von Doxycyclin - so genannte Undichtigkeit6,7. In der Tet-beschrieben System hier, bei der Verabreichung von Tetracyclin, die Bindung des konstitutiv exprimierten Tetracyclin Repressor (TetR) Protein auf die Tet-responsive Element (TRE) Sequenz innerhalb der H1 Promotorregion ShRNA von Interesse ist unterdrückt. Dies führt zu Ausdruck der ShRNA und Hemmung der Übersetzung des Proteins des Interesses an einem Tetracyclin-abhängigen Weise8,9.

Andere verfügbare Tet-ON-Systeme umfassen gleichzeitige Knock-in der die Sequenz zwischen TATA-Box und proximalen Sequence-Element (PSE) und TATA-Box und Transkription starten Website entwickelt von Chan Et al.TetO. 10 dieses System erfordert weniger toxische Dosen von Tetracyclin, ShRNA Ausdruck, jedoch unter einer nicht-induzierte Zustand zu regulieren niedrige Niveaus der ShRNA ausgedrückt werden. Der Krüppel-assoziierten Feld (Krabbe) basierte Tet-ON System11 enthält KRAB, ein Zink-Finger-Protein, das Themen Gene innerhalb eines Bereichs von 3 kb der KRAB Bindungsstelle transcriptional Unterdrückung gelegen. Chimäres Protein tTRKRAB TetO binden kann, und aufgrund der großen Palette von DNA steuerbare Kapazität, TetO brauchen nicht zwischen die Transkription zu Website und dem Projektträger zu starten und haben geringe Auswirkungen auf die Aktivität des Veranstalters. Unter den nicht-induzierte Zustand wurde diese steuerbare RNA Interferenzsystem berichtet, zeigen ein geringeres Maß an undichten Ausdruck der ShRNA11,12; Es erfordert jedoch einen sequenziellen, zwei-Vektor klonen Ansatz. Im Vergleich zu vorher entwickelten bedingte KD-Systeme wie z. B. die Ecdyson-induzierbaren Überexpression oder Cytochrom P-450 Induktionssystem das Tetracyclin-regulierten System hat den Vorteil, seine Robustheit und Reversibilität und ist daher die am häufigsten verwendeten routinemäßig System13. Das System verwendet in diesem Protokoll hat den Vorteil gegenüber dual TetO Knock-in-System und KRAB Tet-ON System, wie es erfordert, geradlinig, einzelne Vektor klonen, ermöglicht schnelle Erzeugung von mehreren Klonen, und es sehr geringe Undichtigkeit in zeigt der das Fehlen von Doxycyclin.

TME ist entscheidend für die Entstehung von Krebs. Zur Erleichterung der Tumorwachstum rekrutieren Krebszellen entzündliche Monozyten durch Sekretion chemotaktische Proteine. Rekrutierte Monozyten des Tumors zu infiltrieren und differenzieren in Pro-tumorigenic TAMs, die Tumorwachstum und Metastasierung beitragen. In-vitro- Studien der Immunzelle Rekrutierung nutzen Migration Assays, mit Boyden Kammer Assay wird weithin verwendet14,15,16,17. In diesem Test wird die Lockstoffgradient Protein-Quelle, z. B. Krebszellen oder ein gereinigtes Protein, in der unteren Kammer platziert. Immunzellen befinden sich in der oberen Kammer durch poröse Membran aus dem unteren Fach getrennt. Zellen, die Migration auf die zunehmende Neigung der Lockstoffgradient, und auf der unteren Seite der Membran sind fleckig und unter dem Mikroskop ausgezählt. Hier testen wir die Lockstoffgradient Funktion des Plasminogen-Aktivator-Inhibitor 1 (PAI-1) auf Monozyten durch die Generierung von stabilen, induzierbaren Krebszelllinien, wo Doxycyclin Zusatz Expression von PAI-1 geregelt ist. Wir verwenden menschliche primäre Monozyten in der Boyden Kammer Migration Test zu um beurteilen, die Rolle des PAI-1 Monocyte Migration. Unterschiede zwischen primären menschlichen Monozyten und weit verbreiteten monozytären Zelllinien wie THP1 berichtet worden und umfassen verschiedene Cytokine Ausdruck Muster18; z. B. 5-10 fache Erhöhung der TNF-α Ausdruck von THP1 Zellen gegenüber menschlichen Monozyten19. THP1 Zellen menschlichen Leukämie monozytären Zellen abgeleitet sind, sind leicht zu pflegen und vermehren sich mit durchschnittlich Verdopplungszeit von 19-50 h20. Im Gegenteil, sind menschlichen Monozyten gekennzeichnet durch eine kurze Lebensdauer in der Abwesenheit von Wachstumsfaktoren. Da Monozyten aus Blut von Spendern, gereinigt sind eine ganze Menge Variabilität tritt zwischen den Individuen und abhängig von der Methode der Reinigung, kann Verunreinigungen mit anderen Zelltypen entstehen. Jedoch primäre Monozyten relevant sind und es wird empfohlen, verwenden oder mit der monozytären Zelllinien mit primären Monozyten in biologischen Forschung19erzielten Ergebnisse bestätigen. Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Reinigung der menschlichen primäre Monozyten aus dem peripheren Blut. Alternative Methoden der Monocyte Reinigung gehören Dichte-Gradienten und Haftung-Protokolle und zwei-Schritt-Verfahren mit einzelnen Steigungen von Ficoll-Hypaque gefolgt von einer Percoll gradient21. Die Reinheit der Monocyte Bevölkerung durch diese Methoden schwankt zwischen 70-90 % erhalten. Die hier beschriebene Methode verwendet ein Dichtegradient, gefolgt von einer negativen Auslese immun22 und ermöglicht die Reinigung des menschlichen Monozyten ohne direkten Kontakt mit Antikörpern, damit ihre versehentliche Aktivierung zu vermeiden und was ein > 95 % reines Bevölkerung von Monozyten.

Das Protokoll hier vorgestellten dient zur Errichtung eines funktionalen Tet-ON Systems Genexpression KD in menschlichen Krebszelllinien, um die Lockstoffgradient Wirkung des Krebs-abgeleitete sekretierten Proteins PAI-1 auf Monozyten zu studieren. PAI-1 ist durch eine Vielzahl von Tumoren überexprimiert und seinen Ausdruck paradoxerweise korreliert mit schlechten klinischen Verlauf23,24. Die Pro-tumorigenic Rolle des PAI-1 ergibt sich aus seiner Pro-angiogenen und Anti-apoptotische Funktionen25,26. PAI-1 hat sich gezeigt, zu einer Entzündung durch Förderung der Rekrutierung von Makrophagen an den Ort der Entzündung27beizutragen. PAI-1 zeigte, glatte Muskulatur Cellmigration28,29 zu fördern und zur Teilnahme an der Mac-1 abhängige Makrophagen Migration30. PAI-1-Überexpression nachweislich auch Rekrutierung von Raw 264,7 Makrophagen in B16F10 Melanom Tumoren31deutlich zu verbessern. Jedoch wurde die Rolle des PAI-1 in TAM Migration nicht im Detail untersucht. Wir verwenden das beschriebene Protokoll beantworten die Frage, ob PAI-1 Monozyten zu Krebszellen zieht. Diese Methodik ermöglicht Dissektion der das Übersprechen zwischen Tumor und TME durch die sekretierten Proteine in Krebszellen zum Schweigen zu bringen und die Komponenten von der TME analysieren.

Protokoll

Die Protokoll-Abschnitt, der menschlichen Monozyten gewonnen von gesunden Probanden verwendet folgt den Richtlinien der Kinder Krankenhaus Los Angeles menschliche Forschung Ethik-Kommission und der Institutional Review Board unter das Menschenmaterial genehmigt wurde Protokoll Nummer: CCI 08-00208.

1. Vorbereitung von Krebszelllinien mit Tetracyclin-regulierten ShRNA Ausdruck

  1. Klonen der ShRNA PAI-1 in Tet pLKO Puro Vektor 8 , 9
    1. ShRNA Oligomere, die Alterenthalten ich und EcoRI Spaltung am 5'-Ende, die Sinn-Sequenz, eine 6 Nukleotid-Schleife und der antisense Reihenfolge Website zu entwerfen.
      Hinweis: Typische Oligonukleotide sind wie folgt bestimmt: Forward Oligo: 5' CCGG - 19-21 bp spüren - CTCGAG - 19-21 bp Antisense - TTTTT, Reverse Oligo: 5' AATTAAAAA-19-21 bp spüren - CTCGAG - 19-21 bp Antisense 3'. Detailliertes Protokoll für das Oligomer-Design finden Sie im 8. In dieser Studie wurden für den stärksten Stummschaltungs-Effekt 3 ShRNA Sequenzen gegen PAI-1 getestet: ShRNA 132, 2 ShRNA und ShRNA 333Rührei33 sind in Tabelle 1enthalten.
    2. Tempern Oligomere ShRNA und ShRNA Oligomere kletterte.
      1. Rekonstituieren Sie Oligonukleotide bis 100 µM im Wasser und mischen Sie 1 µL vorwärts Oligonukleotid, 1 µL Reverse Oligonukleotid und 8 µL H2O.
      2. Um die Oligonucleotides Tempern, mischen Sie die folgenden: 1 µL Oligonukleotid-Mischung, 5 µL Puffer 10 mM Tris (Hydroxymethyl) Aminomethane (Tris) pH 7.5, 50 mM Natriumchlorid (NaCl), 10 mM Magnesiumchlorid (MgCl2), 1 mM Dithioerythritol (DTE) und 44 µL H 2 O.
      3. Inkubieren Sie die Mischung in eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Thermocycler bei 95 ° C für 5 min, schalten Sie das Gerät und warten Sie, bis die Raumtemperatur (RT) erreicht ist.
    3. Voreilige geglühten Oligonukleotide durch Zugabe von 5 µL 3 M Natriumacetat pH 5,2 bis 50 µL geglüht Oligonukleotide.
      1. Fügen Sie 100 µL kalt 100 % Ethanol (EtOH) und inkubieren Sie für 30 min bei-80 ° C. Zentrifuge in einer Benchtop-Zentrifuge mit maximaler Geschwindigkeit für 30 min bei 4 ° C.
      2. Überstand zu entfernen, fügen Sie 500 µL kaltem 70 % EtOH, Zentrifuge für 30 min, überstand zu entfernen, und lösen sich Pellets in 20 µL H2O.
      3. Bewerten Sie die Konzentration der geglühten Oligonukleotide durch Spektralphotometrie, Messung der Absorption bei 260 nm. Verdünnen Sie Oligonukleotide die Endkonzentration von 1 ng/µL.
    4. Luria Bertani (LB)-Medium und LB-Agar-Platten vorbereiten.
      1. Für LB-Medium, Auflösung 10 g Tryptone, 5 g Hefeextrakt, 10 g NaCl in 1 L Wasser. Anpassen der pH-Wert des Mediums auf pH 7,0 mit 1 N NaOH und Autoklaven.
      2. Fügen Sie für LB-Agar-Platten 15 g/L Agar in LB-Medium. Autoklaven und auf ca. 50 ° c abkühlen Antibiotikum und gießen Sie die Platten.
    5. Streifen von Bakterien mit Tet pLKO Puro Vektor ausgestrahlt (siehe die Tabelle der Materialien) auf LB Agarplatte mit 100 µg/mL Ampicillin ergänzt und inkubieren Sie über Nacht (O/N) bei 37 ° C.
    6. Impfen Sie 100 mL LB-Medium ergänzt mit 100 µg/mL Ampicillin (LB/Ampicillin) mit 1 Kolonie von der Platte zu und wachsen Sie O/N unter Schütteln bei 37 ° C.
    7. IsolateTet-pLKO-Puro aus 100 mL Bakterienkultur mit einem Plasmid-Isolierung-Kit.
    8. Bereiten Sie die Einschränkung Reaktion für die Tet-pLKO-Puro-Vektor mit EcoRI und AgeI Restriktionsenzymen wie folgt: 1 µL EcoRI, 1 µL AgeI, 5 µL 10-fach Puffer 1 µL Plasmid-DNA (1 µg), 42 µL H2O. inkubieren 1 h bei 37 ° C. Um genug gespalten Vektor zu erhalten, bereiten Sie bis zu 5 x 50 µL Reaktionen.
    9. Verwenden Sie 1 % Agarosegel gespalten Vektor aus dem Agarosegel mit einem DNA-Reinigung-Kit zu reinigen. Um die Ausbeute an DNA zu erhöhen, minimieren Sie die Agarose DNA-Verhältnis im Gel mithilfe einer Agarose-Gel-Kamm für große Brunnen und indem Sie die meisten der Agarose sorgfältig aus der Band mit einem Skalpell.
    10. Die Ligatur Reaktion Mischung wie folgt vorbereiten: 1 ng geglüht Oligonukleotide, 50 ng gespalten Vektor 2 µL 10-fach Ligase Puffer, 1 µL-Ligase und Wasser bis zu 20 µL. verbinden den Vektor mit geglühtem ShRNA Oligonukleotiden bei 16 ° C O/N.
      1. Bereiten Sie darüber hinaus eine Negativkontrolle Reaktion ohne Oligonukleotide, uncleaved, teilweise gespalten und selbst aufgespaltenen Vektor erklären, die zu falsch positiven Kolonien führt.
    11. Mit standard Transformation Techniken verwandeln Sie Ligatur Mischungen in chemisch kompetente Bakterienzellen homologe Rekombination der Lentivirale Vektoren mit direkten Wiederholungen zu verhindern.
    12. Wachsen Sie Bakterien auf Tellern mit Ampicillin O/N bei 37 ° C.
      Hinweis: Wenn Wachstum der Sat-Kolonien auftritt, wiederholen Sie die Transformation und wachsen Sie Bakterien bei 30 ° C zu verlangsamen das Wachstum und damit verhindern, dass Sat-Kolonien.
    13. Um erfolgreiche Unterbindung zu überprüfen, wählen Sie zwischen 10-20 einzelne Kolonien, aufpfropfend 2 mL LB/Ampicillin-Kulturen und eine Ampicillin-Platte als Lager Platte (später als positive Klon verwendet werden). Wachsen Sie flüssige Kulturen mit zitternden O/N bei 37 ° C. Inkubieren Sie die Platte O/N bei 37 ° c
    14. Die Dichtplatte mit Parafilm und Store bei 6 ° C.
    15. Plasmid-DNA aus flüssigen Kulturen mit einem Plasmid-Isolierung-Kit zu isolieren.
    16. Führen Sie Restriktionsanalyse Plasmid-DNA isoliert von Ampicillin-resistente Kolonien mit XhoI Enzym. Für jeden Klon bereiten die folgende Reaktion Mischung: 0,5 µL XhoI, 2,5 µL 10-fach Puffer 1 µL Plasmid-DNA (0,5 µg), und 21 µL H2O. Inkubation für 1 h bei 37 ° C. Analysieren Sie das Ergebnis der Einschränkung Reaktion, indem man die Reaktion auf eine 1 % Agarosegel.
      Hinweis: Restriktionsanalyse gespalten durch XhoI WT-Vektors generiert 3 Fragmente: 8.447, 1.800 und 200 bp. Stuffer-Sequenz in Tet pLKO Puro Vector 1800 bp ist nicht in positive Klone mit ShRNA-PAI-1 und der XhoI Digest führt zu DNA-Fragmente der Größe: 8.447, 190 und 130 bp. Wie in Abbildung 1dargestellt, die 2.000 bp Fragment findet sich nicht in DNA isoliert von Ampicillin resistente Kolonien Anzahl: 3, 8 und 11. Je nach Bauart der Oligonukleotide variieren die Länge und Anzahl der erhaltenen Fragmente von DNA aus positiven Kolonien.
    17. Überprüfen Sie die korrekte einsetzen der ShRNA Sequenzen in der Tet-pLKO-Puro-Vektor durch Sequenzierung8,9.
    18. Impfen Sie 100 mL LB/Ampicillin-Kultur mit der Kolonie mit der richtigen Klon zu und wachsen Sie O/N bei 37 ° C.
    19. Plasmid-DNA mit einem Plasmid-Isolierung-Kit zu isolieren.
  2. Teilchenerzeugung Lentivirus.
    1. Beschichten die 15 cm Gewebe Kulturschale mit Poly-L-Lysin durch Abdecken der Oberfläche der Schale mit sterilem Wasserlösung von 0,01 % Poly-L-Lysin und Inkubation bei RT für 15 min. die Lösung durch Absaugen entfernen und trocknen das Geschirr.
    2. Samen 5 x 106 menschliche embryonale Nieren-293-Zellen (HEK293) Zellen in der Poly-L-Lysin-beschichtet 15 cm Schüssel und Kultur in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) Medium ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin/Streptomycin Mischung (Pen/Strep) bei 37 ° C, 5 % CO 2 bis 70 % Konfluenz erreicht.
    3. Um Viruspartikel produzieren, transfizieren Sie HEK293 Zellen mit 25 µg pLKO-Tet-auf-ShRNA, 25 µg PsPAX, (Verpackung Plasmid), und 5 µg pMD2.G Plasmide (Umschlag mit dem Ausdruck ihrer Plasmid) mit Transfection Reagens.
      Hinweis: PsPAX und pMD2.G Plasmide sind ein Geschenk aus dem Didier Trono Labor (Ecole Polytechnique Federale de Lausanne, Schweiz).
    4. Induzieren Sie HEK293 Zellen am nächsten Tag durch den Wechsel des Mediums zu DMEM mit 10 mM Natrium Butyrat und 20 mM HEPES pH 7,2 und Kultivierung für 8 h ergänzt.
    5. Waschen Sie die Zellen mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) und 25 mL frische DMEM mittlere mit 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic Säure (HEPES) pH 7,2. Nach der Inkubation bei 37 ° C für 48 h sammeln Sie sorgfältig Virus-haltigen Medium durch pipettieren; Vermeidung von Leckagen.
    6. Filtern Sie die gesammelten Mittel durch einen 0,45 µM Spritze Filter, HEK293 Zellen zu entfernen. Die Viruspartikel-haltigem Medium kann sofort verwendet oder bei-80 ° C für die spätere Verwendung gespeichert werden.
  3. Generation von stabil transfizierten Zelllinien
    1. Samen HCT116 Darmkrebszellen und MDA-MB-231 Brustkrebs-Zellen Zellen/Brunnen in DMEM Medium ergänzt mit 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % auf 50.000 Pen/Strep in einem 12-Well-Platte. Inkubation bei 37 ° C um 5 % CO2 bis Zellen 60-70 % Zusammenfluss sind.
    2. Zellen mit PBS waschen und 1 mL Virus-haltigen Medium zu Krebs Zellen und inkubieren Sie O/N bei 37 ° C um 5 % CO2. Als ein Steuerelement hinzufügen 1 mL frisches DMEM Medium ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Pen/Strep, 2 Brunnen mit Krebszellen.
    3. Entfernen Sie vorsichtig die Virus-haltigen Medium durch Absaugen. Die Zellen mit PBS waschen und ändern Sie das Medium in DMEM mit 10 % (V/V) Tetracyclin-freie FBS (Tet-frei) und 1 % Pen/Strep.
    4. Nach 72 h, Zellen mit PBS waschen und ändern Sie das Medium in DMEM 10 % Tet-freie FBS 1 % Pen/Strep, 1 µg/mL Puromycin für Auswahl von Virus-transfizierten Zellen.
      1. Abhängig von der Zell-Linie verwendet einstellen Sie Puromycin Konzentration für die optimale Auswahl durch Tests Puromycin Konzentrationen (0.1, 0.5, 1, 2 und 5 µg/mL) in den Zellen nicht ausgestrahlt und wählen Sie die niedrigste Konzentration, wo keine Kontrollzellen überleben, nach 3 Tagen der Kultur.
    5. Wählen Sie Virus ausgestrahlt Zellen durch die Kultivierung von Zellen in Anwesenheit von Puromycin für 3-14 Tage. Bereiten Sie als Steuerelemente zwei weitere Brunnen mit nicht ausgestrahlt Zellen, eine mit Puromycin und ohne Puromycin-haltigem Medium. Beobachten Sie teilweise Tötung der Zellen von Puromycin im Brunnen mit Virus ausgestrahlt Zellen im Vergleich zu Kontroll-Vertiefungen.
      Hinweis: Nicht ausgestrahlt Zellen wachsen nicht in Gegenwart von Puromycin.
    6. Überprüfen Sie die Effizienz der bedingten KD in der Puromycin-resistenten HCT116 Darmkrebs und MDA-MB-231 Brustkrebszellen.
      Hinweis: Die wirksame Konzentration von Doxycyclin variiert mit der Zell-Linie verwendet und muss (in der Regel von 100 ng/mL, 2 µg/mL) titriert werden.
      1. Bestimmen Sie die Doxycyclin-Konzentration, die nicht giftig für die Zellen aber wirksam bei der Downregulating die Expression des Proteins von Interesse ist. In diesem Protokoll wurde 1 µg/mL erfolgreich eingesetzt in Vitro.
      2. Kulturzellen Sie für 72 Stunden in an- und Abwesenheit von 0,1, 1 und 2 µg/mL Doxycyclin. Überprüfen Sie die Höhe der Expression des Proteins herunterreguliert (hier, PAI-1) in der Zelle lysate durch Western blot Analyse. Vergleichen Sie HCT116 und MDA-MB-231 Zellen bedingt ShRNA, Rührei Kontrollzellen zum Ausdruck zu bringen.
  4. Vorbereitung des konditionierten Mediums
    1. Samen 1 x 106 mit Doxycyclin stabil transfizierten Zellen reguliert pLKO ShRNA enthaltenden Lentiviren in 10 cm-Gerichten.
    2. Zell-Linien in Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Medium mit 10 % Tet-freie FBS und 1 % wachsen Pen/Strep in Abwesenheit und Anwesenheit von 1 µg/mL Doxycyclin für 72 h bei 37 ° C um 5 % CO2, täglich frische Doxycyclin hinzufügen.
      Hinweis: RPMI Medium ist kompatibel mit Kulturbedingungen der Monozyten. Doxycyclin ist eine leichte sensible Verbindung. Die Zellkulturen durch abdecken mit Alufolie vor Licht schützen und arbeiten unter direkten Lichteinfall zu vermeiden.
    3. Sammeln Sie das Medium durch pipettieren, durch 0,45 µm-Filter filtern Sie und bei-80 ° C in Aliquote einfrieren.

2. Isolierung von Monozyten aus menschlichem Blut

  1. Monozyten aus dem menschlichen peripheren Blut zu isolieren.
    Hinweis: Menschliche primäre Monozyten sind isoliert von 7 mL weißer Blutkörperchen konzentriert in einem Leukozyten Filter gesunde Thrombozyten-Spender entnommen. Abhängig von der Geber produziert einen Leukozyten Filter zwischen 1 x 109 und 2 x 109 peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs), ungefähr 10 % von denen Monozyten bilden.
    1. Bereiten Sie die Arbeitsstation im Kabinett Laminar-Flow.
    2. Sterilisieren Sie Schere und die laminare Strömung Schrank mit ultraviolettem Licht (UV) für 30 Minuten.
    3. Sprühen Sie die Leukozyten-Filter mit 70 % EtOH und an der Luft trocknen innen die laminare Strömung Kabinett.
    4. Geschnitten Sie beide Enden der Leukozyten-Filter mit einer Schere und entleeren Sie den Inhalt des Filters in einer 50 mL-Tube.
    5. Verdünnen Sie bis 90 mL durch Zugabe von PBS mit 1 % (V/V) FBS (PBS/FBS).
    6. 3 x 50 mL Röhrchen mit 15 mL-Dichte-Gradienten-Lösung vorzubereiten. Schichten Sie langsam 30 mL PBS/FBS verdünnt Blut über die Dichte Gradienten Lösung mit einer Pipette-Controller auf Schwerkraft fließen gesetzt, um zu vermeiden, Mischen der Schichten.
    7. In einer Schaukel Rotor bei 400 X g bei RT ohne Bremsen für 25 min zentrifugieren.
    8. Entsorgen Sie die oberste Schicht zu und übertragen Sie die mittlere Schicht mit PBMCs zu einem frischen 50 mL-Tube.
    9. Fügen Sie PBS/FBS bis zu 50 mL und Zentrifuge bei 120 X g bei RT für 10 min. Überstands mit Thrombozyten entfernen. Wiederholen Sie diesen Schritt zwei weitere Male.
    10. Aufschwemmen Sie das Pellet in 50 mL PBS/FBS und zählen Sie die PBMCs mit einem Hemocytometer. Zentrifugieren bei 120 X g bei RT und das Pellet in PBS/FBS mit 1 mM Ethylenediaminetetraacetic Säure (EDTA) (PBS/FBS/EDTA), eine Endkonzentration von 5 x 107 Zellen/mL aufzuwirbeln.
    11. Verwenden Sie eine negative Auslese Kit, um Monozyten durch Erschöpfung der nicht-monozytären Zellen zu bereichern.
      Hinweis: Das negative Auslese-Kit verwendet einen Cocktail von Antikörpern (CD2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123 und Glycophorin A) T Zellen, NK Zellen Neutrophile, B Zellen, Granulozyten und Erythrozyten. Die Antikörper-Komplexe binden an die Oberfläche dieser nicht monozytären Zellen und Dextran Magnetpartikel. Wenn das Rohr in einem Magneten platziert wird, die Perlen halten an den Wänden des Schlauches und der nicht-monozytären Zellen aus der Projektmappe entfernen.
      1. 1 mL 5 x 107 PBMCs/mL 50 µL der Antikörper cocktail hinzufügen, mischen mit einer Pipette und inkubieren Sie für 10 min bei RT. hinzufügen 50 µL magnetische Beads, die PBMCs mit dem Antikörper cocktail mit einer Pipette mischen und weitere 10 min bei RT inkubieren
      2. Addieren Sie PBS/FBS/EDTA, 25 mL und Ort die PBMC-Mischung in einem Magneten, der eine 50 mL-Tube aufnehmen können. Inkubieren Sie für 10 min bei RT magnetischen Perlen werden halten an den Wänden des Schlauches und sequester nicht monozytären Zellen aus der Lösung.
    12. Mit einem 25-mL-Pipette, die Lösung mit Monozyten aus der Tube in den Magneten entfernen. Achten Sie auf die Seiten des Rohres mit der Pipette nicht berühren.
    13. Zentrifugieren Sie die Lösung bei 250 X g bei RT und Entfernen des Überstands Aufschwemmen der Pellet mit Monozyten in RPMI Medium mit 10 % Tet-freie FBS und 1 % Pen/Strep.

(3) Boyden Kammer Migration Assay

  1. Bereiten Sie 1 % (w/V) Rinderserumalbumin (BSA) Lösung durch Auflösen von BSA 1 g in 100 mL Reinstwasser und Filtern durch eine 0,2 µm Porengröße zu sterilisieren.
  2. Inkubieren Sie die poröse Membran-Einsätze in 1 % sterile BSA Lösung O/N für die verbesserte Einhaltung von Makrophagen die Membran. Verwenden Sie für Monozyten/Makrophagen 5-8 µm Pore Größe Einsätze.
    1. Füllen Sie eine steriles Gewebe Kulturschale mit 1 % BSA Lösung und setzen Sie die Einsätze in der Schale. Gelten Sie 200 µL 1 % BSA Lösung innerhalb der Einsätze.
  3. Waschen Sie die Einsätze zweimal, indem man sie in eine Schüssel gefüllt mit sterilen PBS und Anwendung PBS im Inneren des Filters.
  4. Seed 40.000 HCT116 oder MDA-MB-231 Zellen in 0,5 mL RPMI Medium mit 10 % Tet-freie FBS und 1 % Pen/Strep pro Bohrloch in einer 24-Well-Platte, in dreifacher Ausfertigung. Alternativ legen Sie 0,5 mL zuvor generierten konditionierten Medium in den Brunnen als Quelle der Lockstoffgradient.
  5. Am nächsten Tag legen Sie Platte 8.000 Monozyten im vorbereitet in 0,3 mL Volumen des Mediums RPMI, enthält 10 % Tet-freie FBS und 1 % Pen/Strep, in dreifacher Ausfertigung, und Inkubation bei 37 ° C um 5 % CO2.
  6. Sammeln Sie die Einsätze nach 48 h.
    Hinweis: Die Länge eines Experiments muss optimiert werden, je nach den spezifischen Bedingungen und Zellen verwendet, indem Sie ausführen eine Zeitverlauf Experiment wo sind Einsätze in unterschiedlichen Inkubationszeiten gesammelt.
    1. Schütteln Sie das überschüssige Medium und streichen Sie genau die Innenfläche mit einem Baumwoll-gespitzten Applikator Zellen zu entfernen, die nicht migriert haben.
    2. Flecken Sie auf der Außenseite der Einsätze mit der Wright Giemsa-Methode.
    3. Montieren Sie sorgfältig 3 Einsätze/Objektträger in eine hohe Viskosität Mikroskop Immersionsöl, um sicherzustellen, dass die Seite des Filters mit migrierten Makrophagen nach oben zeigt.
  7. Bild der Folien mit einem Lichtmikroskop mit 20 X Objektiv. Fotografieren Sie die 9 Felder/Filter. Zählen Sie die migrierte Makrophagen in 9 Felder/Filter.

Ergebnisse

Drei ShRNA-Sequenzen wurden für die effizienteste KD PAI-1 getestet. Hierzu wurden ShRNA Sequenzen gegen PAI-1 und Rührei (Tabelle 1) in Tet pLKO Puro Expressionsvektor nach dem oben beschriebenen Protokoll geklont. Die HT-1080 Fibrosarkom Zell-Linie war mit generierten Konstrukte stabil transfiziert und die Zellen wurden für 3 Tage mit Doxycyclin behandelt. Die Expression von PAI-1 ergab sich durch Western Blot- ()Abbildung 2A

Diskussion

Bestehend aus einer Vielzahl von Zelltypen, ist die TME entscheidend für die Entstehung von Krebs. Um optimale Wachstumsbedingungen zu ermitteln, ziehen die Krebszellen Monozyten durch Sekretion von chemotaktische Faktoren. Hier präsentieren wir ein Protokoll für das Studium des Mechanismus der Monocyte Rekrutierung von Tumor Zellen in Vitro. Zu diesem Zweck wird eine Kombination von induzierbaren gen Expressionssystems, Reinigung des primären menschlichen Monozyten und als Beispiel für eine Migration Assay...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Danksagungen

Die Autoren möchten Jacqueline Rosenberg für Korrekturlesen Manuskript anerkennen. Diese Arbeit wurde unterstützt durch das US Department of Health And Human Services/National Institutes of Health mit einem Zuschuss zu YA DeClerck (gewähren 5R01 CA 129377) und der TJ Martell Foundation. MH Kubala ist der Empfänger eines Research Karriere Entwicklung Fellowship Award des Saban Research Institute am Kinder Hospital Los Angeles.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Tet-pLKO-puro lentiviral vectorAddgene21915
FBS (Tetracycline-free)Omega ScientificFB-15
HistopaqueSigma10771-500ML
EasySep Human Monocyte Enrichment KitStemCell19059
EasySep MagnetStemCell18002
EcoRI HFNEBR3101S
AgeI HFNEBR3552S
Cut Smart bufferNEBB7200S
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362
PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup SystemPROMEGAA9281
psPAX vectorAddgene12260
pMD2.G vectorAddgene12259
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coliThermo Fisher ScientificC737303
Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stainProtocol123-869
HEK293 cellsATCCCRL-1573
PBSCorning21-031-CV
XhoI restriction enzymeNEBR0146S
LigaseNEBM0202S
Ligase bufferNEBM0202S
EDTA 0.5 M solutionThermo Fisher ScientificR1021
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
The Big Easy" EasySep MagnetStem Cell18001
0.1% Poly-L-Lysine solutionSigma-AldrichP8920
Sodium AcetateSigma-AldrichS7670
Sodium butyrateSigma-AldrichB5887
0.45 μM syringe filtersVWR International28145-479
NaOHSigma-AldrichS5881-500g
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)Invitrogen15504-020
Sodium Chloride(NaCl)Sigma-AldrichS7653-5 kg
Magnesium Chloride (MgCl2)Sigma-AldrichM8266-100g
dithioerythritol (DTE)Sigma-AldrichB8255-5g
ethanol (EtOH)Sigma-Aldrich792780
tryptoneAmrescoJ859-500g
yeast extractFluka70161-500g
Bacto agarBD214010
ampicillinSigma-AldrichA9393-5g
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Corning10-013-CV
phosphate-buffered saline (PBS)Corning21-031-CV
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Sigma-AldrichH3375
puromycinSigma-AldrichP9620
Doxycycline hyclateSigma-AldrichD9891-25g
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)Corning10-040-CV
0.5 M EDTA pH 8.0Thermo Fisher ScientificR1021
Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET MembraneBecton Dickinson353097
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA7906
Cotton-Tipped Applicator MedlineMDS202000
Protocol Hema 3 STAT pack Fisher Scientific Company123-869
Resolve Immersion Oil, High ViscosityRichard Allan ScientificM4004
Penicillin StreptomycinGibco15140122

Referenzen

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