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요약

이 프로토콜 공부 monocytes/세포 종양 microenvironment에의 채용에 있는 종양 세포 유래 단백질의 역할에 대 한 특히 암 세포 선 및 그것의 사용, 기능 Tet에 시스템 설정에 대 한 방식으로 제공 합니다.

초록

siRNA 및 유전자 발현 조절의 (KD) 방법 아래로 노크 shRNA 중재 유전자와 단백질의 기능을 이해 하기 위한 귀중 한 도구가 있습니다. 그러나,이 관심사의 단백질의 KD 세포에 치명적인 효과가 나는 KD의 기대 효과 경우에서 시간 종속, 무조건 KD 방법 적절 한 하지 않습니다. 조건부 시스템은 이러한 경우에 더 적합 하 고 많은 관심의 대상이 되고있다. 이러한 Ecdysone 유도할 수 있는 overexpression 시스템, 시 토 크롬 P-450 유도 시스템1를 포함 하 고 있는 항생물질 규제 유전자 식 시스템.

항생물질 통제 유전자 식 시스템 항생물질 존재 shRNA 식의 유도 의해 단백질 표정 가역 제어할을 수 있습니다. 이 프로토콜에서 우리는 유전자 발현의 조건부 규칙에 대 한 인간 암 세포 라인에 기능 Tet에 시스템을 사용 하 여 실험 설계를 제시. 우리는 다음 종양 세포 monocyte 상호 작용의 연구에서이 시스템의 사용을 보여 줍니다.

서문

홍보 함으로써 종양 개발에 기여 하는 관련 된 종양 세포 (Tam) 종양의 성장, 전이, 그리고 면역 반응2를 조절. 암 세포 모집 염증 monocytes, 종양 침투 하 고 프로 tumorigenic Tam3으로 차별화. Tam와 종양의 침투 빈약한 임상 결과와 상관 관계가 고 대 식 세포4,5의 면역 역할에 연결 되었습니다. 그러나, 대 식 세포는 종양의 채용의 메커니즘은 잘 탐험 하지 고 참여 통로의 더 나은 이해 하는 것은 더 유망한 요법 분야의 발전을 위한 중요 한. 종양 세포와 정상 세포에서 종양 microenvironment (TME) 간의 상호 작용을 공부 하 고 있는 과제 중 하나입니다 메커니즘 및 셀 요구는 크로스 토크의 해 부를 허용 하는 체 외에서 접근, 참여의 복잡성. 여기 우리는 암 세포 유래의 paracrine 효과, 대 식 세포, 생체 외에서처럼 다른 세포 유형의 마이그레이션에 분 비 단백질 연구에 적용할 수 있는 다양 한 방법론을 제시. ShRNA는 암 세포 유래 단백질에에서 관여 monocytes의 채용에 대 한의 식을 항생물질 유도할 수 있는 발기인의 통제는 시스템에 사용 하 여, monocytes에 secreted 단백질의 paracrine 효과 quantitated 이다. 이 프로토콜, 안정 암 세포 라인의 세대 뒤 규제 벡터 제시 항생물질 shRNA 시퀀스의 복제. 또한, 기본 인간 monocytes 그리고 Boyden 챔버 분석 결과의 정화는 monocytes의 마이그레이션에는 암 세포 파생 된 단백질의 paracrine 효과 분석 하는 데 사용 됩니다.

단백질 코딩 유전자의 Downregulation 일반적으로 비록 그것의 사용에 제한 없이 siRNA와 shRNA 기술로 적용 됩니다. 유전자의 장기 노크 다운 (KD) 실험 결과 방해 하는 셀의 보조 적응 반응 유도 수 있습니다. 일시적인 유전자 발현 제어의 부족 하면 시간 또는 세포 생존을 위해 중요 한 단백질의 역할은 단백질의 동적 역할을 연구 하는 도전 수 있습니다. 이 문제는 설정 비보에 ,에서 특히 중요 한 종양 개발 및 진행에 단백질의 역할이 종양 설립 후에 관심사의 단백질의 표현의 downregulation를 필요할 수 있습니다. 조건부 KD 방지는 너무 치명적인 효과 KD의 셀에 고 무조건 KD 종양 개발의 부족 귀 착될 수 있었다 하는 동안 종양 성장의 다른 단계에서 단백질의 역할의 분석을 가능 하의 이점이 있다.

다양 한 조건부 KD 시스템 안정적인 KD의 한계를 해결 하기 위해 개발 되었습니다. 조건부 유전자 표정 시스템 포함 Ecdysone 유도할 수 있는 overexpression 시스템, 시 토 크롬 P-450 유도 시스템1, 그리고 항생물질 규제 유전자 식 시스템. 항생물질 통제 유전자 표정 시스템 항생제 항생물질 (또는 그것의 보다 안정적인 아날로그-doxycycline)의 추가 따라 shRNA의 표현 제어할을 수 있습니다. Tet-켜 짐 시스템 shRNA 표현의 항생물질/doxycycline KD, 유전자 발현의 결과로 존재 유도 된다 Tet 오프 시스템에 shRNA 표현의 항생물질 인 유전자 발현의 억제. 항생물질을 유도할 수 있는 시스템의 결점은 이전에 보고 된 저급 shRNA doxycycline-소위 시키는6,7의 부재에서의 표현의. Tet에 시스템 여기에 설명 된, 항생물질의 관리에 따라 관심의 shRNA의 발기인 영역이 H1 내 Tet 응답 요소 (TRE) 시퀀스에 constitutively 표현된 항생물질 진압 (TetR) 단백질 바인딩 표시 되지 않습니다. ShRNA 표현과 저해 항생물질 종속 방식으로8,9에 관심사의 단백질의 번역의 결과.

다른 사용 가능한 Tet-켜 짐 시스템 포함 동시 노크-TetO 시퀀스 및 TATA 상자와 전사 TATA 상자 및 인접 시퀀스 요소 (PSE) 사이의 시작 찬 외에 의해 개발 된 사이트의. 그러나 10 이 시스템 shRNA 식,, 비 유도 된 상태에서 규제 하는 항생물질의 유독한 복용량의 낮은 수준 shRNA 보다 적게 표현 됩니다 필요 합니다. Krüppel 관련 상자 (리아) 기반 Tet-켜 짐 시스템11 리아를, 과목 유전자 transcriptional 억제 하 리아 바인딩 사이트의 3 kb 범위 내에 있는 아연 손가락 단백질을 포함 한다. 공상 단백질 tTRKRAB TetO, 바인딩할 수 및 큰-DNA 제어 용량 범위, 때문 TetO 할 하지 필요 전사 사이 제한 시작 사이트 및 발기인 고 낮은 충격 발기인의 활동에. 유발 되지 않은 상태에서이 제어 RNA 간섭 시스템 shRNA11,12;의 유출 된 식의 하위 수준 표시를 보고 되었다 그러나, 그것은 연속, 2-벡터 복제 접근을 필요로 한다. 이전 개발된 조건부 KD 시스템 overexpression 시스템 Ecdysone 유도할 수 있는 등 시 토 크롬 P-450 유도 시스템에 비해 항생물질 규제 시스템의 견고성 및 가역, 장점이 이며 따라서 가장은 일상적으로 시스템13사용. 이 프로토콜에 사용 되는 시스템은 듀얼 TetO 노크에서 시스템 및 리아 Tet-켜 짐 시스템의 이점을 정직, 단일 벡터 클로닝, 여러 클론의 빠른 생성을 허용을 요구 하 고 그것은 전시에 시키는의 매우 낮은 수준으로는 doxycycline의 부재입니다.

TME 암 개발에 대 한 중요 하다입니다. 종양의 성장을 촉진 하기 위하여 암 세포 염증 monocytes 혈 단백질을 은닉 하 여 모집 합니다. 모집된 monocytes 종양 침투 하 고 종양 성장 및 전이에 기여 하는 프로 tumorigenic Tam으로 차별화 합니다. 면역 세포 신규 모집의 생체 외에서 연구 활용 마이그레이션 분석 실험, Boyden 챔버 시험 되 고 널리 사용14,15,,1617. 이 분석 결과에서 chemoattractant 단백질 소스, 예를 들어 암 세포, 또는 순화 된 단백질은 아래쪽 챔버에 배치 됩니다. 면역 세포는 아래쪽 구획에서 다공성 막으로 분리 된 상단 챔버에 배치 됩니다. 셀의 chemoattractant, 그리고 그는 막의 더 낮은 측에 발견 증가 그라데이션으로 마이그레이션 스테인드 고 현미경 계산. 여기 우리가 테스트 플라스 미노 겐 활성 제 억제 물 1 (파이-1)의 chemoattractant 함수에 monocytes 파이-1의 표현 doxycycline 추가 의해 통제 된다 안정, 유도할 수 있는 암 세포 라인을 생성 하 여. 우리는 monocyte 마이그레이션에서 파이-1의 역할을 평가 하기 위해 Boyden 챔버 마이그레이션 분석 결과에서 인간의 기본 monocytes를 사용 합니다. 인간의 기본 monocytes 그리고 THP1 같은 널리 사용 되는 monocytic 셀 라인의 차이점 보고 되었습니다 및 다른 cytokine 표현 패턴18; 포함 예를 들어 THP1 세포에서 TNF-α 식 수준에 5-10 배 증가 인간 monocytes19에 비해. THP1 셀 인간의 백혈병 monocytic 세포에서 파생 됩니다, 그리고 쉽게 유지, 평균 19-50 h20의 시간을 두 배로 증식 하는. 그와 반대로, 인간 monocytes 성장 요인의 부재에는 짧은 수명이 특징입니다. Monocytes는 가변성의 상당량 발생는 개인 중 고 정화 방법에 따라 기증자의 혈액에서 정화 이후 다른 세포 유형으로 오염 발생할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 기본 monocytes 관련 되며 기본 monocytes를 사용 하 여 생물학 연구19에서 monocytic 셀 라인으로 얻은 결과 확인 또는 사용 권장 되었습니다. 여기는 말 초 혈액에서 인간의 기본 monocytes의 정화에 대 한 프로토콜에 설명합니다. Monocyte 정화의 다른 방법 밀도 그라데이션 및 접착 프로토콜 및 단일 그라디언트 Ficoll-Hypaque Percoll 그라데이션21다음의 2 단계 절차를 포함 됩니다. 70-90% 사이 그 방법 범위에 의해 얻은 monocyte 인구의 순도. 여기 설명 하는 방법을 뒤에는 부정적인 면역 선택22 밀도 그라디언트를 사용 하 여 및 수 있습니다 항 체와 직접 접촉 하지 않고 인간 monocytes의 정화 함으로써 그들의 우발적인 활성화를 방지 하 고 발생 하는 > monocytes의 95% 순수 인구입니다.

여기에 제시 된 프로토콜 암 파생 secreted 단백질의 파이 1 monocytes에 chemoattractant 효과 연구를 유전자 발현 KD 인간 암 세포 라인에 대 한 기능 Tet에 시스템 설정에 사용 됩니다. 파이-1 다양 한 종양에 의해 overexpressed와 식을 역설적으로 가난한 임상 결과23,24상관. 파이-1의 프로 tumorigenic 역할의 프로-신생의 결과 이며, 안티-apoptotic 기능25,26. 파이-1 세포 염증27의 사이트에 모집을 홍보 하 여 염증에 기여할 표시 되었습니다. 파이-1 부드러운 근육 cellmigration,2829 를 조성 하 고 맥 1 종속 macrophage 마이그레이션30에 참여를 표시 했다. 파이 1 overexpression 또한 크게 B16F10 흑색 종 종양31에 Raw 264.7 세포의 모집을 향상 시키기 위해 표시 되었습니다. 그러나, TAM 마이그레이션에서 파이-1의 역할 자세히 조사 하지는. 우리는 파이-1 암 세포에 monocytes를 유치 하는 여부의 질문에 대답을 설명 된 프로토콜을 사용 합니다. 이 방법론 암 세포에서 secreted 단백질을 침묵 하 고는 TME의 구성 요소를 분석 하 여 종양과 TME 사이 누화의 해 부를 수 있습니다.

프로토콜

건강 한 지원자에서 얻은 인간 monocytes를 사용 하 여 프로토콜 섹션 아동 병원 로스 앤젤레스 인간의 연구 윤리 위원회의 지침을 따릅니다 및 인간의 재료 아래 기관 검토 위원회에 의해 승인 되었습니다. 프로토콜 번호: CCI 08 00208.

1. 암 세포 라인 항생물질 규제 shRNA 식의 준비

  1. ShRNA Tet pLKO 순수 하지 않아 벡터에 파이-1의 복제 8 , 9
    1. ShRNA 올리고 나이어 에코리 분열 5' 끝, 감각 시퀀스, 6 뉴클레오티드 루프 센스 순서에 사이트를 포함 하는 디자인.
      참고: 일반적인 oligonucleotides 설계 되었습니다 다음과 같습니다: 앞으로 올리고: 5' CCGG-19-21 혈압 감지-CTCGAG-19-21 혈압 antisense-TTTTT, 역방향 올리고: 5' AATTAAAAA-19-21 혈압 감지-CTCGAG-19-21 혈압 antisense 3'. 올리고 머 디자인에 대 한 자세한 프로토콜 8에서 찾을 수 있습니다. 이 연구에서는 3 shRNA 시퀀스 파이-1에 대 한 강한 입을 효과 대 한 테스트 되었습니다: shRNA 132, shRNA 2, shRNA 333및 스크램블된33 표 1에 포함 됩니다.
    2. ShRNA 올리고 anneal와 뒤섞여 shRNA 올리고.
      1. 물에 100 µ m oligonucleotides를 다시 구성 하 고 믹스 1 µ L 앞으로 oligonucleotide, 1 µ L 역 oligonucleotide 8 µ L H2o.
      2. oligonucleotides anneal, 다음 믹스: 1 µ L oligonucleotide 혼합물, 5 µ L 버퍼 10 mM Tris (hydroxymethyl) aminomethane (Tris) pH 7.5, 50 m 염화 나트륨 (NaCl), 10 m m m 염화 마그네슘 (MgCl2), 1 m m dithioerythritol (DTE) 및 44 µ H L 2 O.
      3. 5 분 동안 95 ° C에 중 합 효소 연쇄 반응 (PCR) 열 cycler에 있는 혼합물을 품 어, 악기, 떨어져 전환 하 고 실내 온도 (RT)에를 때까지 기다립니다.
    3. 5 µ L 3 M 아세트산 나트륨 pH 5.2 ~ 50 µ L 단련 oligonucleotides 추가 하 여 단련된 oligonucleotides 침전.
      1. 100 µ L 감기 100% 에탄올 (EtOH)를 추가 하 고-80 ° c.에 30 분 동안 품 어 4 ° c.에 30 분 동안 최대 속도로 벤치탑 원심 분리기에 원심
      2. 상쾌한을 제거, 추가 500 µ L 찬 70 %EtOH, 30 분 동안 원심 분리기 상쾌한, 제거 하 고 20 µ L H2o. 펠 릿을 녹
      3. 분 광 광도 법, 260에서 흡 광도 측정 하 여 단련된 oligonucleotides의 농도 평가 nm. Oligonucleotides 1 ng / µ L의 최종 농도에 희석.
    4. Luria Bertani (파운드) 매체와 파운드 한 천 배지 준비 합니다.
      1. LB 매체, 디졸브 10 g tryptone 5 g 효 모 추출 물, 10 g 물 1 L에 NaCl. PH 7.0 1를 사용 하 여 매체의 pH 조정 N NaOH와 오토 클레이 브.
      2. 파운드 한 천 배지, 파운드 매체에의 한 천 15 g/L를 추가 합니다. 오토 클레이 브와 멋진 약 50 ° c.까지 항생제를 추가 하 고 접시를 붓는 다.
    5. Tet pLKO 순수 하지 않아 벡터와 불리고 박테리아 행진 ( 테이블의 자료를 참조 하는) 파운드에 한 천 배지 100 µ g/mL 암 피 실린 보충 하 고 밤새 품 어 (O/N) 37 ° c.에
    6. 100 mL 파운드 매체 100 µ g/mL 암 피 실린 (LB/암 피 실린) 접시에서 1 식민지와 보충 접종 및 O/N 37 ° c.에 떨고 함께 성장
    7. IsolateTet-pLKO-순수 하지 않아 플라스 미드 분리 키트를 사용 하 여 100 mL 세균성 문화에서.
    8. 다음과 같이 AgeI 및 EcoRI 금지 효소로 Tet pLKO 순수 하지 않아 벡터에 대 한 제한 반응 준비: 1 µ L EcoRI, 1 µ L AgeI, 5 µ L 10 x 버퍼, 1 µ L 플라스 미드 DNA (1 µ g), 42 µ H L2h 37 ° c.에 오 품 어 1 쪼개진된 벡터의 충분히 얻을, 최대 5 x 50 µ L 반응 준비.
    9. 1 %agarose 젤을 사용 하 여 DNA 정제 키트를 사용 하 여 agarose 젤에서 쪼개진된 벡터를 정화. DNA의 수율을 높이기 위해 큰 우물 agarose 젤 빗을 사용 하 여 및 신중 하 게 메스를 사용 하 여 밴드에서는 agarose의 대부분을 제거 하 여 agarose 젤에서 DNA 비율을 최소화 합니다.
    10. 결 찰 반응 믹스를 다음과 같이 준비: 1 ng 단련 oligonucleotides, 50 ng 쪼개진된 벡터, 2 µ L 10 x 리가 버퍼, 1 µ L 리가, 및 최대 20 µ L. 물 선 16 단련된 shRNA oligonucleotides 벡터 ° C O/명.
      1. 또한, oligonucleotides 거짓 긍정적인 식민지 귀 착될 것 이다 uncleaved, 부분적으로 쪼개진, 그리고 자기 합자 벡터에 대 한 계정 없이 부정적인 제어 반응 준비.
    11. 표준 변환 기술을 사용 하 여, 직접 포함 lentiviral 벡터의 동종 재결합을 방지 하기 위해 설계 된 화학적으로 유능한 세균성 세포로 변환 결 찰 혼합물을 반복 합니다.
    12. 암 피 실린 O/N 37 ° c.에 접시에 박테리아를 성장
      참고: 위성 식민지의 성장을 발생, 전이 반복 하 고 성장을 감속 하 고 이렇게 방지 위성 식민지를 30 ° C에서 박테리아 성장.
    13. 성공적인 결 찰을 확인 하려면 선택 10-20 단 하나 식민지, 접종 2 mL LB/암 피 실린 문화와 암 피 실린 플레이트 사이 주식 접시로 (나중에 사용 될 긍정적인 클론으로)을. O/N 37 ° c.에 떨고 액체 문화를 성장 플레이트 O/N 37 ° c.에 품 어
    14. Parafilm와 6 ° c.에 게 접시를 봉인
    15. 플라스 미드 DNA 플라스 미드 분리 키트를 사용 하 여 액체 문화에서 분리.
    16. 암 피 실린 내성 식민지 XhoI 효소를 사용 하 여 격리 하는 플라스 미드 DNA의 제한 분석을 수행 합니다. 각 복제본에 대 한 준비 다음 반응 혼합: 0.5 µ L XhoI, 2.5 µ L 10 x 버퍼, 1 µ L 플라스 미드 DNA (0.5 µ g), 그리고 21 µ H L2오 품 37 ° c.에서 1 h 1 %agarose 젤에 반응을 실행 하 여 제한 반응의 결과 분석 합니다.
      참고: XhoI에 의해 죽 습 WT 벡터의 제한 분석 3 조각이 생성 됩니다: 8,447, 1800, 및 200 bp. 1800의 Tet pLKO 순수 하지 않아 벡터에 투표자 시퀀스 bp가 긍정적인 클론 shRNA-파이-1와 XhoI 다이제스트 크기의 DNA 파편 귀 착될 것 이다: 8,447, 190, 및 130 bp. 그림 1에서 보듯이 2000 bp 조각에서에서 찾을 수 없는 DNA 암 피 실린 내성 식민지에서 분리: 3, 8, 및 11. Oligonucleotides의 디자인에 따라 길이 긍정적인 식민지에서 DNA에서 얻은 조각 수는 달라질 수 있습니다.
    17. 연속8,9Tet pLKO 순수 하지 않아 벡터에 shRNA 시퀀스의 적절 한 삽입을 확인 합니다.
    18. 100 mL LB/암 피 실린 문화 정확한 복제를 포함 하는 식민지와 inoculate 및 O/N 37 ° c.에 성장
    19. 플라스 미드 DNA 플라스 미드 분리 키트를 사용 하 여 격리 합니다.
  2. Lentivirus 입자의 세대입니다.
    1. 15 cm 조직 문화 접시 코트 폴 리-L-리 신 접시의 표면에 0.01%의 살 균 물 솔루션을 취재 하 여 폴 리-L-리 신 15 분에 대 한 실시간에 잠복기 포부에 의해 솔루션 제거와 요리를 건조.
    2. 씨앗 5 x 106 인간 미 발달 신장 293 세포 15 cm 폴 리-L-리 신-코팅 접시에 (HEK293) 세포와 문화 Dulbecco의 수정이 글의 중간 (DMEM) 매체에 보충 10 %FBS 1% 페니실린/스 믹스 (펜/Strep) 37 ° C, 5 %CO 2 70 %confluency 도달할 때까지.
    3. 바이러스 성 입자를 생성 하려면 transfect HEK293 세포와 25 µ g pLKO-Tet-에-shRNA, 25 µ g psPAX, (포장 플라스 미드), 5 µ g pMD2.G 플라스 미드 (봉투 표현 플라스 미드) transfection 시 약을 사용 하 여.
      참고: psPAX 및 pMD2.G 플라스 미드는 디디에 Trono 연구소 (Ecole Polytechnique Federale 드 로잔, 스위스)에서 선물.
    4. 10 m m 나트륨 낙 산 염 및 20 mM HEPES ph 7.2, 및 8 h에 대 한 자란 보충 DMEM 매체 변경 하 여 다음 날 HEK293 세포 유도.
    5. 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS)와 셀을 세척 하 고 신선한 DMEM 매체 포함 20 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES) pH 7.2의 25 mL를 추가. 48 h에 대 한 37 ° C에 외피, 후 신중 하 게 pipetting;에 의해 바이러스를 포함 하는 매체를 수집 유출을 하지 마십시오.
    6. HEK293 세포를 제거 하는 0.45 μ M 주사기 필터를 통해 수집 된 매체를 필터링 합니다. 바이러스 성 입자를 포함 하는 매체는 즉시 사용 하거나 나중에 사용-80 ° C에서 저장 수 있습니다.
  3. 안정적으로 transfected 세포의 생성
    1. HCT116 결 장 암 세포 및 세포/잘 DMEM 매체 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)와 1% 보충에 50000에서 MDA-MB-231 유방암 세포 씨 펜/Strep 12-잘 접시에. 세포는 60-70% 합칠 때까지 5% CO2 에서 37 ° C에서 품 어.
    2. PBS로 세포 세척 하 고 포함 하는 바이러스의 1 mL을 추가 중간 암 세포와 O/N 5% CO2에서 37 ° C에서 품 어. 컨트롤 추가 10 %FBS 1% 보충 하는 신선한 DMEM 매체의 1 mL 펜/Strep 암 세포와 함께 2 웰 스.
    3. 조심 스럽게 포부에 의해 매체를 포함 하는 바이러스를 제거. PBS로 세포 세척 하 고 매체를 변경 DMEM 10% (v/v) 항생물질 무료 (Tet 무료) FBS와 1% 펜/Strep.
    4. 72 h 후 PBS로 세포 세척 하 고 10 %DMEM 매체 변경 Tet 무료 FBS 1% 펜/Strep, 1 µ g/mL puromycin 바이러스 페 셀 선택 영역에 대 한.
      1. 셀 라인 사용에 따라 비 불리고 셀에 puromycin 농도 (0.1, 0.5, 1, 2, 및 5 µ g/mL)의 범위를 테스트 하 고 제어 셀 생존 최저 농도 선택 하 여 최적의 선택 위한 puromycin 농도 조정 문화의 3 일 후
    5. 3-14 일 동안 puromycin 존재는 세포를 배양 하 여 바이러스 불리고 셀을 선택 합니다. 컨트롤 puromycin 그리고 puromycin 없이 하나를 포함 하는 매체와 하나 비 불리고 세포와 2 개의 추가적인 우물을 준비 합니다. 제어 우물에 비해 바이러스 불리고 세포와 세포의 부분 살인 puromycin 우물에 의해 관찰 합니다.
      참고: 비 불리고 셀 puromycin 존재는 성장 하지 않습니다.
    6. Puromycin 저항 HCT116 결 장 암과 유방암 세포 MDA-MB-231에서 조건부 KD의 효율성을 확인 합니다.
      참고: doxycycline의 효과적인 농도 사용 세포 선으로 변화할 것 이다 하 고 (2 µ g/mL를 100 ng/mL)에서 일반적으로 적정 해야 합니다.
      1. 셀에 대 한 독성 아니라 downregulating 관심사의 단백질의 표현에에서 효과적인 doxycycline 농도 결정 합니다. 이 프로토콜에 1 µ g/mL는 성공적으로 사용 된 생체 외에서했다.
      2. 존재와 부재의 0.1, 1, 및 2 µ g/mL doxycycline 72 h에 대 한 셀을 문화. 표현의 downregulated 단백질의 수준을 확인 (여기, 파이-1) 서 부에 의해 세포 lysate에서 오 점 분석. ShRNA 스크램블된 제어 셀에 조건에 따라 표현 HCT116와 MDA-MB-231 셀을 비교 합니다.
  4. 조건 화 된 매체의 준비
    1. 안정적으로 doxycycline와 페 셀의 씨앗 1 x 106 10 cm 요리에서 pLKO shRNA 포함 lentiviruses 통제.
    2. 10% FBS Tet 무료와 1% 로스웰 파크 기념 연구소 (RPMI) 중간에 셀 라인 성장 펜/연쇄 상 부재와 1 µ g/mL doxycycline 5% CO2, 37 ℃에서 72 h의 존재에 매일 신선한 doxycycline 추가.
      참고: RPMI 매체 문화 조건 monocytes의와 호환 됩니다. Doxycycline는 가벼운 과민 한 화합물 이다. 알루미늄 호 일로 덮 음에 의해 빛에서 셀 문화를 보호 하 고 직접 가벼운 노출에서 작업 하지 마십시오.
    3. Pipetting으로 매체를 수집, 0.45 μ m 필터를 통해 필터링 하 고 aliquots에-80 ℃에서 동결.

2입니다. 인간의 혈액에서 Monocytes의 격리

  1. Monocytes 인간 주변 혈액에서 분리.
    참고: 인간의 기본 monocytes 건강 한 혈소판 기증자 로부터 얻은 백혈구 필터에 집중 되어 백혈구의 7 mL에서 격리 됩니다. 기증자, 따라 한 백혈구 필터 1 x 109 와 2 x 109 말 초 혈액 단 세포 (PBMCs), 약 10%는의 구성 monocytes의 생성 합니다.
    1. 층 류 캐비닛에서 워크스테이션을 준비 합니다.
    2. 가 위 및 층 류 캐비닛 자외선 (UV) 30 분에 대 한 소독.
    3. 70% EtOH air-dry 내부와 백혈구 필터 스프레이 층 류 캐비닛.
    4. 가 위로 백혈구 필터의 양쪽 끝을 잘라내어 50 mL 튜브 필터의 내용을 비어.
    5. 추가 PBS 1% (v/v) FBS (PBS/FBS)를 포함 하 여 90 mL에 희석.
    6. 15 mL 밀도 그라데이션 솔루션 3 x 50 mL 튜브를 준비 합니다. 피 펫 컨트롤러를 사용 하 여 그라데이션 솔루션 레이어 혼합 방지 중력 흐름에 준비가 밀도에 천천히 30 mL PBS/FBS 희석 혈액의 레이어.
    7. 25 분을 위한 브레이크 없이 RT에서 400 x g에서 스윙으로 터에서 원심.
    8. 상위 레이어를 처분 하 고 신선한 50 mL 튜브에 PBMCs를 포함 하는 중간 계층을 전송.
    9. PBS/FBS 50 mL와 10 분에 대 한 RT에서 120 x g에서 원심 분리기 제거 혈소판을 포함 하는 상쾌한 추가 합니다. 두 번 이상이 단계를 반복 합니다.
    10. 50 ml PBS/FBS의 펠 릿을 resuspend과 PBMCs는 hemocytometer를 사용 하 여. RT에서 120 x g에서 centrifuge 고 PBS/FBS 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (PBS/FBS/EDTA) 5 x 107 셀/mL의 최종 농도를 포함 하는 펠 릿을 resuspend.
    11. 부정적인 선택 키트를 사용 하 여 비 monocytic 세포의 고갈으로 monocytes를 풍부 하 게.
      주: 부정적인 선택 키트 T 세포, NK 세포, 호 중구, B 세포, granulocytes, 및 적혈구에 대하여 항 체 (c d 2, CD3, CD16, CD19, CD20, CD56, CD66b, CD123, 및 glycophorin A)의 칵테일을 사용합니다. 항 체 복합물이 아닌 monocytic 세포의 표면에 고 dextran 자석 입자에 바인딩합니다. 튜브는 자석에 놓으면 구슬 튜브의 벽에 고착 하 고 솔루션에서 비 monocytic 셀을 제거 합니다.
      1. 5 x 107 PBMCs/mL의 1 mL를 50 µ L 항 체 칵테일을 추가, 피 펫, 혼합 및 실시간 추가 50 µ L 자석 구슬 칵테일 항 체와 PBMCs에서 10 분 동안 품 어, 피 펫, 혼합 및 실시간에서 또 다른 10 분 동안 품 어
      2. 25 mL 및 50 mL 튜브를 수용할 수 있는 자석에서 PBMC 섞어 배치 PBS/FBS/EDTA를 합계 한다. 실시간 자기 구슬 튜브의 벽에 준수 하 고 격리 솔루션에서 비 monocytic 세포에서 10 분 동안 품 어.
    12. 25 mL 피 펫을 사용 하 여, 자석에 튜브에서 monocytes를 포함 하는 솔루션을 제거 합니다. 피펫으로와 튜브의 측면을 만지지를 주의 해야 합니다.
    13. RT에서 250 x g에서 솔루션 원심, 상쾌한를 제거 하 고 10% FBS Tet 무료 및 1% 포함 된 RPMI 매체에 monocytes를 포함 하는 펠 릿 resuspend 펜/Strep.

3. Boyden 챔버 마이그레이션 분석 결과

  1. 초순 수 100ml에 BSA의 1 g을 용 해 하 여 1% (w/v) 소 혈 청 알 부 민 (BSA) 솔루션을 준비 하 고 소독 0.2 µ m 기 공 크기를 통해 필터링.
  2. 1% 살 균 BSA 솔루션 O/N 향상 된 준수 대 식 세포의 막의 다공성 막 삽입을 품 어. Monocytes/대 식 세포, 5-8 µ m 기 공 크기 삽입 사용 하 여.
    1. 1 %BSA 솔루션 무 균 조직 문화 접시와 접시에 삽입을 배치. 삽입 내부 200 µ L 1 %BSA 솔루션을 적용 합니다.
  3. 두 번 살 균 PBS와 필터 내부 적용 PBS 가득 접시에 그들을 배치 하 여 삽입을 세척.
  4. 10% FBS Tet 무료 및 1% 포함 된 0.5 mL RPMI 매체에 40000 HCT116 또는 MDA-MB-231 셀 씨 펜/Strep 잘, 3 중에는 24-잘 접시에서 당. 또는, chemoattractant의 근원으로 우물에서 이전에 생성 된 조건된 매체의 0.5 mL 장소.
  5. 다음 날에는 준비에서 접시 8000 monocytes 10% FBS Tet 무료 및 1% 포함 된 RPMI 매체의 0.3 mL 볼륨에 삽입 펜/연쇄 상, 3 중, 5% CO2에서 37 ° C에서 품 어와.
  6. 48 h 후 삽입을 수집 합니다.
    참고: 실험의 길이 셀 삽입 다른 보육 시간에 수집 됩니다 시간 과정 실험을 수행 하 여 사용 하 고 특정 조건에 따라 최적화 해야 합니다.
    1. 초과 매체에서 흔들어과 정확 하 게 마이그레이션되지 않은 세포를 제거 하 면 밀고 주걱으로 안쪽 표면을 슬쩍.
    2. 라이트-Giemsa 메서드를 사용 하 여 삽입의 외부 측면 얼룩.
    3. 신중 하 게 확인 마이그레이션된 세포와 필터의 측 직면 하 고 높은 점도 현미경 침수 기름에 3 삽입/유리 슬라이드를 탑재 합니다.
  7. 20 X 목표는 가벼운 현미경을 사용 하 여 슬라이드 이미지. 9 필드/필터의 사진을 찍을. 9 필드/필터에 마이그레이션된 세포를 계산 합니다.

결과

3 shRNA 시퀀스에 대 한 가장 효율적인 KD의 파이-1 테스트 되었습니다. 이 위해, 파이 1과 스크램블된 (표 1)에 대 한 shRNA 시퀀스 Tet pLKO 순수 하지 않아 식 벡터 프로토콜 위에서 설명한 다음에 복제 되었다. HT 1080 fibrosarcoma 셀 라인은 안정적으로 생성 된 구문 페 하 고 세포는 3 일 동안 doxycycline로 치료 했다. 파이-1의 식 서 부 (그림 2A

토론

다양 한 종류의 세포로 구성은 TME 암 개발에 대 한 결정적 이다. 최적의 성장 조건 확인, 암 세포는 monocytes 혈 요인의 분 비를 통해 유치. 여기 선물이 종양 세포에서 생체 외에서의해 monocyte 모집의 메커니즘을 공부에 대 한 프로토콜. 이 위해 유도할 수 있는 유전자 표현 시스템, 기본 인간 monocytes 그리고 마이그레이션 분석 결과, Boyden 챔버 분석 결과의 예를 들어 정화의 조합이 사용 됩니다...

공개

저자는 공개 없다.

감사의 말

저자는 원고를 교정에 대 한 재클린 로젠버그를 인정 하 고 싶습니다. 이 작품은 미국 부의 보건 및 인적 서비스/국립 보건원 DeClerck에 부여와에 의해 지원 되었다 (5R01 CA 129377 부여)와 TJ 마르텔 재단. MH Kubala의 Saban 연구소 어린이 병원의 로스 앤젤레스에서 연구 경력 개발 장학금 상 받는 사람입니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
Tet-pLKO-puro lentiviral vectorAddgene21915
FBS (Tetracycline-free)Omega ScientificFB-15
HistopaqueSigma10771-500ML
EasySep Human Monocyte Enrichment KitStemCell19059
EasySep MagnetStemCell18002
EcoRI HFNEBR3101S
AgeI HFNEBR3552S
Cut Smart bufferNEBB7200S
EndoFree Plasmid Maxi KitQiagen12362
PROMEGA Wizard SV Gel and PCR Cleanup SystemPROMEGAA9281
psPAX vectorAddgene12260
pMD2.G vectorAddgene12259
One Shot Stbl3 Chemically Competent E. coliThermo Fisher ScientificC737303
Hema 3 stain set for Wright-Giemsa stainProtocol123-869
HEK293 cellsATCCCRL-1573
PBSCorning21-031-CV
XhoI restriction enzymeNEBR0146S
LigaseNEBM0202S
Ligase bufferNEBM0202S
EDTA 0.5 M solutionThermo Fisher ScientificR1021
Lipofectamine 2000Invitrogen11668019
The Big Easy" EasySep MagnetStem Cell18001
0.1% Poly-L-Lysine solutionSigma-AldrichP8920
Sodium AcetateSigma-AldrichS7670
Sodium butyrateSigma-AldrichB5887
0.45 μM syringe filtersVWR International28145-479
NaOHSigma-AldrichS5881-500g
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)Invitrogen15504-020
Sodium Chloride(NaCl)Sigma-AldrichS7653-5 kg
Magnesium Chloride (MgCl2)Sigma-AldrichM8266-100g
dithioerythritol (DTE)Sigma-AldrichB8255-5g
ethanol (EtOH)Sigma-Aldrich792780
tryptoneAmrescoJ859-500g
yeast extractFluka70161-500g
Bacto agarBD214010
ampicillinSigma-AldrichA9393-5g
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM)Corning10-013-CV
phosphate-buffered saline (PBS)Corning21-031-CV
4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)Sigma-AldrichH3375
puromycinSigma-AldrichP9620
Doxycycline hyclateSigma-AldrichD9891-25g
Roswell Park Memorial Institute (RPMI)Corning10-040-CV
0.5 M EDTA pH 8.0Thermo Fisher ScientificR1021
Falcon Permeable Support for 24 Well Plate with 8.0μm Transparent PET MembraneBecton Dickinson353097
Bovine Serum AlbuminSigma-AldrichA7906
Cotton-Tipped Applicator MedlineMDS202000
Protocol Hema 3 STAT pack Fisher Scientific Company123-869
Resolve Immersion Oil, High ViscosityRichard Allan ScientificM4004
Penicillin StreptomycinGibco15140122

참고문헌

  1. Ryding, A. D., Sharp, M. G., Mullins, J. J. Conditional transgenic technologies. J Endocrinol. 171 (1), 1-14 (2001).
  2. Mantovani, A., Marchesi, F., Malesci, A., Laghi, L., Allavena, P. Tumour-associated macrophages as treatment targets in oncology. Nat Rev Clin Oncol. , (2017).
  3. Franklin, R. A., et al. The cellular and molecular origin of tumor-associated macrophages. Science. 344 (6186), 921-925 (2014).
  4. Ruffell, B., Coussens, L. M. Macrophages and therapeutic resistance in cancer. Cancer Cell. 27 (4), 462-472 (2015).
  5. Sharma, P., Allison, J. P. The future of immune checkpoint therapy. Science. 348 (6230), 56-61 (2015).
  6. Mizuguchi, H., Hayakawa, T. Characteristics of adenovirus-mediated tetracycline-controllable expression system. Biochim Biophys Acta. 1568 (1), 21-29 (2001).
  7. Meyer-Ficca, M. L., et al. Comparative analysis of inducible expression systems in transient transfection studies. Anal Biochem. 334 (1), 9-19 (2004).
  8. Wiederschain, D., et al. Single-vector inducible lentiviral RNAi system for oncology target validation. Cell Cycle. 8 (3), 498-504 (2009).
  9. Wee, S., et al. PTEN-deficient cancers depend on PIK3CB. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (35), 13057-13062 (2008).
  10. Chen, Y., Stamatoyannopoulos, G., Song, C. Z. Down-regulation of CXCR4 by inducible small interfering RNA inhibits breast cancer cell invasion in vitro. Cancer Res. 63 (16), 4801-4804 (2003).
  11. Wiznerowicz, M., Trono, D. Conditional suppression of cellular genes: lentivirus vector-mediated drug-inducible RNA interference. J Virol. 77 (16), 8957-8961 (2003).
  12. Solari, V., et al. MYCN-dependent expression of sulfatase-2 regulates neuroblastoma cell survival. Cancer Res. 74 (21), 5999-6009 (2014).
  13. Liao, Y., Tang, L. Inducible RNAi system and its application in novel therapeutics. Crit Rev Biotechnol. 36 (4), 630-638 (2016).
  14. Chen, H. C. Boyden chamber assay. Methods Mol Biol. 294, 15-22 (2005).
  15. Jungi, T. W. Assay of chemotaxis by a reversible Boyden chamber eliminating cell detachment. Int Arch Allergy Appl Immunol. 48 (3), 341-352 (1975).
  16. Jung, H. S., et al. Monoclonal antibodies against autocrine motility factor suppress gastric cancer. Oncol Lett. 13 (6), 4925-4932 (2017).
  17. Park, H., et al. Effect of Sorbus commixta on the invasion and migration of human hepatocellular carcinoma Hep3B cells. Int J Mol Med. , (2017).
  18. Schildberger, A., Rossmanith, E., Eichhorn, T., Strassl, K., Weber, V. Monocytes, peripheral blood mononuclear cells, and THP-1 cells exhibit different cytokine expression patterns following stimulation with lipopolysaccharide. Mediators Inflamm. 2013, 697972 (2013).
  19. Heil, T. L., Volkmann, K. R., Wataha, J. C., Lockwood, P. E. Human peripheral blood monocytes versus THP-1 monocytes for in vitro biocompatibility testing of dental material components. J Oral Rehabil. 29 (5), 401-407 (2002).
  20. Tsuchiya, S., et al. Establishment and characterization of a human acute monocytic leukemia cell line (THP-1). Int J Cancer. 26 (2), 171-176 (1980).
  21. de Almeida, M. C., Silva, A. C., Barral, A., Barral Netto, M. A simple method for human peripheral blood monocyte isolation. Mem Inst Oswaldo Cruz. 95 (2), 221-223 (2000).
  22. Flo, R. W., et al. Negative selection of human monocytes using magnetic particles covered by anti-lymphocyte antibodies. J Immunol Methods. 137 (1), 89-94 (1991).
  23. Grondahl-Hansen, J., et al. Plasminogen activator inhibitor type 1 in cytosolic tumor extracts predicts prognosis in low-risk breast cancer patients. Clin Cancer Res. 3 (2), 233-239 (1997).
  24. Borgfeldt, C., Hansson, S. R., Gustavsson, B., Masback, A., Casslen, B. Dedifferentiation of serous ovarian cancer from cystic to solid tumors is associated with increased expression of mRNA for urokinase plasminogen activator (uPA), its receptor (uPAR) and its inhibitor (PAI-1). Int J Cancer. 92 (4), 497-502 (2001).
  25. Devy, L., et al. The pro- or antiangiogenic effect of plasminogen activator inhibitor 1 is dose dependent. FASEB J. 16 (2), 147-154 (2002).
  26. Bajou, K., et al. Plasminogen activator inhibitor-1 protects endothelial cells from FasL-mediated apoptosis. Cancer Cell. 14 (4), 324-334 (2008).
  27. Xu, X., Wang, H., Wang, Z., Xiao, W. Plasminogen activator inhibitor-1 promotes inflammatory process induced by cigarette smoke extraction or lipopolysaccharides in alveolar epithelial cells. Exp Lung Res. 35 (9), 795-805 (2009).
  28. Ji, Y., et al. Pharmacological Targeting of Plasminogen Activator Inhibitor-1 Decreases Vascular Smooth Muscle Cell Migration and Neointima Formation. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 36 (11), 2167-2175 (2016).
  29. Carmeliet, P., et al. Inhibitory role of plasminogen activator inhibitor-1 in arterial wound healing and neointima formation: a gene targeting and gene transfer study in mice. Circulation. 96 (9), 3180-3191 (1997).
  30. Cao, C., et al. Endocytic receptor LRP together with tPA and PAI-1 coordinates Mac-1-dependent macrophage migration. EMBO J. 25 (9), 1860-1870 (2006).
  31. Thapa, B., Koo, B. H., Kim, Y. H., Kwon, H. J., Kim, D. S. Plasminogen activator inhibitor-1 regulates infiltration of macrophages into melanoma via phosphorylation of FAK-Tyr(9)(2)(5). Biochem Biophys Res Commun. 450 (4), 1696-1701 (2014).
  32. Kortlever, R. M., Higgins, P. J., Bernards, R. Plasminogen activator inhibitor-1 is a critical downstream target of p53 in the induction of replicative senescence. Nat Cell Biol. 8 (8), 877-884 (2006).
  33. Fang, H., Placencio, V. R., DeClerck, Y. A. Protumorigenic activity of plasminogen activator inhibitor-1 through an antiapoptotic function. J Natl Cancer Inst. 104 (19), 1470-1484 (2012).
  34. Bennett, S., Breit, S. N. Variables in the isolation and culture of human monocytes that are of particular relevance to studies of HIV. J Leukoc Biol. 56 (3), 236-240 (1994).
  35. Geissmann, F., et al. Development of monocytes, macrophages, and dendritic cells. Science. 327 (5966), 656-661 (2010).
  36. Bauer, M., Goldstein, M., Heylmann, D., Kaina, B. Human monocytes undergo excessive apoptosis following temozolomide activating the ATM/ATR pathway while dendritic cells and macrophages are resistant. PLoS One. 7 (6), e39956 (2012).

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