טכניקות חוקר האנטומיה של מערכת הראייה נמלה

Summary

מאמר זה מתאר חבילת של טכניקות אור ואלקטרון ללמוד על האנטומיה העין הפנימיים והחיצוניים של חרקים. אלה כוללים מספר טכניקות מסורתיות ממוטבים לעבודה על נמלה, מפורט לפתרון בעיות עיניים הצעות עבור אופטימיזציה עבור דגימות שונות ואזורים מעניינים.

Abstract

מאמר זה מתאר חבילת טכניקות במיקרוסקופ אור (LM) ואלקטרון (EM) אשר יכול לשמש כדי ללמוד על האנטומיה העין הפנימיים והחיצוניים של חרקים. אלה כוללים טכניקות מסורתיות היסטולוגית ממוטבים לעבודה על העיניים נמלה, הותאם לעבודה בתאום עם טכניקות טיפול נוספות במיקרוסקופ אלקטרונים הילוכים (TEM) ואלקטרון סריקה (SEM). שיטות אלה, למרות מאוד שימושי, יכול להיות קשה microscopist המתחיל, לכן דגש רב הושם במאמר זה על פתרון בעיות, אופטימיזציה עבור פרטים שונים. אנו מספקים מידע על טכניקות הדמיה עבור הדגימה כולה (מיקרוסקופיה-צילום ו- SEM), לדבר על היתרונות והחסרונות שלהם. אנו להדגיש המשמשת לקביעת קטרים העדשה לעין כל, לדבר על טכניקות חדשות לשיפור. לבסוף, נדון בטכניקות מעורב בהכנת הדגימות באימות LM ו- TEM, חלוקתה מכתים, הדמיה אלה דוגמאות. נדון על משוכות אחד עשוי לבוא על פני בעת הכנת דוגמאות, הדרך הטובה ביותר לנווט אותם.

Introduction

החזון הוא אפנות החישה חשוב עבור רוב בעלי החיים. ראייה חיונית במיוחד בהקשר של הניווט עבור מטרות איכון, הקמת הקפדה על מסלולים ואת קבלת מידע מצפן^1,2. חרקים לזהות מידע חזותי באמצעות זוג עיניים מורכבות וקרא, במקרים מסוימים, הניח dorsally העיניים פשוט אחד עד שלושה ocelli^3,4,5.

העיניים של נמלים הם מעניינים במיוחד, כי בעוד נמלים הם מגוונים להפליא, הם משמרים בכמה מאפיינים מרכזיים על פני מינים. למרות וריאציה דרמטי של האנטומיה, בגודל אקולוגיה, הרוב המכריע של מינים הם eusocial, לחיות במושבות; כתוצאה מכך, מינים שונים בפני אתגרים חזותית דומה מבחינת ניווט אחורה וקדימה בין מקום מרכזי משאבים. מעבר הנמלים bauplan העין בסיסי זהה יכול להיות שנצפו בבעלי חיים הנע בין 0.5-26 מ מ, אורך הגוף, מן באופן בלעדי ההשתנות היומית למינים בקפדנות ליליים, ומן איטי הליכה התת-קרקעי מזנק טורפים חזותי^{6,7, 8,9,10}. כל אלה הבדלים מזעזעת אקולוגיה והתנהגות להצמיח התמורות הרבות של מבנים בסיסיים העין אותה כדי להתאים סביבות שונות, אורחות חיים, את גודל הגוף^11,12. כתוצאה מכך, לומד את האקולוגיה חזותי של נמלים מספק אוצר אמיתי של אפשרויות לחוקר נחוש.

הבנת מערכת הראייה של חרקים חיוני הצצה יכולות התנהגותיות שלהם. זה לכאורה אינטגרטיבי מחקרים המשלבים יפה האנטומיה עם אקולוגיה והתנהגות כדי הצלחה גדולה כמה קבוצות חרקים (למשל, הפניות^{13,14,15,16, 17})-למרות בתחום הניווט נמלה והתנהגות נמלה באופן כללי היה מוצלח למדי, מעט מאוד דגש הושם על נמלה החזון מחוץ זנים נבחרים אחדים. כאן, אנחנו לפרט על טכניקות מעורב בחקירת עין עיצוב של נמלים. בעוד אנו נתמקד נמלים, שיטות אלה ניתן להחיל, עם שינויים קלים, חרקים אחרים, גם.

Protocol

1. דגימה הכנה

הערה: יש צורך קודם כל להבין את המיקום היחסי של מתחם עין, ocelli אחד לשני, על הראש. זו יכולה להיות מושגת על ידי רכישת תמונות של התצוגה הגבי של הראש. לשם כך, אנו ממליצים עיבוד הדגימות או photomicrography או באמצעות טכניקות SEM. להלן השלבים מעורבים שני התהליכים.

1. דוגמה אוסף
   1. לאסוף ולאחסן דגימות ישירות לתוך 70% אתנול. לאסוף הקאסטות השונות במידת האפשר.
   2. תווית דגימות עם הזמן, התאריך, והמקום כמו גם כל התצפיות רלוונטיים אחרים (למשל, שנאספו תוך שיחור מזון, הזדווגות מצבור, לקנן בתוך חוטר, וכו ')
   3. לאסוף מספיק דגימות לקבל משכפל מרובים כל טיפול.
2. Photomicrography ו- Z-לערום
   1. אוויר יבש דגימות והר בהם על קלפי נקודות משולש, באמצעות דבק מסיסים במים, ולאחר מכן על הסיכה של חרקים. לקבלת פרטים, ראה הפניה¹⁸.
   2. התמונה באמצעות stereomicroscope בהגדלה עם מנוע Z-stepper ומצלמת צבע.
   3. להשתמש במפזר אור יש תאורה אחידה עבור דגימות.
   4. ללכוד תמונות במטוסים מוקד שונים ולשמור תמונות בתבנית קובץ ללא אובדן נתונים (כגון tiff), מיקוד מחסנית אותם באמצעות תוכנה זמינים מסחרית.
3. סריקת אלקטרונים micrographs
   הערה: ניקוי יסודי כל כלים ומשטחים לעבוד עם אתנול כדי למנוע זיהום של הדגימה עם חלקיקים אחרים ואבק.
   1. מייבשים דגימות אתנול בן לילה, אוויר יבש בצלחת פטרי.
   2. השתמש סכין גילוח חד כדי להפריד את הראש שאר הגוף.
   3. לטעון את הראש בזווית הצפייה הנדרשת (למשל, הגבי פונה כלפי מעלה) על הספחים אלומיניום באמצעות פחמן מוליך קלטת או טאבים. חותכים את הקלטת פחמן רצועות דקיקות וקפל אותו לתמוך הקפסולה ראש.
   4. השתמש coater לרעוד. להוציא כדי להחיל זהב אל פני השטח של הדגימה למשך 2 דקות בגיל 20 אמא עם שלב רוטרי. הזמן ואת הנוכחי עשוי צריכים להיות מותאמים בהתאם לכלי.
   5. העברת דגימות גדם אלומיניום חדשה עם קלטת פחמן טריים או טאבים.
      הערה: פחמן ללא ציפוי יספק רקע שחור, אלא העברת דגימות עלולה לגרום נזק את ציפוי זהב.
   6. בדוק כיוון הדגימה עדיין לתקן באמצעות מיקרוסקופ ויבתר ולהתאים במידת הצורך עם זוג מלקחיים בסדר או כלי דומה. . שמור על עצמך. לא לגרד את ציפוי זהב; ידית מעט ככל האפשר.
   7. לטעון דגימות על המחזיק stub SEM, ביצוע הערה של העמדה של רכיבי stub של דגימות אחד לשני.
      הערה: חלק SEMs הינם מצוידים עם מצלמה הבמה אבל רבים אינם וזה יכול להיות קשה מאוד לאתר דגימות קטנות בהגדלה.
   8. תמונה דגימות. להשתמש מאיץ מתח נמוך כדי למנוע טעינה של צוהר קטן עבור טוב עומק שדה.
      הערה: ההגדרות ממוטבים בצורה הטובה ביותר תוך התייעצות עם טכנאי מתמחה בכלי מסוים בשימוש.

2. לכימות מספרי היבט של קטרים

1. עותקים משוכפלים של הקרנית
   1. השתמש נמלים יישמרו אתנול או רכוב על סיכה למטרה זו (שלב 1.1.1).
   2. הר החיה של pin חרקים או פלסטלינה. אם הראש גדול יחסית, ניתן להסיר את חלקי הגופה הנותרת.
   3. השתמש של חרקים או קיסם בסדר כדי להרים טיפה קטנה של ייבוש מהיר לק שקוף ולהפיץ אותה במהירות מעל העין. ודא שמספר הזיהוי האישי לא לגרד את העין. הלק אמור לכסות את העין כולה וחלק הקפסולה ראש שמסביב.
      הערה: חשוב כי הלק להיות של עובי אחיד יחסית על פני העין.
   4. להשאיר את הלק כדי להגדיר בטמפרטורת החדר.
   5. פעם אחת הוא מוגדר באופן מלא, השתמש סיכה חרקים בסדר להרים בעדינות את העותק המשוכפל של הקפסולה ראש העין.
   6. השתמש זוג מלקחיים נקי נאה כדי להרים את העותק המשוכפל, תופסים את החלק של העותק המשוכפל שמכסה את הראש ואת לא העין.
   7. להבטיח מודעות על הכיוון של העין: האזור הקדמי, האחורי, הגבי ו הגחון.
   8. למקם את העותק המשוכפל על משטח זכוכית. השתמש סכין גילוח כדי לקצץ את העותק המשוכפל על ידי בקפידה הסרת חומר עודף סביב העין. השתמש מחט או זוג מלקחיים כדי למנוע את העותק המשוכפל לנוע.
   9. אם העין מאוד קמורה, השתמש סכין גילוח כדי לבצע 3-4 בסדר חתכים רדיאליים חלקית סביב הקצוות כדי לעזור "לשטח" את העותק המשוכפל. אם העין "שטוחה" יחסית, יש צורך לעשות חתכים כאלה.
   10. במקום מכסה בעדינות על העותק המשוכפל העין, המבטיח כי הכיוון של העותק המשוכפל ידועה. לחץ על כל דבר זה יכול לבטל את הרושם הקרנית על הלק.
   11. חותם את coverslip באמצעות מעט מאוד לק על ארבע פינות. אם הלק זורם בין מכסה זכוכית שקופיות, הוא יפגע העותק המשוכפל.
   12. תמונת השקופית על מיקרוסקופ המתחם.
       הערה: אם יש רק כמה היבטים בפוקוס, ואז הדבר מצביע על שהעותק המשוכפל העין לא שטוחה מספיק. למחוק ולהתחיל שוב משלב 2.1.3.
   13. לייבא את התמונה זמינה בחופשיות תוכניות כגון ImageJ/פיג'י שבו ניתן למדוד את מספר ommatidia והגודל של כל ommatidia.
       פתק: ניתן להשתמש בשיטה זו כדי להכין העתקים של ocelli, גם. מאז הוא עדשה בודדת, מומלץ לשמור את כל ocelli יחד בעותק משוכפל אחד.

3. ניתוח המבנה של העין

הערה: ללמוד על האנטומיה של העין מחייבת ברוב המקרים שני משלימים טכניקות של LM ו- TEM. שלבי העיבוד הראשוני לדרוש טכניקות דומות באימות LM ו- TEM. ההבדל נובע השלב אופטים ואילך. עיבוד הדגימות מחייב שימוש כימיקלים מסוכנים אשר חייבים להיות מטופלים עם טיפול שנמחקו באחריות. להשתמש ציוד מגן אישי, פועלים בשכונה fume, תמיד לקרוא את sheets(SDS) נתוני בטיחות וכן לבצע הערכות סיכונים לפני שמתחילים.

1. דיסקציה
   1. להרדים דגימות קירור או על ידי חשיפה גז CO₂.
      1. הרדמה₂ CO היא מאוד מהירה (בדרך כלל פחות מדקה) צריך לקחת כדי למנוע חשיפת יתר כמו זה יכול לגרום למוות של הדגימה. אם משתמש כדורי קרח יבש (מוצק CO₂) להימנע ממגע ישיר עם דגימות כמו זה יכול לגרום כוויות קר.
      2. הרדמה קר הוא איטי; 4 ° C מספיקה, טמפרטורות קר אינם מומלצים. לקבוע זמן קירור מתאים עבור המין האנושי. נמלים עמיד גדולים או קר כגון נמלים שור עשוי לדרוש > 10 דקות להפוך קיבוע באופן מלא, בעוד מינים קטן יותר יזדקק רק 1-2 דקות מוגזם קירור יהרוג את הדגימה (להימנע ממגע ישיר עם קרח). דגימות עליו להיות רצוי שנערך במיכלים קטנים, הפסיקה-קצף, פלסטיק, מניחים במקרר איפה הם יכולים להיות שנצפו במקום של מקרר חשמלי או במקפיא.
   2. במקום הדגימה על צלחת פטרי, והתאם לצפייה במיקרוסקופ ויבתר. עובדים במהירות חשוב לשמר הרדמה וכדי למנוע ניוון של הרקמה ברגע החתכים מבוצעים (זה יכול לקרות תוך מספר שניות).
   3. הסרת אנטנה עם מלקחיים. אם עובדים עם חרק צורבת, מומלץ לכרות את גסטר קודם כדי להימנע ולהעקץ.
   4. להסיר את החלקים הפה באמצעות תער חד; ניתן להשתמש מלקחיים להחזיק את הדגימה. לחתוך את החלק הקדמי של העין (דגימות גדולות) או ייערך בו בעיניים ככל האפשר (דגימות קטנות) מבלי המשוחררים על המוח כמו זה יכול לקרוע הרשתית.
   5. היכונו לפתוח את הקפסולה ראש. זווית הדגימה כך החתך הראשון. מכוון זה יכול להיעשות גם תחת המיקרוסקופ ויבתר תוך החזקת הדגימה ב המלקחיים או תחת שליטה ויזואלית תוך החזקת הדגימה בין אצבע האגודל, קידמה.
   6. עושים חתך רוחבי דרך הראש כדי להסיר בחלק הבטני של הראש; החלק של העין הגחון יוסרו במינים גדולים כדי לשפר את הפיקסציה וחדירה. הראש צריכה עדיין להיות מחוברת אל הגוף בנקודה זו.
   7. סבר הקפסולה הראש מהגוף על ידי ביצוע חתך הילתית אחורי רק את העין המתחם.
   8. מקום הקפסולה ראש ביתור עם העיניים מתחם לשבועיים קר קרח: paraformaldehyde גלוטראלדהיד, 2% 2.5% במאגר פוספט (pH 7.2-7.5).
      התראה: מקבע הוא מאכל רעילים; לענוד הגנה הולמת ולעבוד בשכונה fume.
      הערה: חשוב לעבוד מהר כדי לעצור ניוון רקמות עצביות. . הקרע צריך להיות הושלמה ב 2 דקות או פחות (דיסקציה יעיל עלול לדרוש קצת אימון).
      הערה: אם העין צריך להיות מותאם לתנאים בהיר או כהה, אז קודם חושפים את החיות לתנאי אור הדרושים לכמה שעות. לבצע את ניתוח בתנאי אור בהתאמה. ניתוח יכול להתבצע תחת אורות אדומים כדי לדמות את החושך.
2. עיבוד הדגימה
   1. לשמור דגימות מקבע בטמפרטורת החדר עם תנועה-תפקודי לב /, כי ה' 2 דגימות גדולות עשויים לדרוש עוד קיבעון פעמים.
   2. הסרת מקבע את ולחסל אותו כראוי. רחץ דגימות במאגר פוספט בטמפרטורת החדר (3 פעמים, 5 דקות כל אחד) על ניעור.
      הערה: המאגר פוספט כוללת של 8 g NaCl, 0.2 גרם אשלגן כלורי, 1.44 g נה₂HPO₄ו- 0.244 g ח'₂PO₄ ב- 1 ליטר של מזוקקים H₂O (pH 7.2).
   3. להסיר את המאגר פוספט ולהוסיף 2% OsO_4. מניחים את הצנצנת הדגימה על ניעור בשכונה fume עבור h 1-2. זהו שלב קיבוע שאחרי לתקן שומנים ולספק גם החדות עבור TEM.
      הערה: אוסמיום קיבוע פעמים כפופים גודל הדגימה; כלל אצבע קשה, לחשב h 1 של קיבעון לכל 1 מ³.
   4. הסר את הפתרון אוסמיום ותיפטר ממנו כראוי. רחץ דגימות במאגר בטמפרטורת החדר (3 פעמים, 5 דקות כל אחד) על ניעור.
   5. מייבשים את דגימות על-ידי הצבתם הגדלת ריכוזי אתנול או אצטון; לדוגמה, 50, 70, 80, 95% 10 דקות ואת סוף סוף 100% (פי 2, 15 דקות כל אחד). מניחים את דגימות על ניעור בין פתרון שינויים.
      הערה: אם יש צורך, דגימות ניתן לאחסן אתנול 70% למשך הלילה.
   6. מסננים את האתנול ולהוסיף אצטון 100%. תשאיר את זה במשך 20 דקות על ניעור (דלג על שלב זה אם dehydrating אותו באצטון). להחליף עם אצטון טרי ולהשאיר את זה כעשרים דקות נוספות.
   7. לחדור הרקמות עם שרף באמצעות את היחס הבא של אצטון שרף: 2:1 (3h), 1:1 (לילה), 1:2 (4 שעות), שרף טהור (לילה). בכל שלב להשאיר דגימות ניעור בתוך המנוע fume, קאפ הגורם המכיל עבור כל פרט שני השלבים האחרונים.
      הערה: שרף הוא גם צמיגה נקוו אז חייבים להעביר דגימות מיכל חד פעמיות חדש בכל שלב.
   8. להכין בלוקים כדי לטעון את הדגימות. רחובות, יכול להיות מותאם אישית שנעשו על ידי חיתוך זכוכית אקרילית לגושי מלבני קטן (1.5 x 0.5 x 0.3 ס מ). בלוקים יכולים להתבצע גם על ידי שפיכת שרף אפוקסי (יש הרבה קיטים מסחריים זמינים) לתוך תבנית סיליקון, ואז לרפא את זה בתנור במשך 12-14 h ב 60 מעלות צלזיוס.
      התראה: שרף (נוזלי) משומרים מסרטנים ויש להחזיר את התנור עד מלא מוקשה.
   9. מקם את הבלוק אנכית העובש. בזהירות לקחת דגימות מן השרף נוזלי, לאפשר שרף עודף לנקז, ולמקם את הדגימה על גג הבניין. כמות קטנה של שרף נוספים יכול לשמש כדי לאגד את הדגימה הבלוק.
   10. תווית הרחוב. להדפיס את התוויות נייר להטביע אותו הבלוק או לצרף אותו פרצוף בלוק.
   11. לשמור את התבנית עם בלוקים מוטבע בתנור במשך 12-14 h ב 60 מעלות צלזיוס.
   12. חנות הרחוב דגימה במעטפת נקי. זה ניתן לאחסן באופן זה במשך מספר חודשים עד שנים.
   13. להשאיר את המכולות בשימוש, מלוכלך כפפות וציוד מזוהמים אחרים בשכונה fume כדי לאפשר אצטון מתמוססות לחלוטין (מינימום 12 שעות).
   14. לרפא שרף בתנור לפני השלכת ציוד מתכלה או גירוד שרף את שאר הפריטים כגון מלקחיים.
3. חלוקתה
   1. לבחון את הבלוק תחת המיקרוסקופ ויבתר כדי להבטיח כיוון הדגימה המתאימה עבור המטוס אופטים.
   2. אם הכיוון אינו מתאים להשתמש המסור של צורף כדי לגזור את הדגימה מחדש אוריינט באמצעות קטעים של הגדר שרף שרף טריים מחדש להושיב את הדגימה. ניתן לפצל את הראש גם לשני חצאים כדי סעיף בנפרד את שתי עיניו. לרפא שרף שוב לפני שתמשיך.
   3. הר הרחוב על הצ'אק מיקרוטום נשלף. הסר את הצ'אק ומניחים על מחזיק.
   4. חתוך את הבלוק שרף באמצעות סכין גילוח תחת המיקרוסקופ ויבתר.
      התראה: אל תעשי זה כאשר הצ'אק הוא רכוב על הזרוע מיקרוטום כפי שהוא יכול. לדפוק לך את הזרוע של מסבים נזק.
   5. טען מחדש את הצ'אק על גבי הזרוע מיקרוטום ותטה את הדגימה.
   6. לטעון את הסכין על המחזיק בהזווית המתאימה (0° עבור זכוכית סכינים, ראה הוראות היצרן סכינים יהלום).
      הערה: סכינים זכוכית יכולה להתבצע בזול באמצעות מכונת הסכין זכוכית, אלא שיש להחליפו מעת לעת כפי הם מאבדים את הקצה שלהם; סכינים יהלום באיכות גבוהה ניתן לרכוש אבל הן יקרות, דורשים טיפול מיוחד, אינם מתאימים למתחילים.
   7. למלא את הסירה את הסכין עם מים מזוקקים באמצעות מזרק עם מסנן (0.45 µm גודל הנקבוביות).
   8. למלא את הסירה עד מפלס המים מגיע קצה הסכין; אלך להביא את האלונקה עשוי להיות קמורה באזורים אחרים של הספינה.
   9. סוחטים את הסירה עד מניסקוס קעורה מעט מאוד, אבל עדיין מגיע הקצה של הסכין. ניתן לכוונן את רמת המים בכל נקודה, אבל תמיד מן הקצה של הסכין.
   10. בקפידה להביא את הסכין הדגימה ויישר את הבלוק לסכין. זה נעשית לאט, מעת לעת בדיקת הקרבה של הסכין דרך העיינית של המצלמה, מן הצד.
       הערה: בדוק את המדריך כלי לקבלת הוראות ספציפיות כמו מכשירים מגוונים.
   11. להגדיר את עובי סעיף האזמל הקטן. בחירת העובי המתאים יהיו תלויים בגודל הדגימה, אזור עניין הסוג של סכין בשימוש.
   12. אם משתמש בסכין זכוכית בחר הגדרה גבוהה יותר (למשל, 4 מיקרומטר), אם הרבה חומר עליך לחתוך משם לפני שהגיע את תחום העניין. אם סכין יהלום נמצא בשימוש, או אם הדגימה הוא קטן מאוד, 1-2 מיקרומטר עשוי להיות מתאים יותר.
   13. להתחיל "לחתוך" (cranking את הגלגל מיקרוטום) כאשר הסכין קרוב, אך עדיין לא מורידה את הדגימה כדי לבצע את החלק האחרון של הגישה. סעיפים צריך להתחיל להופיע בתוך כמה סיבובים; אם לא, לעצור ולהביא בזהירות רבה הסכין קרוב יותר.
   14. להתאים את המקטע איסוף עובי (1 מיקרומטר למקטעי למחצה דק) כאשר מתקרבים לאזור של ריבית.
   15. לאסוף את כל המקטעים באמצעות כלי עפעף.
       הערה: כלים עפעף יכולה להתבצע באמצעות עפעף רכוב על גבי מקל דק עם לק.
   16. אם הרבה חומר להסירו, לאפשר הסעיפים ולצבור להסיר בהמוניהם על-ידי הסרת הסכין ומרוקן אותו עם מים. אם משתמש בסכין זכוכית, זה עשוי להיות זמן מתאים כדי לשנות קטע טריים של הסכין או סכין חדשה.
   17. המקום סדרה של טיפות קטנות של מים מזוקקים בשקופית באמצעות פיפטה פסטר או באופן אידיאלי, המסנן מצויד במזרק.
   18. בזהירות לצוף בעמוד עפעף על גבי ה-droplet מים שנאספו.
   19. איסוף מקטעים ככה עד ראוי לבדוק את עומק חלוקתה.
       הערה: למרות שזה יכול להיות מייגע, מומלץ תמיד לבדוק לעיתים קרובות.
   20. מקם את השקופית על גזייה מוגדר כ- 60 מעלות צלזיוס. אפשר כל המים מתמוססות ובמקטע לדבוק השקופית.
   21. לצבוע חלקים עם טולדין כחול עבור s 10-60 (מכתים הזמן משתנה עם סעיף עובי). לוותר על לצבוע בעזרת מזרק מצויד עם מסנן (כמפורט לעיל).
   22. הניחו טיפת לצבוע על קצה אחד של השקופית ולהפיץ אותו באמצעות הצד של המחט בלי לגעת או גירוד את הסעיפים. מקם את השקופית על פלטת הבישול במשך כ 10 שנות ה-20.
   23. לשטוף את השקופית באמצעות התזה עם מים מזוקקים בבקבוק שטיפת ומניחים אותו על הכיריים כדי לייבש אותו.
   24. בדוק תחת המיקרוסקופ המתחם, תמונה אותם.
   25. חזור עד אזור בעל עניין.
   26. עבור מקטעים דקים: להגדיר את עובי חיתוך בין 40-60 ננומטר לאסוף במקטעים TEM.
   27. לחתוך על סעיפים 3-5 ו בדיקת עובי באמצעות תרשים צבע של הפרעות. סעיפים לשקף אפור בהיר כאשר צפו בזווית.
       הערה: כלורופורם אדי יכול להיות pipetted על סעיפים להירגע מכל רוחביים. . זה הכי רלוונטיות למשתמשים מנוסים, למתחילים לא צריך לדאוג. מדי כלורופורם שוחרר קרוב מדי אל הסעיף עלול לגרום נזק מקטעים.
   28. לאסוף רשת חריץ מצופים Formvar, נחושת, מחוזק עם מלקחיים עם הצד Formvar. יש להיזהר לא לנקב את ציפוי Formvar.
   29. טובלים את הרשת אל תוך הספינה edgeways, מן הסעיפים, ואז להביא את הרשת למעלה במקביל למשטח תחת הסעיפים. אם יש צורך להשתמש את עפעף כדי להנחות הסעיפים על הרשת.
   30. כי אמחה קלות בזהירות סביב הקצה של המלקחיים עם נייר סינון כדי לספוג מים לכוד בין הזרועות. אם זה לא נעשה, מים המתח ניתן להרים את הרשת בין הזרועות או ידבקו לצד אחד. זה יכול לגרום זיהום או פגיעה מכנית.
   31. הסר בזהירות המים העודפים מן הרשת עצמה על ידי עמידה הרשת edgeways על נייר סינון.
   32. מקם את הרשת בעל רשת.
   33. חזור עד שנאסף מספיק חלקים.
   34. סעיפים למחצה דק יכול לדימות ישירות עם כל מיקרוסקופים המתחם מצויד with a מצלמה. טבילה שמן ניתן להניח ישירות על הסעיפים. שקופיות לאחסן בקופסה שקופית כדי למנוע שינוי צבע.
4. צביעת דקים מקטע עבור TEM ניגודיות
   הערה: השלבים הבאים צריך להתבצע תחת מחסה כמו הצבעים הם אור ו- CO₂ רגיש. יתר על כן, צבעי EM להשתמש מתכות כבדות לייצר ניגודיות, ולכן הם חומרים מסוכנים. הטיפול המתאים, יש לנקוט בעת טיפול הכתמים האלה.
   1. לכסות כמה צלחות פטרי גדולה ברדיד אלומיניום, כדי לחסום את האור. לעבוד תחת אלה השלבים הבאים. חלקית לחשוף אותם כדי לאפשר מרחב עבודה אבל מקום לשמיכות בחזרה בהקדם האפשרי.
   2. לחתוך חתיכה של הסרט שעווה ומניחים בזהירות חמש טיפות של 6% רווי uranyl אצטט באמצעות פיפטה של פסטר.
      1. כדי להכין את הפתרון, מערבבים דור 2 uranyl אצטט עם מתנול 50% 100 מ ל מים מזוקקים, לסנן את הפתרון לפני השימוש. הפתרון לא יכול להיות מאוחסן, צריך להיות טרי טרי כל הזמן¹⁹.
   3. בזהירות להרים את רשתות TEM עם מלקחיים ואיזון על טיפות צבע עם הצד סעיף למטה. השאר למשך 25 דקות.
   4. שטיפה רשתות בנפרד על ידי במהירות טובלים אותם פנימה והחוצה מים מזוקקים; התקדמות דרך 4 מבחנות שונות של מים מזוקקים.
   5. במקום חמש טיפות של ציטראט עופרת על חתיכה טרייה של הסרט. לארגן כמה כדורי NaOH סביב טיפות צבע (זה סופג אטמוספרי CO₂ למניעת משקעים של קרבונט).
      1. כדי להפוך את הפתרון ציטראט עופרת, להכין מים מזוקקים-bi על ידי מים מזוקקים רותחים ה 0.5 אפשר למים מגניב ולהוסיף במיכל sealable, 0.3 גרם עופרת ציטראט 100 מ של מים מזוקקים-bi. להוסיף 1 מ"ל 10 מ' NaOH, לסגור את המיכל בחוזקה, ומנערים עד מומס¹⁹.
   6. מניחים את הרשתות על טיפות צבע כפי שמתואר 4.3 ומכסים. הכתם למשך 5 דקות.
   7. יש לשטוף במים מזוקקים כמו לפני בטבילת הרשתות ויוצאים מים מזוקקים 20 פעמים. התקדמות דרך שלושה כלי של מים מזוקקים.
   8. לספוג את המים העודפים עם נייר סינון ולאפשר את רשתות להתייבש בתוך קופסה לרשת.
   9. תמונת TEM במתח נמוך מאיץ.

תוצאות

השיטות המתוארות כאן מאפשרים לימוד מפורט של התם עיניים מורכבות של נמלים. הדמיה התצוגה הגבי של הראש תוך שימוש בטכניקות photomicrography Z-מחסנית מאפשרת לקבל מבט כולל על הפריסה של מערכת הראייה (איור 1). זוהי הכנה טובה עבור ניתוח וכדי לקבוע את הזווית אופטים הנדרש. טכני?...

Discussion

הסוויטה מהשיטות המתוארות למעלה מאפשרים חקירה יעילה לתוך המערכת האופטית של נמלים וחרקים אחרים. טכניקות אלה מתבקשים ליידע את ההבנה שלנו של רזולוציית דגימה, רגישות אופטי פוטנציאל הרגישות קיטוב של העין נחקר. הידע הזה מספק בסיס חשוב פיזיולוגיים והתנהגותיים בחקירה שלהם יכולות חזותיות. יתר על ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ant	Myrmecia midas
Stereomicroscope	Leica M205 FA
Sputter coater	Pro Sci Tech
Ethanol	Sigma Aldrich
Petri dish	ProSciTech
Dissecting microscope	Leica MZ6
Insect Pin	ProSciTech
Colourless nail polish	Non branded: from any cosmetic store
Glass slide	ProSciTech
Razor blade	ProSciTech
Foreceps	ProSciTech
Cover slip	ProSciTech
Compound microscope	Leica DM5000 B
Glutaraldehyde	Sigma Aldrich
Paraformalydehyde	Sigma Aldrich
Potassium Chloride (KCl)	Sigma Aldrich
di-Sodium Hydrogen phosphate (Na2HPO4)	Sigma Aldrich
Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4)	Sigma Aldrich
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma Aldrich
Osmium tetroxide	Sigma Aldrich
Acetone	Sigma Aldrich
Araldite Epoxy Resin	Sigma Aldrich
Pasteur pipette	Sigma Aldrich
Toluidie Blue	Sigma Aldrich
Hotplate	Riechert HK120