Методы для изучения анатомии муравей зрительной системы

Резюме

Эта статья конспектирует набор методов в свет и электронной микроскопии для изучения анатомии внутренних и внешних глаз насекомых. К ним относятся несколько традиционных методов, оптимизированы для работы на муравей глаза, подробно устранение неполадок и предложения по оптимизации для различных образцов и областей, представляющих интерес.

Аннотация

Эта статья конспектирует набор технологий в светлую микроскопию (LM) и электронной микроскопии (EM), которые могут быть использованы для изучения анатомии внутренних и внешних глаз насекомых. К ним относятся традиционные Гистологические техники оптимизирован для работы на глазах муравьев и адаптированы для работы во взаимодействии с другими методами просвечивающей электронной микроскопии (ТЕА) и растровая электронная микроскопия (SEM). Эти методы, хотя значительно полезным, может быть трудно для новичка микроскописта, поэтому большой акцент в этой статьи по устранению неполадок и оптимизации для различных образцов. Мы предоставляем информацию о методы визуализации для всего образца (Фото микроскопия и SEM) и обсудить их преимущества и недостатки. Мы выделить метод, используемый при определении диаметра объектива для весь глаз и обсудить новые методы для улучшения. И наконец, мы обсуждаем методы подготовки образцов для LM и ТЕА, секционирование, окрашивание и эти примеры работы с изображениями. Мы обсуждаем с барьерами, которые одно может прийти через при подготовке проб и как лучше всего перемещаться вокруг них.

Введение

Зрение является важным сенсорные механизм для большинства животных. Видение это особенно важно в контексте навигации для pinpointing целей, установления и соблюдения маршрутов и получения компас информации^1,2. Насекомых обнаружить визуальной информации с помощью пары Составные глаза, и, в некоторых случаях, одного-трех дорзально помещены простые глаза под названием глазки^3,4,5.

Особый интерес представляют глазах муравьев, потому что, в то время как муравьи являются удивительно разнообразны, они сохранить некоторые ключевые характеристики различных видов. Несмотря на драматические изменения в анатомии, размер и экологии подавляющее большинство видов являются эусоциальных и живут в колониях; в результате различных видов сталкиваются с аналогичными проблемами визуальные с точки зрения навигации взад и вперед между центральное место и ресурсами. Через муравьи же основные глаз bauplan можно наблюдать в животных, начиная от 0,5-26 мм, длина тела, от исключительно суточные для строго ночной вид и от медленной ходьбы подземные прыгали визуальные хищников^{6,7, 8,9,10}. Все эти ошеломляющие различия в области экологии и поведения порождают бесчисленные перестановки же основные глаз структур с учетом различных сред, образ жизни и размеров тела^11,12. Как следствие изучая визуального экологии муравьи предоставляет настоящую кладезь возможностей определяется следователю.

Понимание зрительной системы насекомых имеет важное значение в получении проницательность в их поведенческих возможностей. Это видно из комплексных исследований, которые красиво сочетать анатомии с экологии и поведения на большой успех в несколько групп насекомых (например, ссылки на^{13,14,,1516, 17}). Хотя в целом области перехода ant и поведение муравьёв был довольно успешным, очень мало упор на видение муравей вне несколько отдельных видов. Здесь мы будем распространяться на методах, используемых в расследовании глаз дизайн муравьев. Хотя мы сосредоточимся на муравьев, эти методы могут применяться, с небольшими изменениями, для других насекомых, тоже.

протокол

1. Подготовка образца

Примечание: Это необходимо сначала понять относительное расположение составного глаза и глазки друг к другу и по голове. Это может быть достигнуто путем приобретения изображений спинной мнение руководителя. Для этого мы рекомендуем обработки образцов для Микрофотография или с помощью SEM методы. Ниже шаги принимают участие в обоих процессах.

1. Образцы коллекции
   1. Собирать и хранить образцы непосредственно на 70% этиловом спирте. Сбор различных каст, когда это возможно.
   2. Ярлык образцов с время, Дата и место, а также любые другие соответствующие замечания (например, собранных во время нагула, спаривания агрегации, гнездятся внутри ветки и т.д.)
   3. Соберите достаточное количество образцов иметь несколько реплицирует в каждом лечения.
2. Микрофотография и Z-укладчик
   1. Воздух сухой образцы и смонтировать их на треугольной точка карты, с помощью клея растворяется в воде, а затем на насекомых PIN-код. В разделе Ссылка¹⁸.
   2. Изображение с помощью большого увеличения стереомикроскопом с Z-шаговый двигатель и цветные камеры.
   3. Используйте диффузор равномерное освещение для образцов.
   4. Захват изображения на различных фокальной плоскости и сохранять изображения в формате без потерь файла (например, tiff) и фокус стек им с использованием имеющегося программного обеспечения.
3. Сканирование электронной микроскопии
   Примечание: Тщательно очистите все инструменты и рабочие поверхности с этанолом, чтобы избежать загрязнения образца с пыли и других частиц.
   1. На ночь обезвоживаются образцов в этаноле и воздух сухой в чашке Петри.
   2. Используйте острые лезвия бритвы для разделения головы от остальной части тела.
   3. Установите головку на требуемый угол (например, спинной вверх) на алюминиевой заглушки с использованием проводящих углерода ленты или вкладки. Нарезать тонкими полосками углерода ленты и складывать его для поддержки головной капсулой.
   4. Используйте распыления нанесения покрытий для применения золота на поверхности образца на 2 мин 20 мА с поворотный этап. Ток и время может потребоваться корректироваться в зависимости от инструмента.
   5. Передача образцов новой алюминиевой заглушку с свежими углерода ленты или вкладки.
      Примечание: Немелованной углерода будет предоставлять черный фон, но передачи образцов может повредить золочения.
   6. Проверьте ориентацию образца до сих пор под микроскопом рассечения и корректировать по мере необходимости с парой тонкой щипцами или подобный инструмент. Заботиться, чтобы не поцарапать Золотое покрытие; Дескриптор как можно меньше.
   7. Загрузить образцы на держателя заглушку SEM, делая к сведению позицию заглушки и образцы относительно друг друга.
      Примечание: Некоторые SEMs оборудованы с камерой стадии, но многие из них не и это может быть трудно найти небольшие образцы с высоким увеличением.
   8. Изображения образцов. Используйте низкий ускоряющего напряжения, чтобы избежать зарядки и малой апертурой для хорошей глубины резкости.
      Примечание: Параметры лучше оптимизированы в консультации с техник специализируется в частности инструмент, который используется.

2. количественного аспекта чисел и диаметров

1. Роговицы реплик
   1. Используйте муравьи сохранились в этанол или монтируется на ПИН-код для этой цели (шаг 1.1.1).
   2. Смонтировать животное на насекомых ПИН или пластилином. Если руководитель является относительно большим, остальные части тела может быть удалены.
   3. Использование насекомых pin или тонкой зубочистку подобрать небольшое падение Быстросохнущий бесцветный лак и быстро распространился на глаз. Убедитесь, что ПИН-код не царапает глаз. Лак для ногтей должен охватывать весь глаз и некоторые из окружающих головной капсулы.
      Примечание: Важно, что лак быть относительно равномерную толщину через глаза.
   4. Оставьте Лак для задания при комнатной температуре.
   5. После того, как он полностью установлен, используйте штраф насекомых ПИН для осторожно поднимите реплики из головной капсулы вокруг глаз.
   6. Используйте пару прекрасные чистые пинцет поднять реплики, чтобы захватить часть реплики, которая покрывает голову и не глаза.
   7. Обеспечение осведомленности о ориентации глаза: передняя, задняя, спинной и брюшной области.
   8. Место реплики на стеклянное скольжение. Используйте лезвие бритвы обрезать реплики, тщательно удалив избыток материала вокруг глаз. Используйте иглы или пару щипцы для предотвращения перемещения реплики.
   9. Если глаза очень выпуклые, используйте лезвие бритвы сделать 3-4 штрафа частичной Радиальные разрезы вокруг края чтобы помочь «сгладить» реплики. Если глаза относительно «плоский», не нужно делать такие надрезы.
   10. Место крышку выскальзования мягко на глаз реплики, обеспечивая, что ориентация реплики известен. Не прикладывайте давление, как это можно устранить роговицы впечатление на лак.
   11. Печать coverslip, с помощью очень мало лак на четырех углах. Если лак потоков между крышку выскальзования и стеклянных скольжениях, это повредит реплики.
   12. Изображение слайда на составной микроскоп.
       Примечание: если лишь некоторые аспекты в фокусе, то это говорит о том что реплика глаз не выравнивается достаточно. Сбросить и снова начать с шага 2.1.3.
   13. Импорт изображения в свободно доступных программ, таких как ImageJ/Фиджи, где количество фасеточном и размер каждого фасеточном могут быть измерены.
       Примечание: Этот метод может использоваться для подготовки реплики глазки, тоже. Поскольку это один объектив, мы рекомендуем, сохраняя все глазки вместе в одной реплике.

3. анализ структуры глаза

Примечание: Для изучения анатомии глаза требует в большинстве случаев два взаимодополняющих методов LM и ТЕА. На стадии первоначальной обработки требуют аналогичные методы для LM и ТЕА. Разница возникает из резания стадии года. Обработка образцов требует использования опасных химических веществ, которые должны быть обработаны с осторожностью и отбрасываются ответственно. Использование средств индивидуальной защиты, работать в вытяжного шкафа, всегда читать безопасности данных sheets(SDS) и провести оценку риска перед началом.

1. Рассечение
   1. Обезболивают образцов охлаждения или под воздействием газообразных CO₂.
      1. CO₂ наркотизация очень быстро (как правило менее 1 мин) и следует позаботиться о том, чтобы избежать чрезмерного воздействия, как это может привести к смерти образца. При использовании гранулы сухого льда (твердых CO₂) Избегайте прямого контакта с образцами, как это может вызвать ожоги холодной.
      2. Холодные анестезии медленнее; 4 ° C является достаточным, и холодных температур не рекомендуются. Установить соответствующее время охлаждения для видов. Большие или холодной устойчивостью муравьи например бык муравьи могут потребовать > 10 мин, чтобы стать полностью обездвиженных, в то время как меньшие видов может потребоваться только 1-2 мин чрезмерного охлаждения будет убивать образца (Избегайте прямого контакта со льдом). Образцы должны предпочтительно в небольших, пена пробкой, пластиковые контейнеры и помещены в холодильник, где они могут наблюдаться, а не в Электрический холодильник или морозильник.
   2. Поместите образцы на чашку Петри и настроить для просмотра под микроскопом рассечения. Работа быстро имеет важное значение для сохранения анестезии и избегать дегенерации ткани после надрезы (это может произойти в течение нескольких секунд).
   3. Удаление антенн с щипцами. При работе с язвительные насекомых, желательно ампутировать Гастер сначала для того, чтобы избежать быть задело.
   4. Удаление частей рот, используя острые лезвия бритвы; может использоваться щипцами удерживать образца. Вырежьте через переднюю часть глаза (большой образцов) или как можно ближе к глаза как можно скорее (небольшие образцы) без дергая на мозг, как это может вырвать сетчатки.
   5. Приготовьтесь открыть головной капсулой. Угла образца, так что первый разрез кверху; Это может быть сделано либо под микроскопом рассечения удерживая образца щипцами или под визуальным контролем удерживая образца между thumb и передний план палец.
   6. Сделать поперечный разрез через голову, чтобы удалить брюшной части головы; часть вентральной глаза могут быть удалены в крупных видов для улучшения фиксации и инфильтрации. Руководитель должен еще быть крепится к корпусу на данный момент.
   7. Север головной капсулы из тела, делая корональных разрез просто кзади составного глаза.
   8. Место расчлененных головной капсулы с составными глазами в лед холодной фиксатором: глутаровый и 2% параформальдегида 2,5% в фосфатного буфера (pH 7,2-7.5).
      Предупреждение: Фиксатор коррозионные и токсичные; Носите надлежащей защиты и работать в зонта.
      Примечание: Важно работать быстро, чтобы остановить дегенерация нервных тканей. Вскрытие должно быть завершено в 2 мин или менее (эффективный диссекции может потребовать некоторой практики).
      Примечание: Если глаз необходимо адаптировать к условиям яркие или темные, затем первым разоблачить животных в необходимые условия освещения на несколько часов. Осуществляют вскрытия в соответствующих условиях освещения. Анатомирование может осуществляться под красные огни для имитации тьмы.
2. Образец обработки
   1. Сохранить образцы в фиксатор при комнатной температуре с движением на орбитальный шейкер, х 2. большие образцы, может потребовать больше времени фиксации.
   2. Снимите фиксатор и распоряжаться его соответствующим образом. Вымойте образцов в комнатной температуре фосфатного буфера (3 раза по 5 минут) в шейкер.
      Примечание: Фосфатного буфера состоит из 8 g NaCl, 0,2 г KCl, 1,44 г Na₂HPO₄и 0,244 g KH₂PO₄ в 1 Л дистиллированной H₂O (pH 7.2).
   3. Удаление фосфатного буфера и добавить 2% OsO_4. Поместите jar образца на шейкер в зонт для 1-2 ч. Это шаг после фиксации для устранения жиров и также обеспечивают контраст для ТЕА.
      Примечание: Осмий фиксации раз подпадают под размер образца; как грубый правило Вычислите 1 h фиксации на 1 мм³.
   4. Удаление решения осмий и распоряжаться им соответствующим образом. Вымойте образцов в комнатной температуре буфера (3 раза по 5 минут) в шейкер.
   5. Обезвоживает образцы, поместив их в увеличении концентрации этанола или ацетон; например 50, 70, 80 и 95% за 10 мин и наконец 100% (2 раза по 15 мин). Поместите образцы на шейкер между решения изменений.
      Примечание: В случае необходимости, образцы могут храниться в 70% этанол на ночь.
   6. Слейте этанола и добавьте 100% ацетона. Оставьте на 20 мин на шейкер (пропустить этот шаг, если обезвоживания в ацетон). Замените свежим ацетона и оставить его на дополнительные 20 мин.
   7. Проникнуть тканях смолой, используя следующие показатели ацетона для смолы: 2:1 (3 ч), 1:1 (на ночь), 1:2 (4 ч) и чистой смолы (на ночь). На каждом шаге оставьте образцов на шейкер внутри зонта и крышка контейнера для всех, кроме двух последних шагов.
      Примечание: Смола слишком вязкой опорожнять так образцы должны быть перемещены в новый одноразовый контейнер на каждом шагу.
   8. Подготовьте блоки для установки образцов. Блоки могут быть пользовательские сделал резки акрилового стекла на небольшие прямоугольные блоки (1.5 x 0.5 x 0,3 см). Блоки могут также быть сделаны заливки эпоксидной смолы (есть много коммерческих комплекты доступны) в кремний плесень и вылечить его в духовке в течение 12-14 ч при температуре 60 ° C.
      Предупреждение: Неотвержденного смолы (жидкость) является канцерогенным и должны быть возвращены в духовке до тех пор, пока полностью закаленные.
   9. Поместите блок вертикально в плесени. Тщательно взять образцы из жидкой смолы, позволяют избытков смолы для слива и поместите образец на верхней части блока. Небольшое количество дополнительных смолы может использоваться для связывания образца на блок.
   10. Метка блока. Печать бумажных этикеток и вставлять его в блоке или прикрепить его к грани блока.
   11. Держите плесень с встроенных блоков в духовке в течение 12-14 ч при температуре 60 ° C.
   12. Магазин образец блока в чистый конверт. Это может храниться таким образом, в течение нескольких месяцев до года.
   13. Оставьте используются контейнеры, Грязные Перчатки и других загрязненных оборудование в Зонта разрешить ацетона не испарится полностью (минимум 12 ч).
   14. Прежде чем выбросить располагаемого оборудования или выскабливание смолы от других элементов, таких как щипцы вылечить смолы в духовке.
3. Секционирование
   1. Наблюдать за блок под микроскопом рассечения, чтобы обеспечить, что ориентация образца является подходящим для секущей плоскости.
   2. Если ориентация не подходит, используйте ювелирной увидел вырезать образца и переориентировать с использованием фрагментов набора смолы и свежей смолы для повторного сиденья образца. Руководитель также может быть разбит на две половинки в раздел два глаза отдельно. Вылечить смолы прежде чем снова.
   3. Смонтируйте блок на съемных микротом Чак. Снимите патрон и поместите держатель.
   4. Трим смолы блока с помощью лезвия бритвы под микроскопом рассечения.
      Предупреждение: Не это, когда Чак монтируется на микротом руку, как он может толчка руки и повреждения подшипников.
   5. Перемонтировать Чак на руку микротома и угол образца.
   6. Установите нож на держателе на соответствующий угол (0° для стекла ножи, см инструкции производителя алмазов ножи).
      Примечание: Стекла ножи можно сделать дешевле с нож maker стекла, но должны быть заменены периодически, как они теряют свои края; высокое качество алмазов ножи могут быть приобретены но дорого, требуют особого ухода и не подходит для начинающих.
   7. Заполните лодки нож с дистиллированной водой, с помощью шприца с фильтром (0,45 мкм поры).
   8. Заполните лодку до тех пор, пока уровень воды достигает края ножа; в других областях лодки может быть выпуклой мениска.
   9. Слейте воду лодку до тех пор, пока мениска очень слегка вогнутой, но по-прежнему достигает края ножа. Уровень воды может быть скорректирована в любой момент, но всегда от края ножа.
   10. Тщательно принести нож к образца и выравнивание блока к ножу. Лучше всего это делается, медленно, периодически проверяя близость нож через окуляр и со стороны.
       Примечание: Проверьте инструмент руководства для получения инструкций, как инструменты различаются.
   11. Установка толщины среза на микротома. Выбор правильной толщины будет зависеть размер образца, регион интереса и вида нож используется.
   12. Если с помощью ножа стекла выберите более высокое значение (например, 4 мкм), если много материала необходимо отрезать до достижения области интересов. Если используется Алмазный нож или если образец очень мала, 1-2 мкм может быть более подходящим.
   13. Начало «резки» (сгибать колеса микротом), когда рядом нож, но еще не резки в образец для выполнения последней частью подхода. Секции должны начать появляться в течение нескольких ротаций; Если нет, то остановите и очень тщательно принести нож чуть ближе.
   14. Настроить раздел сбора толщина (1 мкм для полутонкая секции) при приближении к области интереса.
   15. Собирайте любые разделы, с помощью средства для ресниц.
       Примечание: Ресницы инструменты могут быть сделаны с ресниц смонтированы на тонкой палки с лаком.
   16. Если необходимо удалить большое количество материала, позволяют разделов накапливаться и массово удалить, удалив нож и очищать его с водой. При использовании стекла нож, это может быть подходящее время, чтобы изменить для свежих часть ножа или новый нож.
   17. Место серии мелких капель дистиллированной воды на слайде с помощью пипетки Пастера, или в идеале фильтр оснащены шприц.
   18. Тщательно плавать разделе собраны на ресницы на капли воды.
   19. Соберите такие разделы, как это до тех пор, пока это целесообразно проверить глубину секционирование.
       Примечание: Хотя это может быть утомительно, это всегда лучше, чтобы проверить часто.
   20. Поместите слайд на конфорку, равным 60 ° C. Разрешить все воды испаряются и секции присоединиться к слайду.
   21. Краситель секции с толуидиновый синий для 10-60 s (окрашивание время зависит толщина среза). Отказаться от краски с помощью шприца с фильтром (как выше).
   22. Поместите каплю красителя на одном конце слайда и распространять его с помощью на стороне иглы без прикосновения или выскабливание разделы. Место слайда на конфорку для приблизительно 10-20 лет.
   23. Промойте слайд, поливая ее с дистиллированной водой в бутылке мыть и поместите его на горячей плите высушить его.
   24. Проверить под микроскопом соединения и их изображения.
   25. Повторяйте, пока не достигли области интереса.
   26. Для ультра-тонких секций: задать толщину резки между 40-60 Нм для сбора ТЕА секций.
   27. Вырезать о 3-5 секций и проверки толщины с помощью вмешательства цвет диаграммы. Секции должны отражать светло-серого цвета при просмотре под углом.
       Примечание: Хлороформ паров может накапаны через разделы для отдыха любого складки. Это наиболее актуально для опытных пользователей и новичков, не нужно беспокоиться. Слишком много хлороформ, выпущен слишком близко к разделу может повредить секций.
   28. Подберите сетку Formvar покрытием, медь, слот, проведены с щипцы с Formvar стороной. Будьте осторожны, чтобы не прокола Formvar покрытие.
   29. DIP сетки в лодку боком и от разделов, затем переведите сетке вверх параллельно поверхности по разделам. При необходимости используйте ресниц для руководства в разделах по сетке.
   30. Осторожно тыкать вокруг кончика щипцы с фильтровальной бумаги чтобы впитывать воду в ловушке между ветвями. Если это не сделано, воды напряженность может подтянуть сетки между оружия или сделать его придерживаться одной стороны. Это может привести к загрязнению или механического повреждения.
   31. Осторожно удалите лишнюю воду из сетки, сам, стоя сетки боком на фильтровальную бумагу.
   32. Поместите сетку в держателем сетки.
   33. Повторяйте, пока не собрано достаточно секции.
   34. Полутонкая секций может быть imaged непосредственно с любой составной микроскоп оснащен камерой. Масло иммерсионное могут быть размещены непосредственно на разделы. Слайды должны храниться в поле слайд для предотвращения обесцвечивания.
4. Пятнать ультратонкий секции для контраста, ТЕА
   Примечание: Следующие шаги должны осуществляться под прикрытием как красители и свет и CO₂ чувствительной. Кроме того EM красителей используют тяжелых металлов для контраста и поэтому опасных веществ. Надлежащего ухода должны приниматься при обработке этих пятен.
   1. Охватывать несколько крупных Петри с алюминиевой фольгой, чтобы блокировать свет. Работа по ним для следующих шагов. Частично раскройте им позволить рабочее пространство, но как можно скорее накройте одеялом.
   2. Вырезать кусок воска фильма и тщательно место пять капель 6% насыщенных уранила ацетата на него с помощью пипетки Пастера.
      1. Для приготовления раствора, смешать 2 g уранила ацетата 100 мл 50% метанола в дистиллированной воде и фильтровать решение перед использованием. Решение не может быть сохранен и следует свежий каждый раз¹⁹.
   3. Тщательно подобрать ТЕА сетки с щипцами и баланс на вершине капельки краски с раздела стороной вниз. Отпуск за 25 мин.
   4. Промойте решетки индивидуально погружением их быстро и из дистиллированной воды; прогресс через четыре различных ампул дистиллированной воды.
   5. Место пять капель цитрата свинца на свежий кусок пленки. Организовать несколько NaOH гранул вокруг капель краски (это поглощает атмосферные CO₂ для предотвращения осаждения карбонат свинца).
      1. Для того чтобы привести цитрата, подготовьте би дистиллированной воды кипящей дистиллированной водой для 0,5 ч. разрешить воды для охлаждения и в контейнер под запайку, добавить цитрат свинец 0,3 г в 100 мл би дистиллированной воды. Добавьте 1 mL 10 M NaOH, печать контейнер плотно и встряхнуть до растворенного¹⁹.
   6. Место сетки на капли краски, как описано в разделе 4.3 и крышку. Пятно на 5 мин.
   7. Промыть в дистиллированной воде, как перед погружением сетки из дистиллированной воды 20 раз. Прогресс через три судна дистиллированной воды.
   8. Впитывать лишнюю воду с фильтровальной бумаги и позволяют сетки для просушки в поле Сетка.
   9. Изображение в ТЕА на низкой ускоряющего напряжения.

Результаты

Описанные здесь методы позволяют детальное изучение простые и составные глаза муравьев. Imaging спинной мнению головы, с использованием методов Микрофотография Z-стека позволяет получить обзор структуры зрительной системы (рис. 1). Это хорошая подготовка ...

Обсуждение

Набор методов, изложенных выше позволяют для эффективного расследования оптической системы муравьев и других насекомых. Эти методы сообщить наше понимание дискретизации, оптическая чувствительность и потенциальной поляризации чувствительность глаза изучается. Это знание обеспечив...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ant	Myrmecia midas
Stereomicroscope	Leica M205 FA
Sputter coater	Pro Sci Tech
Ethanol	Sigma Aldrich
Petri dish	ProSciTech
Dissecting microscope	Leica MZ6
Insect Pin	ProSciTech
Colourless nail polish	Non branded: from any cosmetic store
Glass slide	ProSciTech
Razor blade	ProSciTech
Foreceps	ProSciTech
Cover slip	ProSciTech
Compound microscope	Leica DM5000 B
Glutaraldehyde	Sigma Aldrich
Paraformalydehyde	Sigma Aldrich
Potassium Chloride (KCl)	Sigma Aldrich
di-Sodium Hydrogen phosphate (Na2HPO4)	Sigma Aldrich
Potassium di-Hydrogen Phosphate (KH2PO4)	Sigma Aldrich
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma Aldrich
Osmium tetroxide	Sigma Aldrich
Acetone	Sigma Aldrich
Araldite Epoxy Resin	Sigma Aldrich
Pasteur pipette	Sigma Aldrich
Toluidie Blue	Sigma Aldrich
Hotplate	Riechert HK120