התקן הדמיה חיה לטווח ארוך עבור משופרת מניפולציה ניסויית של הזחלים דג זברה

Summary

כתב יד זה מתאר את zWEDGI (דג זברה Wounding והתקן מלכודת צמיחה, הדמיה), אשר הוא מכשיר ממודר שנועדה אוריינט לרסן את הזחלים דג זברה. העיצוב מאפשרת חיתוך זנב ארוך טווח אוסף של תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ברזולוציה גבוהה של ריפוי הפצע והתחדשות.

Abstract

הזחל דג זברה היא אורגניזם מודל חשוב ביולוגיה התפתחותית וגם ריפוי הפצע. עוד יותר, הזחל דג זברה היא מערכת חיה דימות ברזולוציה מיקרוסקופיים התופעות ביולוגית דינאמית במרחב ובזמן עם רזולוציה הסלולר יקר. עם זאת, השיטה המסורתית של כימוס agarose עבור הדמיה חיה לטרפד פיתוח זחל, רקמות לצמיחה מחודשת. לכן, כתב יד זה מתאר את zWEDGI (דג זברה Wounding והתקן מלכודת צמיחה, הדמיה), אשר היה מיועד, מפוברק כהתקן פונקציונלית ממודר כדי להציב את הזחלים של מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה בזמן המתיר סנפיר סימטרית חיתוך בתוך המכשיר, הזנב ערככם עוקבות התפתחות וצמיחה re. התקן זה מאפשר ופצעו והדמיה לטווח ארוך תוך שמירה על יכולת הקיום. בהתחשב בכך כייר zWEDGI הוא 3D מודפס, ביכולת ההתאמה האישית של גיאומטריות שלה לעשות את זה בקלות שונה עבור יישומי הדמיה דג זברה מגוונות. יתר על כן, zWEDGI מציע שיתרונות רבים, כגון גישה הזחל במהלך ניסויים עבור ופצעו או היישום של ריאגנטים, הוקרב הכיוון של הזחלים מרובים עבור הדמיה יעיל, שימושית של המכשיר.

Introduction

יכולת ההתחדשות של דג זברה הזחלים רזבורה rerio להפוך אותם אורגניזם מודל אידיאלי בחינת הפצע התגובה, כמו גם לריפוי, לצמיחה מחודשת^1,2,3,4. גישה למערך של דג זברה מהונדס קווים ושקיפות של דג זברה אנטומיים נוספים לשפר את השירות שלהם ללימודי אין ויוו של הפצע התגובה לאירועים, כמו גם לתהליכי הרגנרציה וקהילותיהם⁴. חקר תהליכים ביולוגיים אלה באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה זריחה זמן לשגות ולכן תובע חיה הדמיה דג זברה התקן המאפשר תנועה מינימלית של הזחל דג זברה והיציבות גבוהה תוך שמירה על יכולת הקיום. . זה המפתח כי המכשיר מאפשר ופצעו יעיל בעת ריפוי, התחדשות להתרחש לא מושפע על ידי המכשיר

חיה הדמיה מייצב השיטה הרגילה הטבעה הזחל ב- agarose במהלך דימות בשידור חי מגבילה את הצמיחה, פצע התחדשות⁵ , עשוי להגדיל את שיעורי התמותה מאז מתחילים הזחלים להראות סימן לב לב מתח, רקמת נמק אחרי 4 שעות⁴. לכן, הסרת agarose מאזורים עניין לעתים קרובות יש צורך לאפשר להתפתחות התקינה, התחדשות⁶, לחשוף את הזחלים נזק פוטנציאלי כמו agarose זה לחתוך. יתר על כן, עם agarose טכניקת הטבעה, המשתמש חייב אוריינט הזחלים בזמן הקצר לפני agarose עפור^5,6,7. במהירות מניפולציה הזחל לא רק דורש מיומנות של המשתמש, גם סיכון לפגיעה הזחל. למרות שיטות לייצב את הזחל עבור הדמיה חיה תוארו לעקוף חסרונות אלה, כמו אגר מחורץ בארות³ או divets⁸, שימוש סיליקון בוואקום משמנים ליצירת תא הדמיה עם צנרת PVC או אחרים חומרים⁶וסבב אבובים⁹, מרבית השיטות האלה הם עבודה אינטנסיבית, מבולגן, לעיתים קרובות ללא הניתן וגם לא מאפשרים מניפולציות סביבתיות (תרופות טיפולים, ופצעו וכו.) אחרי הדגים יש לטעון.

לכן, המכשיר zWEDGI (איור 1) תוכנן כדי להתגבר על חלק החסרונות של אגר הרכבה עבור הדמיה חיים לטווח ארוך של דג זברה הזחלים בזמן המתיר מניפולציה של הדגימה. ZWEDGI מורכב שלוש פתוח למחצה ממודר צ'יימברס (איור 1 א') כדי לאפשר טעינה, איפוק, ופצעו, הדמיה של 2-4 ימים לאחר ההפריה דג זברה הזחלים. המכשיר מפוברק מן Polydimethylsiloxane (PDMS), להציב על גבי בתגית כיסוי זכוכית 60 מ מ בתחתית צלחתי הדמיה. העיצוב המובאת כאן נועד ללימודי ריפוי הפצע, אולם השימוש העיצוב המודולרי וטכנולוגיות ייצור רגיל לעשות עיצוב zWEDGI לשינוי, נוטה מגוון פרוצדורות ניסיוני, במיוחד עבור שגרות זה מחייבים ריסון מינימלי עם מניפולציה ניסויית והדמיה לטווח ארוך.

Protocol

הערה: העיצוב zWEDGI הבסיס גובשה עבור הזחלים דג זברה 2-4 ימים לאחר ההפריה (dpf), עקוב אחר ההנחיות של מרכז המשאבים חיות מחקר באוניברסיטת ויסקונסין-מדיסון.

1. הדפסת תלת-ממד של תבניות ועיצוב

1. מודל PDMS רכיב של המכשיר עם הרצוי גיאומטריות ותכונות ב- 3D מידול תוכנה ⁵. ליצור הרכבה של תבנית ריקה ואת החלק PDMS וליצור תבנית שלילי עבור החלק PDMS על-ידי יצירת חלל ב כייר המתאים לחלק PDSM. לשמור את התבנית כקובץ .stl עבור הדפסת תלת-ממד ( איור 2, שלב 1.1).
   הערה: קובץ בתבנית (.stl) stereolithography של עיצוב כייר המובאת כאן ( איור 1) זמין להורדה בכתובת https://morgridge.org/designs/.
תבניות
2. הדפסה באמצעות מדפסת תלת-ממד photopolymer ( איור 2, שלב 1.2). להכין תבניות מרובות בהדפסה אחת, אם אפשר, אז יותר מהתקן אחד שאפשר לעצב עם אצווה בודדת של PDMS.
   הערה: הדוגמה המוצג הודפס במצב hi-res עם 0.075 ק מ מ קרן קוטר ו 0.05 מ"מ שכבת עובי, באמצעות שרף photopolymer ⁵.
   1. בתבניות נקי בעזרת מברשת בסדר, אלכוהול מפוגל בקבוק ספריי, ולאחר באוויר דחוס כדי לשפשף בעדינות ולהסיר שרף משומרים. להסיר כל חומר מן האזורים microchannel.
   2. פוסט-לרפא את תבניות מנגנון התרופה פוסט UV עבור 60 דקות בכל צד כפי היכנע משומרים רעיל דג זברה הזחלים ¹⁰.
3. חול לצד חלל התבנית עם נייר זכוכית 200 חצץ על משטח שטוח עד כל המשטחים איטום נמצאים נייר זכוכית (טעינת ערוץ גיאומטריות וההיקף עובש). בקלילות חול בנייר חצץ חול 400, 600, בהדרגה, כדי לייצר משטחים חלקים סומק על פני כל facings גיאומטריה ( איור 2, שלב 1.3). למדוד את העומק של החלל לאחר מלטש עם מחוון חיוג כדי לוודא כי זה קרוב העומק מעוצב.
   1. לנקות תבניות ולכסות דיסקים (בקוטר סנטימטר ¾ 1 x ¼ אינץ זכוכית בורוסיליקט עבה או אקריליק; כוס אחת לכסות לכל עובש) על-ידי הצבת קולי מלא מנקה במים למשך 30 דקות או על ידי שטיפה תחת מים זורמים.
   2. למצוץ יבש עם אוויר דחוס לנקות את שתי התבניות, מכסה עם אלכוהול איזופרופיל ואוויר דחוס מסוננים. השתמש ספסל נקי כמקום כדי לפברק את ההתקנים כדי למזער את הזיהום מפני פסולת באוויר. עזוב תבניות נקי ואת זכוכית מכסה הספסל נקי או מכוסה פטרי עד שהוא נדרש.

2. PDMS ייצור של מכשיר zWEDGI

1. להפוך PDMS על ידי שפיכת 184 סיליקון elastomer polydimethylsiloxane (PDMS) ביחס של 5:1 (בסיס activator) לתוך כוס פלסטיק. מערבבים היטב למשך 2 דקות עם מקל מעץ קרפט, תוך ערבוב את הג'ל על עצמה, כמו לישה לחם. לשימוש בתבניות 5, 10 גרם של בסיס ו- g 2 של מפעיל.
   1. דה-גז תערובת ב desiccator ואקום למשך 25-45 דקות עד כל הבועות נעלמו.
   2. למלא את חלל הבטן של כל התבניות מודפס 3D עם-0.75 מ ל PDMS בעזרת מזרק 10 מ"ל עד העובש מעט מלאה מניסקוס ( איור 2, שלב 2.1).
   3. דה-גז התבניות מלא למשך 45 דקות להסיר בועות נוספות שאולי נוצר בעת מילוי.
2. להחיל דיסק כיסוי זכוכית מעל כייר מלא PDMS, לוחץ את הדיסק בזווית כדי למנוע בועות מלהיות לכוד ( איור 2, שלב 2.2). לאפשר PDMS עודף להיות מגורש כפי בעטיפת הדיסק זכוכית מוחל.
3. שימוש קלאמפ רעשן קטן להחזיק את הדיסק כיסוי בחוזקה על העובש.
   הערה: זה יוצר משטח שטוח, ברגע PDMS נרפאה ומייצרת דרך חורים איפה גיאומטריות מודפס 3D מיושר עם תגית כיסוי זכוכית. לחלופין, כדי להגדיל את מספר התקנים יכולים להירפא בבת אחת, לבנות מכשיר מהדק מרובה (למשל. איור 2, שלב 2.3).
4. לרפא את המתקן PDMS התבניות בחוזקה-100 ^o C בתנור למשך 90 דקות ( איור 2, שלב 2.4). מוציאים את התבניות מהתנור, להתקרר עד שהם ניתן לטפל בקלות. אם ההתקן clamping מתכת, להסיר את מכלול דיסק עובש ולכסות המלחציים כדי למנוע ממשיכים לרפא את PDMS עקב חום שיורי המתכת.
   הערה: המכשיר היא הקלה ביותר להסרת העובש ואילו עדיין מעט חם לא נרפא לחלוטין. עם זאת, לאחר העובש יוסר מן התנור, התקליטור כיסוי יוסר, המכשיר יכול לשבת כמה ימים לפני שימשיך demolding. אם המכשיר הוא demolded זמן קצר לאחר הסרת מהתנור ריפוי, להניחו בצלחת פטרי מכוסה כדי למזער מזהמים בעוד הוא מאפשר לרפא לחלוטין.

3. פלזמה-מליטה zWEDGI על צלחת זכוכית

1. מהדק התבנית המכילה את המכשיר PDMS בתוך מלחציים ספסל כך העובש ' s גיאומטריות פונים למעלה, במקביל לספסל תחנת עבודה.
   1. התחלה כדי להסיר את ההתקן PDMS על ידי שחרור הכרטיסיה למשוך PDMS של העובש באמצעות פינצטה שקצהו שטוח. העבודה בהיקף של העובש עם הפינצטה (כמו הסרת עוגה מתוך מחבת ( איור 2, שלב 3.1)).
   2. שימוש סינון אוויר דחוס, פינצטה להוציא בעדינות את המכשיר מחוץ העובש על ידי מחזיק לשונית משיכה ונשף אוויר תחת המכשיר. לעבוד לאט, ומאפשר באוויר כדי לעזור נפרד PDMS של כייר, לוקח טיפול מיוחד עם קצות הפינצטה סביב הסעיפים המנהרה דק.
2. המקום את המכשיר PDMS במהופך על החלק הפנימי של השער של תבשיל bottomed זכוכית כך הפרוסות המנהרה הרחקה נוגעות הפלסטיק ( איור 2, שלב 3.2).
3. למקם את השער צלחת עם הפוך zWEDGI, המנה המתאימה של bottomed זכוכית פלזמה מנקה עם הזכוכית הפנימית פונה כלפי מעלה ( איור 2, שלב 3.3).
   1. לפנות פלזמה ניקוי החדר עד הלחץ מגיע 500 mTorr.
   צריכת חשמל גבוהה
   2. סט בתדר רדיו (RF). לחשוף את המכשיר ואת המנה לתדר RF עבור 2 דק לאט לחץ האוויר התא ולחזור המכשיר ואת המנה ברדס חדר נקי.
4. להסיר את ההתקן PDMS כיסוי המנה. נהפוך את zWEDGI PDMS לכיוון הנכון על הזכוכית על-ידי הצבת אותם בזהירות על המרכז טוב של המנה התחתון זכוכית ( איור 2, שלב 3.4)
   1. שימוש בקצה האחורי של הפינצטה, בקלילות לחץ כלפי מטה PDMS התקן כדי להבטיח בועות אוויר לא לכוד מתחת. הפעילו לחץ סביב גיאומטריות דקה הערוצים מיקרו, להחליק את PDMS את הקצוות ( איור 5C).
      הערה: קשר מלא בין PDMS את הזכוכית מבטיחה הדבקות טובה יותר מפלזמה מליטה. המכשיר zWEDGI ניתן פלזמה בונדד על גבי תבניות צלחת זכוכית עם תחתית אחרות, כגון זכוכית עם תחתית 6-ובכן plate ( איור 2C).
   2. מיקום כיסוי מעל המנה התקן לפני הסרת מהשכונה חדר נקי.
      הערה: לאחר המכשירים תוקנו לזכוכית, הפרוטוקול ניתן להשהות עד שיהיו מוכנים לשימוש.

4. ערוץ הכנה וזחלים טעינת

הערה: גידול כללי דג זברה נערך לכל דג זברה הספר, זמין באינטרנט ב- http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. דג זברה למבוגרים, העוברים היו נשמרים כפי שתואר לעיל ¹. המתח פראי סוג AB שימש. בצע את המוסד ’ s פרוטוקול טיפול בעלי חיים עבור הפרטים המדויקים בנוגע לדרישות הדמיה הזחלים בשידור חי-

1. יש לשטוף הערוצים עם מינימום של אתנול 70% 100 µL לכל ערוץ, באמצעות micropipette לשטוף דרך הרחקה מנהרה. הסר אתנול ולשטוף 2 או 3 פעמים עם מים מזוקקים כפול. לאפשר לאוויר יבש.
2. למלא את הערוצים עם חלב רזה (בריכוז 1% מדולל במים) למשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, כדי למזער את הדבקות של הזחלים coverslip זכוכית של המנה. ואז, בעדינות להטביע את המכשיר מספר פעמים ב זוגי מים מזוקקים לשטוף. לאפשר לאוויר יבש הפוך.
   הערה: פרוטוקול אפשר לעצור כאן. זו הכנה של המכשיר zWEDGI ניתן לעשות מספר ימים לפני השימוש. החנות מכוסה בטמפרטורת החדר.
3. הכן 1% ההיתוך לנקודת השפל (LMP) agarose על ידי שילוב 100 µL 2% נמס LMP agarose עם 100 µL 2 x Tricaine (0.4 מ"ג/מ"ל Tricaine - אתיל 3-aminobenzoate) ב- E3 מאגר ¹¹ מראש התחמם עד 38 ^o C. לשמור על 1% agarose/tricaine פתרון 38 ^o C בתוך גוש חם כדי למנוע ג'לי.
   הערה: מיקרוסקופ multiphoton ¹¹, להשתמש או דג זברה פיגמנט משולחים שאינם משתנים (כגון קספר ¹²) או לשמור על הזחלים ב- E3 המכיל 0.2 מ מ N-phenylthiourea כדי למנוע היווצרות פיגמנט ¹¹ למינימום קליטת ליד אורכי הגל האינפרא-אדום על-ידי הפיגמנט.
   התראה: N-phenylthiourea הוא רעיל. בצע את המוסד ' s כללים עבור סילוק.
הזחלים
4. Anesthetize ב E3 מאגר המכיל 0.2 מ"ג/מ"ל tricaine (Tricaine/E3) ¹¹. המתן עד הזחלים הם ללא תנועה לא מגיב לגירוי מגע.
5. רטוב מראש את הערוצים עם כמה microliters של Tricaine/E3.
   1. לבחור את זחל בודד באמצעות טיפ פיפטה דיזה רחב. להפקיד את הזחלים לתוך התעלה טעינה ( איור 3 א). באמצעות פיפטה עצה או כלי דומה, אוריינט הזחל בבית הבליעה הטעינה כך הצד הגבי פונה קצה ישר לתא הטעינה ואת פניהן הזנב לכיוון המנהרה הרחקה ( איור 3B).
   2. לסגת בקפידה נוזל מן החדר wounding, המאפשר הזחל לזרום לתוך המנהרה הרחקה ( איור 3C). הסר את רוב הנוזל תוך שמירה על לחות סביב הזחל ( דמות תלת-ממד). תהליך זה יכול להיות בסיוע הטיית המנה מעט לכיוון תא wounding.
6. מקום 1% LMP agarose Tricaine/E3 (~ 38 ^o C) מעל הזחל ' זה הראש, מילוי החדר טעינה ( איור 3E). לאפשר agarose לגבש עם הזחל במצב תקין. להוסיף Tricaine/E3 תא wounding לפי הצורך כדי לשמור על לחות. חזור על פעולה זו טוען תהליך ביתר הערוצים 2.
7. באמצעות מחט מזרק, הסר בזהירות את כל agarose אשר מחלחלים דרך המנהרה הרחקה אל החדר wounding ( איור 3F). הוסף tricaine נוספים/E3 אחד קצת יותר agarose (עבור ופצעו, הדמיה לטווח קצר, או פצע הטיפול בידוד) או כדי למלא את הצלחת תרבות (עבור הדמיה לטווח ארוך). החלף את המכסה מאכל תרבות כדי למנוע התאיידות. הזחלים ניתן עם תמונה בנקודה זו (unwounded) או פצועים.

5. הזחלים ופצעו, הדמיה

1. באמצעות להב האזמל סטרילי, transect סנפיר הזנב האחורי מיתר הגב ¹¹ בבית הבליעה wounding ( איור 3 G, H). להוסיף tricaine נוספים/E3 במידת הצורך ולהחליף את המכסה מאכל תרבות.
   הערה: לחלופין, בהתאם של חלון הזמן התפתחותית של עניין, הזחלים יכולים להיות פצועים, מותר להתאושש ב E3 ומתוחזק בתוך אינקובטור (28.5 ^o C) עד למועד ההדמיה הרצויה, באיזה שלב הם ניתן לטעון לתוך ערוצים כמו המתואר לעיל-
הוספה
2. להתקין ההתקן zWEDGI עם ומורדמת הזחלים על גבי מיקרוסקופ הפוכה בשלב אשר יוכל להכיל את הצלחת התחתונה של זכוכית 60 מ מ. אתר את הזנב של הזחל בתעלה העליונה ביותר, סיבוב המנה לפי הצורך כדי לקבל את הזנב במיקום הרצוי. תמונה כנדרש לניסוי מסוים.
   הערה: zWEDGI ישימה בהרחבה על מיקרוסקופ אור ברזולוציה גבוהה, כולל widefield פלורסצנטיות, סריקת מיקרוסקופ לייזר. ישנם מספר שיקולים פרמטר הדמיה הזחלים דג זברה, אך ספציפיות הדמיה הפרמטרים הם כלי, דוגמת הניסוי תלויות. כאן, זחל זנב היה עם תמונה של מבנה מותאם אישית מיקרוסקופ multiphoton ^{5 , 11} ניצול הפרמטרים הבאים: 40 X זמן עבודה מרחק מים טבילה אובייקטיבי, עירור 890 ננומטר לייזר, 445/20 ננומטר מסנן פליטה והרזולוציה 512 x 512.

6. סוף הניסוי

1. להסיר המנה zWEDGI של מיקרוסקופ. המתת חסד הזחלים על-ידי הצבת את zWEDGI או על אמבט מים קרים או בבית 4 ^o C למשך 20 דקות לפחות, ולגשת להיעדרות של פעימות הלב ומחזור הדם.
   הערה: מכיוון הזחלים נשמרים בתאים נפרדים, הזחלים ניתן בנפרד לשחזר בעדינות על ידי משיכה של אגר עם מלקחיים או פיפטה. ניתן להסיר את אגר אזור הראש, הזחל המשמש הליכים נוספים, כגון קיבוע של נוגדן מכתים או מעובד לחילוץ RNA או החלבון.
2. בעקבות ההסרה של הזחלים, אגר, לנקות את zWEDGI עם אתנול, מים מזוקקים, כפי שמתואר בשלב 4.1 והגדר הפוך אוויר יבש. החנות מכוסה במקום קריר, יבש. מעיל מחדש עם חלב רזה (שלב 4.2) כנדרש לפני השימוש הבא.
   הערה: zWEDGIs יכול להיות שימוש חוזר מספר פעמים, עד PDMS מתחילה לגמור הזכוכית.

תוצאות

ZWEDGI PDMS microfluidic המכשיר הוא מכשיר באופן פונקציונלי ממודר נועד להכיל ארבע פונקציות עיקריות (המפורטות להלן) המשויך הדמיה חיה של פין סימטרית ופצעו לריפוי, לצמיחה מחודשת של הזחלים דג זברה. PDMS נבחרה עבור ייצור zWEDGI כי זה לא רק זמינים, של תעשיית תקני עבור הביו, אלא גם עובד גם בתבניות...

Discussion

המטרה של המכשיר zWEDGI הוא לכידת תלת-ממד זמן לשגות הדמיה על ידי ייצוב המכוונת את הדגים בתוך המרחק עבודה קטן של מטרה מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה. תוך עמידה מפרטים אלה עיצוב, זה גם שיפור מעל המסורתית מבוססת אגר הכנה עבור הדמיה בשידור חי. ישנם שלושה שלבים קריטיים (להלן) בייצור של zWEDGI, אשר, אם לא נעשה ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabricate molds
Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software	Dassault Systemes	SPX0117-01	Fisher Unitech
Viper Si2 SLA 3D printer	3D Systems Inc.	23200-902	3D Systems Inc.
Accura 60 photopolymer resin	3D Systems Inc.	24075-902	3D Systems Inc.
denatured alcohol	Sunnyside	5613735	Menards
UV post cure apparatus	3D Systems Inc.	23363-101-00	3D Systems Inc.
TouchNTuff nitrile gloves	Ansell	92-600	McMaster Carr
220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper	Norton	66261139359, 54, 52	MSC
borosilicate glass disc, 2" diameter	McMaster-Carr	MIL-G-47033	McMaster-Carr
ultrasonicator cleaner	Branson	1510R-MTH
isopropyl rubbing alcohol 70%	Hydrox	54845T43	McMaster-Carr
10oz clear plastic cup	WNA Masterpiece	557405	Amazon
6"craft stick	Perfect Stix	Craft WTD-500	Amazon
Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabricate zWEDGI PDMS device
Sylgard 184 silicon elastomeric kit	Dow-Corning	4019862	Ellworth Adhesives
10mL syringe	Becton Dickinson	305219	Vitality Medical Inc
desiccator	Bel-Art Scienceware	F42027-0000	Amazon
4 in ratcheting bar clamp	Pittsburgh	68974	Harbor Freight
lab oven	Quincy Lab Inc.	20GC	Global Industrial
tweezer set	Aven	549825	McMaster-Carr
compressed air filtered nozzle	Innotech	TA-N2-2000FT	Cleanroom Supply
vacuum bench vise	Wilton Tool Group	63500	MSC Industrial
55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass	Cellvis	D60-30-1.5-N	Cellvis
plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001	Harrick Plasma
Name	Company	Catalog Number	Comments
Loading Larvae
Pipetteman, P200	Gilson	F123601
100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use)	Pharmco-aaper	111000200
Transfer pipette	Fisherbrand	13-711-5A	Fisher Scientific
powdered skim milk		2902887	MP Biomedicals
double distilled water
N-phenylthiorurea	Sigma-Aldrich	P7629	Sigma-Aldrich
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)		C-FINQ-UE	Western Chemical
low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A0701	Sigma-Aldrich
heat block (dry bath incubator)	Fisher Scientific	11-718-2	Fisher Scientific
E3 buffer
large orifice pipette tip, 200 uL	Fisherbrand	02-707-134	Fisher Scientific
General purpose pipette tip, 200 uL	Fisherbrand	21-197-8E	Fisher Scientific
#15 scalpel blade	Feather	2976	Amazon
25G syringe needle	BD	BD305122	Fisher Scientific
Name	Company	Catalog Number	Comments
Imaging
inverted microscope
Imaris imaging software	Bitplane