Dispositivo di Imaging dal vivo a lungo termine per una migliore manipolazione sperimentale delle larve di Zebrafish

Riepilogo

Questo manoscritto descrive la zWEDGI (zebrafish ferire e dispositivo di allettamento per la crescita e la formazione immagine), che è un dispositivo compartimenti progettato per orientare e trattenere le larve di zebrafish. Il design permette di coda transection e a lungo termine raccolta di immagini di microscopia fluorescente ad alta risoluzione di guarigione delle ferite e la rigenerazione.

Abstract

La larva di pesce zebra è un importante organismo modello per biologia inerente allo sviluppo e per la guarigione della ferita. Ulteriormente, la larva di pesce zebra è un prezioso sistema per live imaging ad alta risoluzione microscopica di fenomeni biologici dinamici nello spazio e nel tempo con cellulare ad alta risoluzione. Tuttavia, il metodo tradizionale di incapsulamento di agarosio per live imaging può ostacolare lo sviluppo larvale e la ricrescita del tessuto. Di conseguenza, questo manoscritto descrive la zWEDGI (zebrafish ferire e dispositivo di allettamento per la crescita e la formazione immagine), che è stato progettato e fabbricato come un dispositivo funzionalmente suddiviso in compartimenti per orientare le larve per microscopia ad alta risoluzione permettendo transection pinna caudale all'interno del dispositivo e lo sviluppo successivo coda sfrenato e ricrescita. Questo dispositivo permette di ferimento e a lungo termine imaging mantenendo attuabilità. Dato che la muffa di zWEDGI è stampato in 3D, la possibilità di personalizzazione delle sue geometrie lo rendono facilmente modificati per applicazioni di imaging di zebrafish diversificata. Inoltre, il zWEDGI offre che numerosi vantaggi, quali l'accesso alla larva durante la sperimentazione per ferire o per l'applicazione dei reagenti, parallelo orientamento delle larve multiple per l'imaging snella e riusabilità del dispositivo.

Introduzione

La capacità rigenerativa delle larve di zebrafish rerio del Danio li rendono un organismo modello ideale per esaminare la risposta di ferita così come la guarigione e la ricrescita^1,2,3,4. Accesso a una serie di linee di zebrafish transgenici e trasparenza anatomica di zebrafish ulteriormente migliorare la loro utilità per gli studi in vivo di ferita risposta eventi, nonché a più lungo termine i processi rigenerativi⁴. Studio di questi processi biologici mediante microscopia a fluorescenza ad alta risoluzione di time-lapse pertanto richiede un dispositivo di zebrafish imaging live che consente un'elevata stabilità e minimo movimento della larva zebrafish mantenendo attuabilità. È fondamentale che il dispositivo consente ferendo efficace durante la guarigione e rigenerazione verificarsi inalterato dal dispositivo.

Il metodo di stabilizzazione imaging live standard di incorporare la larva in agarosio durante la formazione immagine diretta limita la crescita e rigenerazione⁵ di ferita e può aumentare i tassi di mortalità, poiché le larve iniziano a mostrare il segno di necrosi cardiaca lo stress ed il tessuto dopo quattro ore⁴. Di conseguenza, rimozione di agarosio da regioni di interesse è spesso necessario per consentire il normale sviluppo e rigenerazione⁶, esponendo le larve alla potenziale danno come l'agarosio è tagliata via. Inoltre, con l'agarosio incorporamento tecnica, l'utente deve orientare le larve nel breve tempo prima l'agarosio si solidifica^5,6,7. Rapidamente, manipolando la larva richiede non solo abilità dell'utente, si rischia anche di danni alla larva. Anche se sono stati descritti metodi per stabilizzare la larva per live imaging per ovviare a questi inconvenienti, come agar increspata pozzi³ o divets⁸, l'uso del vuoto in silicone ungere per creare una camera di imaging con tubazioni in PVC o altro materiali⁶e rotazione della tubazione⁹, molti di questi metodi sono labor intensive, disordinato, spesso non riutilizzabili e non consentono per manipolazione ambientale (trattamenti, ferimento di droga ecc.) dopo il pesce è stato montato.

Di conseguenza, il dispositivo zWEDGI (Figura 1) è stato progettato per superare alcuni degli svantaggi di agar di montaggio per l'imaging dal vivo a lungo termine delle larve di zebrafish pur consentendo la manipolazione del campione. Il zWEDGI è costituito da tre alloggiamenti compartimenti semi-aperte (Figura 1A) per consentire per caricamento, moderazione, ferendo e imaging delle larve di zebrafish post-fertilizzazione di 2-4 giorni. Il dispositivo è fabbricato da polidimetilsilossano (PDMS) e inserito il vetrino coprioggetto di un imaging piatto fondo vetro 60 mm. Il progetto qui presentato è stato inteso per gli studi di guarigione della ferita, tuttavia l'uso di un design modulare e tecnologie di fabbricazione standard rendono il design di zWEDGI modificabile e suscettibili di una varietà di procedure sperimentali, soprattutto per le procedure che richiede minima moderazione con manipolazione sperimentale e la formazione immagine a lungo termine.

Protocollo

Nota: il disegno di base zWEDGI è stato formulato per le larve di zebrafish che sono post-fertilizzazione di 2-4 giorni (dpf) e seguono le linee guida del centro risorse animali ricerca Università del Wisconsin-Madison.

1. design e stampa 3D di stampi

1. modello il PDMS componente del dispositivo con geometrie desiderate e attributi in un software ⁵ di modellazione 3D. Creare un assembly di uno stampo in bianco e la parte PDMS e generare uno stampo negativo per la parte PDMS creando una cavità nello stampo corrispondente alla parte PDSM. Salvare la muffa come un file. STL per la stampa 3D ( Figura 2, passaggio 1.1).
   Nota: Un file di formato (. STL) stereolitografia della progettazione dello stampo qui presentato ( Figura 1) è disponibile per il download a https://morgridge.org/designs/.
2. Stampa stampi utilizzando una stampante 3D di fotopolimero ( Figura 2, punto 1.2). Fare stampi multipli in una sola stampa, se possibile, così più di un dispositivo può essere modellato con una singola partita di PDMS.
   Nota: Nell'esempio mostrato è stato stampato in modalità Hi-Res con un 0,075 mm larghezza diametro e 0,05 mm spessore dello strato, utilizzando fotopolimero resina ⁵.
   1. Stampi pulita utilizzando un pennello fine, alcool denaturato in un flacone spray e aria compressa a delicatamente la macchia e rimuovere la resina non polimerizzata. Rimuovere qualsiasi materiale dalle regioni microchannel.
   2. Post-curare gli stampi in un apparato di cura post UV per 60 minuti su ogni lato, come le dimissioni non polimerizzata sono tossica per le larve di zebrafish ¹⁰.
3. Lato cavità dello stampo con carta abrasiva di grana 200 su una superficie piana di sabbia fino a quando tutte le superfici di tenuta sono a contatto con la carta vetrata (caricamento canale geometrie e perimetro di muffa). Raschiare leggermente con carta abrasiva sabbia 400 e 600, progressivamente, per produrre superfici a filo lisce in tutti i rivestimenti di geometria ( Figura 2, passaggio 1.3). Misurare la profondità della cavità dopo la levigatura con un comparatore per verificare che si trova vicino la profondità progettata.
   1. Pulire stampi e Covers (1 ¾ di pollice di diametro x spessore vetro di borosilicato ¼ di pollice o acrilico; un vetro coprire per muffa), inserendo in un ultrasuoni pulitore riempito d'acqua per 30 minuti o tramite risciacquo sotto l'acqua corrente.
   2. Asciugare con aria compressa e pulire entrambi gli stampi e copertine con alcol isopropilico e aria compressa filtrata. Utilizzare un banco pulito come un posto per fabbricare i dispositivi per ridurre al minimo la contaminazione da detriti nell'aria. Lasciare gli stampi puliti e vetro copre il banco pulito o una capsula di Petri coperto fino a quando necessario.

2. PDMS fabbricazione di dispositivo zWEDGI

1. marca il PDMS da 184 versando in silicone elastomero polidimetilsilossano (PDMS) con un rapporto di 5:1 (base di attivatore) in un bicchiere di plastica. Mescolare bene per 2 min con un bastone di legno del mestiere, mescolando il gel sopra su se stesso, come impastare il pane. Per 5 stampi, usare 10 g di base e 2 g di attivatore.
   1. De-gas miscela in un essiccatore sotto vuoto per 25-45 min fino a quando tutte le bolle sono andate.
   2. Riempire la cavità di ciascuno degli stampi 3D stampati con circa 0,75 mL di PDMS utilizzando una siringa da 10mL, fino a quando lo stampo leggermente trabocca di un menisco ( Figura 2, punto 2.1).
   3. De-gas riempiti stampi per 45 min rimuovere ulteriori bolle formatesi durante la compilazione.
2. Applicare un disco di copertura di vetro sopra la muffa PDMS-riempita, premendo il disco ad un angolo per evitare che le bolle vengano intrappolati ( Figura 2, punto 2.2). Consentire PDMS in eccesso essere espulso come il coperchio di vetro viene applicato.
Morsetto a cricchetto piccolo
3. uso per tenere il disco di copertura strettamente allo stampo.
   Nota: Questo crea una superficie piana, una volta il PDMS è guarito e produce attraverso i fori dove le geometrie 3D stampate sono a filo con lo slittamento del coperchio di vetro. In alternativa, per aumentare il numero di dispositivi che possono essere curate in una sola volta, costruire un dispositivo multi-clamp (ad es. Figura 2, punto 2.3).
4. Curare il dispositivo PDMS negli stampi fissati a 100 ^o C in un forno per 90 min ( Figura 2, punto 2.4). Togliere gli stampi dal forno e lasciarlo raffreddare fino a quando possono essere facilmente gestiti. Se il dispositivo di bloccaggio è in metallo, rimuovere il gruppo di disco di stampo e coperchio dal morsetto per impedire che il metallo continuando a curare il PDMS a causa del calore residuo.
   Nota: Il dispositivo è più facile da rimuovere dallo stampo mentre ancora leggermente caldo e non completamente curato. Tuttavia, una volta che la muffa è rimosso dal forno e viene rimosso il disco di copertura, il dispositivo può sedersi per un paio di giorni prima di procedere alla sformatura. Se il dispositivo è Estarre poco dopo la rimozione dal forno di trattamento, metterlo in un piatto coperto di petri per minimizzare contaminanti consentendole di curare completamente.

3. ZWEDGI al plasma-incollaggio vetro piatto

1. morsetto lo stampo contenente il dispositivo PDMS in una morsa da banco affinché lo stampo ' geometrie s stanno affrontando fino, in parallelo al banco della stazione di lavoro.
   1. Start per rimuovere la periferica PDMS rilasciando la linguetta di estrazione PDMS dallo stampo con pinzette a punta piatta. Lavoro intorno al perimetro dello stampo con le pinzette (come la rimozione di una torta fuori una padella ( Figura 2, punto 3.1)).
   2. Utilizzare filtrato aria compressa e pinzette per estrarre delicatamente il dispositivo dallo stampo di trattenendo la linguetta di estrazione e soffiando aria sotto il dispositivo. Lavorare lentamente, permettendo all'aria di aiutare separato il PDMS dallo stampo, prestando particolare cura con la punta delle pinzette intorno alle sezioni sottili tunnel.
2. Posizionare il dispositivo PDMS upside-down sulla parte interna della copertina di un piatto di vetro a fondo affinché i cunei di tunnel trattenente stanno toccando la plastica ( Figura 2, punto 3.2).
3. Inserire il coperchio piatto con zWEDGI a testa in giù e il corrispondente piatto con fondo di vetro in un plasma cleaner con il vetro interno rivolto verso l'alto ( Figura 2, punto 3.3).
   1. Evacuare il plasma pulizia camera fino a quando la pressione raggiunge 500 mTorr.
   2. Set di radio frequenza (RF) potere di alta. Esporre il dispositivo e il piatto alla frequenza di RF per circa 2 min lentamente de-pressurizzare la camera e tornare il dispositivo e il piatto di un cappuccio di camera pulita.
4. Rimuovere il dispositivo PDMS dalla parabola di copertura. Capovolgere il PDMS zWEDGI nell'orientamento corretto sul vetro posizionandolo con cura sul centro bene del piatto di fondo di vetro ( Figura 2, punto 3.4)
   1. utilizzando il back-end delle pinzette, premete leggermente il il PDMS dispositivo per garantire le bolle d'aria non sono intrappolati sotto. Applicare la pressione intorno al minuto geometrie dei canali micro e appianare il PDMS ai bordi ( Figura 5).
      Nota: Contatto completo tra il vetro e il PDMS garantisce maggiore aderenza da incollaggio al plasma. Il dispositivo di zWEDGI può essere al plasma legato su altri formati di piatto col fondo di vetro, come un plat 6 pozzetti col fondo di vetroe ( Figura 2).
   2. Mettere un coperchio sopra il piatto di dispositivo prima di togliere il cappuccio di camera pulita.
      Nota: Una volta che i dispositivi sono stati fissati al vetro, il protocollo può essere sospesa fino a quando non sono pronti per l'uso.

4. Canale preparazione e caricamento delle larve

Nota: generale zebrafish zootecnica è stata condotta per il libro di Zebrafish, disponibile online presso http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Embrioni e zebrafish adulto sono stati mantenuti come descritto in precedenza ¹. È stato utilizzato il ceppo selvaggio tipo AB. Seguire l'istituzione ’ s protocollo di cura degli animali per le specifiche riguardanti i requisiti per l'imaging di larve vive.

1. Risciacquo i canali con un minimo di etanolo al 70% 100 µ l per ogni canale, utilizzando una micropipetta sciacqui il contenimento del tunnel. Rimuovere l'etanolo e risciacquo 2 o 3 volte con acqua distillata doppia. Lasciare asciugare all'aria.
2. Riempire i canali con latte scremato (ad una concentrazione di 1% diluito in acqua) per 10 min a temperatura ambiente per ridurre al minimo l'aderenza delle larve al vetrino coprioggetti del piatto. Poi, delicatamente immergere il dispositivo più volte in doppia acqua distillata per risciacquare. Asciugare all'aria sottosopra.
   Nota: Protocollo può essere messo in pausa qui. Questa preparazione del dispositivo di zWEDGI può essere fatto parecchi giorni prima di utilizzare. Archivio coperto a temperatura ambiente.
3. Preparare 1% punto di fusione basso dell'agarosi (LMP) combinando 100 µ l 2% sciolto LMP agarosio con 100 µ l 2 x Tricaine (0,4 mg/mL tricaina - aminobenzoate dell'etile 3) nella E3 buffer ¹¹ pre-riscaldato a 38 ^o C. mantenere l'1% soluzione di agarosio/tricaina a 38 ^o C in un blocco caldo per prevenire gelificante.
   Nota: Per microscopia multifotonica ¹¹, utilizzare entrambi varianti non-pigmentate zebrafish (come casper ¹²) o mantenere le larve in E3 contenente 0,2 mM N-feniltiourea per impedire la formazione di pigmento ¹¹ per minimizzare l'assorbimento di lunghezze d'onda infrarosse vicino dal pigmento.
   Attenzione: N-feniltiourea è tossico. Seguire l'istituzione ' regole per lo smaltimento di s.
Larve di
4. Anesthetize in E3 tampone contenente 0,2 mg/mL tricaina (tricaina/E3) ¹¹. Attendere fino a quando le larve sono immobili e non risponde ad uno stimolo di tocco.
5. Pre-bagnato i canali con pochi microlitri di tricaina/E3.
   1. Pick su una singola larva utilizzando un puntale ampia orifizio. Depositare le larve nel canale di carico ( Figura 3A). Utilizzando una pipetta o attrezzo simile, orientare la larva nel vano di carico, tale che il lato dorsale verso il bordo dritto della camera di carico e le facce di coda verso il tunnel restrittivo ( Figura 3B).
   2. Estrarre delicatamente il liquido dalla camera di ferimento, permettendo la larva di fluire nel tunnel restrittivo ( Figura 3). Rimuovere la maggior parte del liquido, mantenendo l'umidità intorno la larva ( Figura 3D). Questo processo può essere aiutato inclinando il piatto leggermente verso la camera di ferimento.
6. Posto LMP agarosio all'1% in tricaina/E3 (~ 38 ^o C) sopra la larva ' testa s, riempimento della camera di carico ( Figura 3E). Consentire l'agarosio solidificare con la larva nella posizione corretta. Aggiungere tricaina/E3 alla camera ferentesi come necessario per mantenere l'idratazione. Ripetere questo processo per i restanti 2 canali di caricamento.
7. Utilizzando un ago di siringa, rimuovere con cura qualsiasi agarosio che filtrava attraverso il tunnel restrittivo nella camera di ferimento ( Figura 3F). Aggiungere ulteriori tricaina/E3 o appena sopra l'agarosio (per il ferimento, la formazione immagine a breve termine o ferita trattamento isolamento) o per riempire il piatto di cultura (per l'imaging a lungo termine). Sostituire il coperchio piatto cultura per evitare l'evaporazione. Le larve possono essere imaged a questo punto (i) o ferite.

5. Larve di ferimento e Imaging

1. usando un bisturi sterile, transetto la pinna di coda posteriore per la notocorda ¹¹ nella camera di ferimento ( Figura 3 G, H). Se necessario, aggiungere ulteriori tricaina/E3 e sostituire il coperchio piatto cultura.
   Nota: In alternativa, a seconda della finestra dello sviluppo temporale di interesse, larve possono essere ferite, consentite di recuperare in E3 e mantenute in un incubatore (28,5 ^o C) fino al momento di formazione immagine desiderato, al punto che essi possono essere caricati in canali come descritto in precedenza.
2. Installare il dispositivo zWEDGI con anestetizzate larve su un microscopio invertito in un inserto di stadio che ospiterà il piatto di fondo di vetro 60 mm. Individuare la coda della larva nel canale più in alto, ruotando il piatto come necessaria per ottenere la coda nella posizione desiderata. Immagine come richiesto per l'esperimento specifico.
   Nota: Il zWEDGI è ampiamente applicabile per microscopia ad alta risoluzione, tra cui widefield fluorescenza e microscopia a scansione laser. Ci sono una serie di considerazioni di parametro quando imaging larve di zebrafish, ma specifici parametri di imaging sono strumento, campione ed esperimento dipendente. Qui, la coda larvale era imaged su una compilazione personalizzata multifotonica microscopio ^{5 , 11}, utilizzando i seguenti parametri: 40 X lungo lavoro distanza acqua obiettivo a immersione, 890 nm laser di eccitazione, filtro di emissione di 445/20 nm e risoluzione di 512 x 512.

6. Fine dell'esperimento

1. rimuovere il piatto zWEDGI da microscopio. Le larve di eutanasia inserendo il zWEDGI acqua e ghiaccio o su 4 ^o C per almeno 20 min e valutare per assenza di battito cardiaco e la circolazione.
   Nota: Poiché le larve sono mantenute in compartimenti separati, le larve possono essere singolarmente recuperate tirando delicatamente l'agar con forcipe o pipetta. L'agar può essere rimosso dalla regione della testa e la larva utilizzato per le procedure supplementari, come la fissazione per la macchiatura dell'anticorpo o trattati per l'estrazione di RNA o proteine.
2. a seguito di rimozione delle larve e agar, pulire il zWEDGI con etanolo e acqua distillata, come descritto al punto 4.1 e impostare capovolto all'aria secca. Archivio coperto in un luogo fresco e asciutto. Riverniciare con latte scremato (passo 4.2) come necessario prima dell'uso successivo.
   Nota: zWEDGIs può essere riutilizzato più volte, fino a quando il PDMS comincia a staccarsi il vetro.

Risultati

Il dispositivo di microfluidica PDMS zWEDGI è un dispositivo funzionalmente suddiviso in compartimenti, progettato per ospitare quattro funzioni principali (elencate sotto) connesse con formazione immagine dal vivo della pinna caudale, ferendo la guarigione e la ricrescita nelle larve di zebrafish. PDMS è stato scelto per la fabbricazione di zWEDGI, perché non solo è prontamente disponibile e uno standard industriale per la biocompatibilità, ma funziona bene in stampi anche. Inoltre,...

Discussione

Lo scopo del dispositivo zWEDGI è quello di catturare il lasso di tempo 3D imaging stabilizzando e orientare il pesce dentro la piccola distanza di lavoro di un obiettivo del microscopio ad alta risoluzione. Durante l'incontro di queste specifiche di progettazione, è anche un miglioramento rispetto tradizionale preparazione a base di agar per imaging dal vivo. Ci sono tre fasi critiche (sotto) nella fabbricazione di zWEDGI, che, se non eseguite correttamente, possono provocare dispositivi difettosi:

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabricate molds
Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software	Dassault Systemes	SPX0117-01	Fisher Unitech
Viper Si2 SLA 3D printer	3D Systems Inc.	23200-902	3D Systems Inc.
Accura 60 photopolymer resin	3D Systems Inc.	24075-902	3D Systems Inc.
denatured alcohol	Sunnyside	5613735	Menards
UV post cure apparatus	3D Systems Inc.	23363-101-00	3D Systems Inc.
TouchNTuff nitrile gloves	Ansell	92-600	McMaster Carr
220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper	Norton	66261139359, 54, 52	MSC
borosilicate glass disc, 2" diameter	McMaster-Carr	MIL-G-47033	McMaster-Carr
ultrasonicator cleaner	Branson	1510R-MTH
isopropyl rubbing alcohol 70%	Hydrox	54845T43	McMaster-Carr
10oz clear plastic cup	WNA Masterpiece	557405	Amazon
6"craft stick	Perfect Stix	Craft WTD-500	Amazon
Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabricate zWEDGI PDMS device
Sylgard 184 silicon elastomeric kit	Dow-Corning	4019862	Ellworth Adhesives
10mL syringe	Becton Dickinson	305219	Vitality Medical Inc
desiccator	Bel-Art Scienceware	F42027-0000	Amazon
4 in ratcheting bar clamp	Pittsburgh	68974	Harbor Freight
lab oven	Quincy Lab Inc.	20GC	Global Industrial
tweezer set	Aven	549825	McMaster-Carr
compressed air filtered nozzle	Innotech	TA-N2-2000FT	Cleanroom Supply
vacuum bench vise	Wilton Tool Group	63500	MSC Industrial
55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass	Cellvis	D60-30-1.5-N	Cellvis
plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001	Harrick Plasma
Name	Company	Catalog Number	Comments
Loading Larvae
Pipetteman, P200	Gilson	F123601
100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use)	Pharmco-aaper	111000200
Transfer pipette	Fisherbrand	13-711-5A	Fisher Scientific
powdered skim milk		2902887	MP Biomedicals
double distilled water
N-phenylthiorurea	Sigma-Aldrich	P7629	Sigma-Aldrich
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)		C-FINQ-UE	Western Chemical
low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A0701	Sigma-Aldrich
heat block (dry bath incubator)	Fisher Scientific	11-718-2	Fisher Scientific
E3 buffer
large orifice pipette tip, 200 uL	Fisherbrand	02-707-134	Fisher Scientific
General purpose pipette tip, 200 uL	Fisherbrand	21-197-8E	Fisher Scientific
#15 scalpel blade	Feather	2976	Amazon
25G syringe needle	BD	BD305122	Fisher Scientific
Name	Company	Catalog Number	Comments
Imaging
inverted microscope
Imaris imaging software	Bitplane