Langfristige Live Imaging-Gerät für verbesserte experimentelle Manipulation von Zebrafischlarven

Zusammenfassung

Dieses Manuskript beschreibt die zWEDGI (Zebrafisch daraus und verlockende Falle Gerät für Wachstum und Imaging), die ist ein unterteilte Gerät zu orientieren und zurückhalten Zebrafischlarven. Das Design erlaubt Schweif Durchtrennung und langfristige Sammlung von hochauflösender Fluoreszenz-Mikroskopie-Bildern der Wundheilung und Regeneration.

Zusammenfassung

Der Zebrafisch-Larven ist ein wichtiger Modellorganismus für Entwicklungsbiologie und Wundheilung. Darüber hinaus ist der Zebrafisch-Larven ein wertvolles System für live hochauflösende mikroskopische Aufnahmen von dynamischen biologischen Phänomene in Raum und Zeit mit zellulären Auflösung. Jedoch kann die traditionelle Methode der Agarose Kapselung für live Imaging Larvalentwicklung und Gewebe nachwachsen behindern. Daher beschreibt die Handschrift der zWEDGI (Zebrafisch daraus und verlockende Falle Gerät für Wachstum und Imaging), die wurde entworfen und hergestellt als funktional unterteilte Gerät Larven für hochauflösende Mikroskopie und erlaubt zu orientieren Schwanzflosse Durchtrennung im Gerät und anschließende hemmungslos Schweif Entwicklung und nachwachsen. Dieses Gerät ermöglicht eine Verwundung und langfristige Bildgebung unter Beibehaltung der Lebensfähigkeit. Angesichts der Tatsache, dass die zWEDGI Form 3D gedruckt, die Anpassbarkeit der Geometrien machen es leicht modifiziert für diverse Zebrafisch-imaging-Anwendungen. Darüber hinaus bietet die zWEDGI zahlreiche Vorteile, wie z. B. Zugriff auf die Larve während Experimente für verletzte oder für die Anwendung von Reagenzien, Ausrichtung der mehrere Larven für optimierte Bildgebung und Wiederverwendbarkeit des Geräts parallel geschaltet.

Einleitung

Die Regenerationsfähigkeit der Zebrafischlarven Danio Rerio machen sie eine ideale Modellorganismus für Wunde Reaktion sowie Heilung und nachwachsen^1,2,3,4zu prüfen. Zugriff auf ein Array von transgenen Zebrafisch Linien und Zebrafisch anatomische Transparenz weiter erhöhen ihre Nützlichkeit für in Vivo Studien der Wunde Antwort Veranstaltungen sowie längerfristige Regenerationsprozesse⁴. Studie dieser biologischen Prozesse mit Hilfe hochauflösender Zeitraffer Fluoreszenzmikroskopie daher verlangt ein live imaging Zebrafisch-Gerät, das ermöglicht eine hohe Stabilität und nur minimale Bewegungen von Zebrafisch-Larven unter Beibehaltung der Lebensfähigkeit. Es ist wichtig, dass das Gerät ermöglicht eine effektive Verwundung und Heilung und Regeneration stattfinden unberührt vom Gerät.

Die standard live imaging Stabilisierungsmethode der Einbettung der Larve in Agarose während der live Aufnahme schränkt Wachstum und Regeneration⁵ gewickelt und Sterberaten erhöhen kann, da Larven beginnen, um Zeichen der kardiale Stress und Gewebe Nekrose nach vier Stunden-⁴. Daher entfernen von Agarose aus Regionen von Interesse ist oft notwendig um normale Entwicklung zu ermöglichen und Regeneration⁶, Freilegung der Larven, um mögliche Schäden als die Agarose wird weggeschnitten. Darüber hinaus muss die Agarose Einbettung Technik, der Benutzer orientieren die Larven in der kurzen Zeit bevor die Agarose^5,6,7erstarrt. Schnell manipulieren die Larve erfordert nicht nur Geschick des Benutzers, damit riskiert auch Schäden an der Larve. Obwohl Methoden zur Stabilisierung der Larve für live Imaging beschrieben worden sind, um diese Nachteile, wie z. B. geriffelte Agar Brunnen³ oder Unebenheiten⁸, umgehen die Verwendung von Silikon Vakuum einfetten erstelle ich eine bildgebende Kammer mit PVC-Rohre oder andere Materialien⁶und rotatorischen Schlauch⁹, viele dieser Methoden sind intensive, unordentlich, oft Einweg-labor und Umwelt Manipulation ermöglichen nicht (medikamentöse Behandlungen, verwunden etc..) nach der Montage der Fische.

Deshalb wurde das zWEDGI-Gerät (Abbildung 1) entworfen, um einige der Nachteile des Nährbodens für langfristige live Aufnahmen von Zebrafischlarven während der Manipulation der Probe bei schönem Montage zu überwinden. Die zWEDGI besteht aus drei halboffene unterteilte Kammern (Abbildung 1A) erlauben zum Laden, Zurückhaltung, Verwundung und Bildgebung von 2 bis 4 Tage nach Befruchtung Zebrafisch-Larven. Das Gerät ist hergestellt aus Polydimethylsiloxan (PDMS) und auf das Deckglas ein 60 mm unten bildgebenden Glasschale gelegt. Der hier vorgestellte Entwurf für heilende Wunde Studien bestimmt war, jedoch die Verwendung eines modularen Design und standard Fertigungstechnologien machen das zWEDGI Design veränderbar und offen für eine Vielzahl von experimentellen Verfahren, vor allem für Verfahren, die erfordert minimale Zurückhaltung mit experimentelle Manipulation und langfristige Bildgebung.

Protokoll

Hinweis: das base zWEDGI Design für Zebrafischlarven, die 2 bis 4 Tage nach Befruchtung (Dpf) und befolgen Sie die Richtlinien der Universität von Wisconsin-Madison Forschung Tiere Resource Center formuliert wurde.

1. Design und 3D Druck von Formen

1. Modell der PDMS-Komponente des Gerätes mit gewünschten Geometrien und Attribute in einem 3D modeling Software ⁵. Erstellen Sie eine Assembly eine leere Form und der PDMS-Teil und generieren Sie eine Negativform für PDMS-Teil durch die Schaffung eines Hohlraums in der Form entsprechend der PDSM Teil. Speichern Sie die Form als STL-Datei für den 3D-Druck ( Abbildung 2, Schritt 1.1).
   Hinweis: Eine Stereolithographie (STL) Formatdatei der hier vorgestellten Werkzeugkonstruktion ( Abbildung 1) steht zum Download unter https://morgridge.org/designs/.
2. Print-Formen mit einem Photopolymer 3D-Drucker ( Bild 2, Schritt 1.2). Machen mehrere Formen in einem einzigen Druck, wenn möglich, also mehr als ein Gerät kann mit einem Batch von PDMS geformt werden.
   Hinweis: Das gezeigte Beispiel wurde mit einer 0,075 mm Breite Durchmesser und 0,05 mm Schichtdicke, mittels Photopolymer Harz ⁵ in Hi-Res Modus gedruckt.
   1. Sauber Formen mit einem feinen Pinsel Spiritus in eine Sprühflasche und Druckluft zu sanft schrubben und ungehärtetem Harz zu entfernen. Entfernen Sie jegliches Material aus den Regionen Microchannel.
   2. Post-heilen die Formen in einem UV Post Heilung Apparat für 60 min. auf jeder Seite, wie noch nicht ausgehärteten Rücktritt giftig für Zebrafisch-Larven- ^{10 ist}.
3. Sand die Kavitätsseite der Form mit 200 Schleifpapier auf eine Ebene Fläche, bis die Dichtflächen in Kontakt mit dem Schleifpapier (Laden von Kanal-Geometrien und Schimmel Perimeter) sind. Versanden Sie mit 400 bis 600 Grit Sand Papier, schrittweise, um glatte Oberflächen bündig über alle Geometrie-Deckschichten ( Bild 2, Schritt 1.3) zu produzieren. Messen Sie die Tiefe der Kavität nach dem Schleifen mit einer Messuhr zu überprüfen, ob es in der Nähe der gestalteten Tiefe ist.
   1. Reinigen Sie Formen und Scheiben (1 ¾ Zoll Durchmesser x ¼ Zoll dicken Borosilikat-Glas oder Acryl, ein Glas pro Form decken) zu decken, indem man in ein Ultraschall Reiniger mit Wasser für 30 min gefüllt oder durch Spülen unter fließendem Wasser.
   2. Mit Druckluft Trockenblasen und reinigen Sie beide Formen und deckt mit Isopropyl-Alkohol und gefilterte Druckluft. Verwenden Sie einen sauberen Werkbank als einen Ort, um die Geräte zur Minimierung von Verunreinigungen in der Luft Schutt zu fabrizieren. Lassen Sie das gereinigte Formen und das Glas erstreckt sich in der sauberen Werkbank oder einer überdachten Petrischale bis benötigt.

2. PDMS-Herstellung von zWEDGI Gerät

1. machen die PDMS durch strömenden 184 Silikon Elastomer Polydimethylsiloxan (PDMS) in einem Verhältnis von 5:1 (Basis, Aktivator) in einem Plastikbecher. Mischen Sie 2 min. lang mit einem Holz Handwerk Stock, das Gel über auf sich selbst, wie Brot kneten rühren. Verwenden Sie für 5 Werkzeuge 10 g Base und 2 g des Aktivators.
   1. De-Gas-Gemisch in einem Vakuum Exsikkator für 25-45 min bis alle Bläschen verschwunden sind.
   2. Füllen Sie den Hohlraum der einzelnen 3D gedruckten Formen mit etwa 0,75 mL PDMS mit einer 10mL Spritze, bis die Form leicht mit einem Meniskus ( Bild 2, Schritt 2.1) überläuft.
   3. De-Gas gefüllten Formen für 45 min um zusätzliche Luftblasen zu entfernen, die beim Befüllen gebildet haben kann.
2. Anwenden einer Glasscheibe Abdeckung oben auf dem PDMS-gefüllte Schimmel, die Disc in einem Winkel zu verhindern, dass Luftblasen drücken ( Abbildung 2, Schritt 2.2) gefangen. Können überschüssige PDMS vertrieben werden, wie die Glasabdeckung der Scheibe anliegt.
3. Einsatz kleine Ratsche Klammer an die Cover-CD mit der Form festzuhalten.
   Hinweis: Dies erstellt eine flache Oberfläche, sobald die PDMS geheilt ist und durch Löcher produziert, wo die gedruckten 3D-Geometrien bündig mit dem Glas-Deckglas sind. Alternativ, um die Anzahl der Geräte zu erhöhen, die gleichzeitig geheilt werden kann, Erstellen einer Multi-Clamp-Gerät (zB. Abbildung 2, Schritt 2.3).
4. Heilen das PDMS-Gerät in den eingespannten Formen bei 100 ^o C in einem Ofen für 90 min ( Bild 2, Schritt 2.4). Nehmen Sie die Formen aus dem Ofen und abkühlen lassen bis sie leicht gehandhabt werden können. Wenn die Klemmvorrichtung Metall ist, entfernen die Schimmel und Abdeckung Disc-Montage aus der Klemme zu verhindern, dass das Metall weiterhin die PDMS durch Restwärme zu heilen.
   Hinweis: Das Gerät ist am einfachsten, aus der Form entfernen, während noch leicht warm und nicht vollständig ausgehärtet. Jedoch sobald die Form aus dem Ofen entfernt ist und die Cover-CD entfernt, kann das Gerät für ein paar Tage vor der Entformung sitzen. Wenn das Gerät kurz nach dem Entfernen aus dem Räucherofen auszuschmelzen ist, legen Sie sie in einer bedeckten Petrischale, Verunreinigungen zu minimieren und ermöglicht es, vollständig zu heilen.

3. Plasma-Bonding zWEDGI, Glasschale

1. Klemme die Form mit dem PDMS-Gerät in einen Schraubstock so dass die Form ' s Geometrien stehen oben, parallel zum Bahnhof Arbeitstisch.
   1. Start, PDMS-Gerät durch die Freigabe der PDMS-Lasche aus der Form mit flachen Spitzen Pinzette zu entfernen. Arbeit rund um den Rand der Form mit der Pinzette (wie einen Kuchen aus der Pfanne ( Abb. 2, Schritt 3.1) entfernen).
   2. Gefiltert verwenden Druckluft und Pinzette, um das Gerät aus der Form ziehen vorsichtig durch Festhalten an der Lasche und Einblasen von Luft unter das Gerät. Arbeiten Sie langsam, so dass die Luft dazu separate PDMS aus der Form, die besondere Pflege mit den Spitzen der Pinzette rund um den dünnen Tunnelabschnitte.
2. Stellen Sie das Gerät PDMS kopfüber auf der Innenseite des Deckels eine Glasschale Talsohle, so dass die zurückhaltende Tunnel Keile Kunststoff ( Abbildung 2, Schritt 3.2) berührt werden.
3. Deckel Schale mit Kopf zWEDGI und den entsprechenden Boden Glasschale in ein Plasma Reiniger mit dem inneren Glas nach oben ( Bild 2, Schritt 3.3).
   1. Evakuieren das Plasma Reinigung Kammer, bis der Druck 500 mTorr erreicht.
   2. Set Radiofrequenz (RF) Leistung zu hoch. Setzen Sie das Gerät und das Gericht für RF-Frequenz für ca. 2 min. langsam de-Kammer unter Druck zu setzen und ein Reinraum-Haube das Gerät und die Schale wieder.
4. Das PDMS-Gerät aus Gericht Abdeckung entfernen. Umdrehen Sie der PDMS-zWEDGI auf die richtige Orientierung auf dem Glas positioniert es vorsichtig auf das Zentrum auch der untere Glasschale ( Abbildung 2, Schritt 3.4)
   1. mit dem Back-End der Pinzette, drücken Sie leicht auf die PDMS Gerät, um Luftblasen zu gewährleisten sind nicht unter gefangen. Üben Sie Druck auf die Minuten Geometrien der Mikrokanäle und glätten die PDMS an den Rändern ( Abbildung 5).
      Hinweis: Vollständige Kontakt zwischen dem PDMS und Glas sorgt für bessere Einhaltung von Plasma kleben. Das zWEDGI Gerät kann Plasma auf andere Glasboden Schale Formate, wie ein Glasboden 6-Well Plat verklebt sein.e ( Abbildung 2).
   2. Legen Sie eine Abdeckung über das Gerät Gericht vor dem Entfernen von der Reinraum-Motorhaube.
      Hinweis: Nachdem die Geräte auf Glas befestigt wurde, das Protokoll kann angehalten werden bis sie einsatzbereit sind.

4. Channel-Vorbereitung und laden Larven

Hinweis: General Zebrafish Tierhaltung war pro The Zebrafish Buch online bei http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html durchgeführt. Erwachsenen Zebrafisch und Embryonen wurden beibehalten, wie zuvor beschrieben ¹. Verwendet wurde der Wildtyp AB Stamm. Folgen Sie die Institution ’ s Animal Care Protokoll für Besonderheiten in Bezug auf Anforderungen für imaging-live Larven.

1. Spülen tunnel die Kanäle mit einem Minimum von 100 µL 70 % Ethanol pro Kanal, mit einer Mikropipette, um durch die einstweilige Verfügung zu spülen. Entfernen Sie Ethanol und 2 oder 3 Mal mit doppelt destilliertem Wasser spülen. An der Luft trocknen.
2. Füllen Sie die Kanäle mit Magermilch (in einer Konzentration von 1 % mit Wasser verdünnt) für 10 min bei Raumtemperatur, Einhaltung der Larven der Glas-Deckglas des Gerichtes zu minimieren. Dann tauchen Sie sanft das Gerät mehrmals in doppelt destilliertem Wasser zu spülen. Lassen Sie an der Luft trocknen kopfüber.
   Hinweis: Protokoll kann hier angehalten werden. Diese Vorbereitung der zWEDGI Gerät kann mehrere Tage vor dem Gebrauch erfolgen. Shop bei Raumtemperatur abgedeckt.
3. Vorbereiten 1 % niedrig schmelzenden Punkt (LMP) Agarose durch die Kombination von 100 µL 2 % geschmolzen LMP Agarose mit 100 µL 2 X Tricaine (0,4 mg/mL Tricaine - Ethyl-3-Aminobenzoate) in E3 Puffer ¹¹, 38 ^o c vorgewärmt halten die 1 % Agarose/Tricaine Lösung bei 38 ^o C in einem heißen Block verhindern gelling.
   Hinweis: Für multiphoton Mikroskopie ¹¹, benutzen Sie entweder UN-pigmentierten Zebrafisch-Varianten (z. B. Casper ¹²) oder pflegen Sie Larven in E3 mit 0,2 mM N-Phenylthiocarbamid Pigmentbildung verhindern ¹¹, Aufnahme der in der Nähe von Infrarot-Wellenlängen durch das Pigment zu minimieren.
   Achtung: N-Phenylthiocarbamid ist giftig. Folgen Sie die Institution ' s Regeln zur Verfügung.
4. Anesthetize Larven in E3 Puffern mit 0,2 mg/mL Tricaine (Tricaine/E3) ¹¹. Warten Sie, bis die Larven unbeweglich und nicht mehr reagiert auf einen Reiz Touch sind.
5. Vornässen der Kanäle mit wenige Mikroliter der Tricaine/E3.
   1. Pick up eine einzelne Larve mit einer breiten Öffnung Pipettenspitze. Hinterlegen Sie die Larven in den Laden-Kanal ( Abb. 3A). Mit einer Pipettenspitze oder ähnliches Werkzeug, die Larve in den Füllraum orientieren, so dass die dorsalen Seitenflächen geraderen Rand der Füllraum und die Rute Flächen in Richtung der zurückhaltende Tunnel ( Abb. 3 b).
   2. Hat die Verwundung Kammer, so dass die Larve in den dämpfenden Tunnel ( Abbildung 3) fließen sorgfältig Flüssigkeit entziehen. Entfernen Sie die meisten der Flüssigkeit und gleichzeitig Feuchtigkeit rund um die Larve ( Abbildung 3D). Dieser Prozess kann durch Kippen der Schale leicht in Richtung der Verwundung Kammer unterstützt werden.
6. Tricaine/E3 1 % LMP Agarose entgegenbringen (~ 38 ^o C) über die Larve ' Kopf, füllen die Ladekammer ( Abbildung 3E). Lassen Sie Agarose mit der Larve in der richtigen Position zu festigen. Der verletzte Kammer fügen Sie Tricaine/E3 wie notwendig, um die Flüssigkeitszufuhr zu halten hinzu. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die restlichen 2 Kanäle laden.
7. Mit Hilfe einer Spritzennadel entfernen Sie vorsichtig alle Agarose, die sickerte durch die zurückhaltende Tunnel in der Verwundung Kammer ( Abbildung 3F). Fügen Sie zusätzliche Tricaine/E3 entweder nur über die Agarose (für Verwundung, kurzfristige Bildgebung oder Wunde Behandlung Isolation) oder der Kulturschale (für langfristige Imaging) zu füllen. Den Deckel Kultur Gericht um Verdunstung zu verhindern. Larven können an dieser Stelle (unverletzt) abgebildet oder verletzt.

5. Verletzte und Imaging Larven

1. mit einem sterilen Skalpellklinge Transekt der Schwanzflosse posterior der Chorda- ¹¹ in der Verwundung Kammer ( Abbildung 3 G, H). Bei Bedarf zusätzliche Tricaine/E3 hinzufügen und den Kultur-Schüssel Deckel.
   Hinweis: Alternativ je nach Fenster Entwicklungszeit von Interesse, Larven können werden verwundet, durfte in E3 zu erholen und in einem Inkubator (28,5 ^o C) beibehalten, bis die gewünschte bildgebenden Zeit, an welcher, die Stelle sie in Kanäle als geladen werden können oben beschriebene.
2. Installieren Sie das zWEDGI-Gerät mit narkotisierten Larven auf einem inversen Mikroskop in einem Stadium-Einsatz, der die Glasschale unten 60 mm beherbergen wird. Suchen Sie Ende der Larve in den obersten Kanal, die Schüssel drehen, wie notwendig, um das Heck in die gewünschte Position zu bekommen. Je nach Bedarf für das spezifische Experiment Bild.
   Hinweis: Die zWEDGI ist breit anwendbar für hochauflösenden Lichtmikroskopie, einschließlich Weitfeld Fluoreszenz und Laser-scanning-Mikroskopie. Gibt es eine Reihe von Überlegungen der Parameter beim Zebrafischlarven abbilden, sondern spezifisch imaging-Parameter sind Instrument, Probe und Experiment angewiesen. Hier war das Larvenstadium Heck auf eine benutzerdefinierte Build multiphoton Mikroskop ^{5 , 11} unter Verwendung der folgenden Parameter abgebildet: 40 X lange arbeiten Abstand Wasser eintauchen Ziel, 890 nm Laseranregung 445/20 nm Emission Filter und Auflösung von 512 x 512.

6. Ende des Experiments

1. entfernen das zWEDGI Gericht aus Mikroskop. Einschläfern der Larven durch die Platzierung der zWEDGI, ein Eis-Wasserbad oder auf 4 ^o C für mindestens 20 Minuten und für das Fehlen von Herzschlag und Kreislauf beurteilen.
   Hinweis: Da die Larven in getrennten Fächern gepflegt werden, können die Larven einzeln wiederhergestellt werden durch leichtes Ziehen auf Agar mit Zange oder Pipette. Agar aus den Kopfbereich und die Larve für zusätzliche Verfahren, wie z. B. Fixierung für Antikörper Färbung verwendet oder verarbeitet für RNS oder Protein Extraktion entfernt werden kann.
2. Nach Entfernen der Larven und Agar, reinigen Sie die zWEDGI mit Ethanol und destilliertem Wasser, wie unter Punkt 4.1 beschrieben und kopfüber an der Luft trocken. Geschäft abgedeckt an einem kühlen, trockenen Ort. Neu beschichten mit Magermilch (Schritt 4.2) vor dem nächsten Gebrauch Bedarf.
   Hinweis: zWEDGIs können wiederverwendet werden mehrere Male, bis die PDMS fängt an, Weg von dem Glas kommen.

Ergebnisse

Die zWEDGI PDMS mikrofluidischen Gerät ist funktionell unterteilte entwickelt, um vier Hauptfunktionen (siehe unten) verbunden mit live-Bildgebung der Schwanzflosse Verwundung heilen und nachwachsen im Zebrafischlarven aufnehmen. PDMS wurde für die Fertigung von zWEDGI gewählt, weil es nicht nur leicht zugänglich ist und eine Industrie-standard für Biokompatibilität, sondern auch in Formen gut funktioniert. Darüber hinaus macht PDMS das Gerät wieder verwendbare und leer von harten...

Diskussion

Das zWEDGI-Gerät soll 3D Zeitraffer imaging zu stabilisieren und den Fisch in kleine Arbeitsabstand von einem hochauflösenden Mikroskop Ziel orientieren zu erfassen. Während diese Designspezifikationen erfüllt, ist es auch eine Verbesserung gegenüber traditionellen Agar-Basis Vorbereitung für live Imaging. Es gibt drei wichtige Schritte (siehe unten) bei der Herstellung von zWEDGI, die, wenn man nicht richtig Defekte Geräte führen kann:

PDMS-Vorbereitung (Abb. 5A

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabricate molds
Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software	Dassault Systemes	SPX0117-01	Fisher Unitech
Viper Si2 SLA 3D printer	3D Systems Inc.	23200-902	3D Systems Inc.
Accura 60 photopolymer resin	3D Systems Inc.	24075-902	3D Systems Inc.
denatured alcohol	Sunnyside	5613735	Menards
UV post cure apparatus	3D Systems Inc.	23363-101-00	3D Systems Inc.
TouchNTuff nitrile gloves	Ansell	92-600	McMaster Carr
220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper	Norton	66261139359, 54, 52	MSC
borosilicate glass disc, 2" diameter	McMaster-Carr	MIL-G-47033	McMaster-Carr
ultrasonicator cleaner	Branson	1510R-MTH
isopropyl rubbing alcohol 70%	Hydrox	54845T43	McMaster-Carr
10oz clear plastic cup	WNA Masterpiece	557405	Amazon
6"craft stick	Perfect Stix	Craft WTD-500	Amazon
Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabricate zWEDGI PDMS device
Sylgard 184 silicon elastomeric kit	Dow-Corning	4019862	Ellworth Adhesives
10mL syringe	Becton Dickinson	305219	Vitality Medical Inc
desiccator	Bel-Art Scienceware	F42027-0000	Amazon
4 in ratcheting bar clamp	Pittsburgh	68974	Harbor Freight
lab oven	Quincy Lab Inc.	20GC	Global Industrial
tweezer set	Aven	549825	McMaster-Carr
compressed air filtered nozzle	Innotech	TA-N2-2000FT	Cleanroom Supply
vacuum bench vise	Wilton Tool Group	63500	MSC Industrial
55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass	Cellvis	D60-30-1.5-N	Cellvis
plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001	Harrick Plasma
Name	Company	Catalog Number	Comments
Loading Larvae
Pipetteman, P200	Gilson	F123601
100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use)	Pharmco-aaper	111000200
Transfer pipette	Fisherbrand	13-711-5A	Fisher Scientific
powdered skim milk		2902887	MP Biomedicals
double distilled water
N-phenylthiorurea	Sigma-Aldrich	P7629	Sigma-Aldrich
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)		C-FINQ-UE	Western Chemical
low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A0701	Sigma-Aldrich
heat block (dry bath incubator)	Fisher Scientific	11-718-2	Fisher Scientific
E3 buffer
large orifice pipette tip, 200 uL	Fisherbrand	02-707-134	Fisher Scientific
General purpose pipette tip, 200 uL	Fisherbrand	21-197-8E	Fisher Scientific
#15 scalpel blade	Feather	2976	Amazon
25G syringe needle	BD	BD305122	Fisher Scientific
Name	Company	Catalog Number	Comments
Imaging
inverted microscope
Imaris imaging software	Bitplane