À long terme direct Imaging Device pour meilleure Manipulation expérimentale des larves de poisson zèbre

Résumé

Ce manuscrit décrit le zWEDGI (poisson-zèbre Wounding et dispositif de piégeage pour la croissance et de l’imagerie), qui est un dispositif compartimenté destiné à orienter et à empêcher les larves de poisson zèbre. La conception permet la transection de la queue et à long terme collection d’images de microscopie de fluorescence à haute résolution de la cicatrisation et de régénération.

Résumé

La larve de poisson-zèbre est un organisme modèle important pour la biologie du développement et de la cicatrisation des plaies. Par ailleurs, la larve de poisson-zèbre est un système utile pour l’imagerie microscopique direct haute résolution des phénomènes biologiques dynamiques dans l’espace et le temps avec résolution cellulaire. Toutefois, la méthode traditionnelle d’encapsulation d’agarose pour l’imagerie live peut entraver le développement larvaire et repousse des tissus. Par conséquent, ce manuscrit décrit le zWEDGI (poisson-zèbre Wounding et dispositif de piégeage pour la croissance et de l’imagerie), qui a été conçu et fabriqué comme un dispositif fonctionnellement compartimenté pour orienter les larves pour la microscopie à haute résolution tout en permettant transection de nageoire caudale au sein de l’appareil et le développement subséquent de queue sans retenue et le repousse. Ce dispositif permet de blesser et de l’imagerie à long terme tout en préservant la viabilité. Étant donné que le moule de zWEDGI est imprimé en 3D, les possibilités de personnalisation de ses géométries rendent facilement modifiables pour applications diverses poisson-zèbre. En outre, le zWEDGI offre de que nombreux avantages, tels que l’accès à la larve au cours de l’expérimentation pour blessure ou pour l’application de réactifs, parallèlement à l’orientation des larves multiples pour l’imagerie simplifiée et réutilisabilité de l’appareil.

Introduction

La capacité de régénération des larves de poisson zèbre Danio rerio rendent un organisme modèle idéal pour examiner la réponse de la plaie ainsi que guérison et repousse^1,2,3,4. Accès à un tableau de lignées transgéniques de poisson-zèbre et transparence d’anatomique du poisson-zèbre encore améliorer leur utilité pour les études in vivo de plaie réponse événements ainsi qu’à plus long terme du processus de régénération⁴. Étude de ces processus biologiques à l’aide de la microscopie en fluorescence Time-lapse haute résolution donc exige un appareil d’imagerie live de poisson-zèbre qui permet une stabilité élevée et mouvement minimal de la larve de poisson-zèbre tout en préservant la viabilité. Il est essentiel que l’appareil permette blessant efficace tout en la guérison et la régénération se produisent pas affecté par le dispositif.

La méthode de stabilisation standard d’imagerie direct d’incorporation de la larve dans l’agarose en imagerie live limite la croissance et enroulé de régénération⁵ et peut augmenter les taux de mortalité étant donné que les larves commencent à montrer des signes de nécrose cardiaque de stress et de tissus après quatre heures⁴. Par conséquent, la suppression d’agarose de régions d’intérêt est souvent nécessaire pour permettre le développement normal et régénération⁶, exposer les larves à des dégâts potentiels que l’agarose est coupé. En outre, avec l’agarose, intégration technique, l’utilisateur doit orienter les larves dans le peu de temps avant l’agarose solidifie^5,6,7. Rapidement, manipulant la larve requiert non seulement des compétences de l’utilisateur, elle risque aussi de dommages à la larve. Méthodes pour stabiliser la larve d’imagerie live ont été décrits pour contourner ces inconvénients, comme la gélose striée puits³ ou divets⁸, à l’utilisation du vide de silicone graisse pour créer une chambre d’imagerie avec la tuyauterie de PVC ou autre matériaux⁶et rotation tubes⁹, beaucoup de ces méthodes sont du travail intensif, malpropre, souvent non réutilisables et ne permettent pas de manipulation environnementale (pharmacothérapie, blessant etc..) après que le poisson a été monté.

Par conséquent, le dispositif de zWEDGI (Figure 1) a été conçu pour surmonter certains des inconvénients de la gélose de montage pour l’imagerie live à long terme des larves de poisson zèbre tout en permettant la manipulation de l’échantillon. Le zWEDGI est composé de trois chambres compartimentées semi-ouvert (Figure 1 a) pour permettre de chargement, retenue, le blessant et l’imagerie des larves de poisson zèbre après fécondation de 2 à 4 jours. Le dispositif est fabriqué de polydiméthylsiloxane (PDMS) et placé sur la lamelle couvre-objet d’un plat d’imagerie de fond verre 60 mm. La conception présentée ici a été destinée aux études guérison de plaie, cependant l’utilisation d’une conception modulaire et les technologies de fabrication standard font la conception zWEDGI modifiable et se prêtent à une variété de procédures expérimentales, en particulier pour les procédures qui exiger une retenue minimale avec manipulation expérimentale et l’imagerie à long terme.

Protocole

Remarque : la conception de base de zWEDGI a été formulée pour les larves de poisson zèbre fécondation après 2 à 4 jours (dpf) et suivent les directives de l’Université du Wisconsin-Madison recherche animaux Resource Center.

1. conception et impression de moules 3D

1. modèle le PDMS composant de l’appareil souhaité des géométries et des attributs dans un logiciel ⁵ de modélisation 3D. Créer un assembly d’un moule vide et la partie PDMS et générer un moule négatif pour la partie PDMS en créant une cavité dans le moule correspondant à la partie PDSM. Enregistrez le moule sous un fichier .stl pour l’impression 3D ( Figure 2, étape 1.1).
   Remarque : Un fichier de format (.stl) de stéréolithographie de la conception du moule présenté ici ( Figure 1) est disponible pour téléchargement à https://morgridge.org/designs/.
Moules de
2. imprimé à l’aide d’une imprimante 3D photopolymère ( Figure 2, étape 1.2). Faire des moules multiples en une seule impression, si possible, donc plus d’un appareil peut être moulé avec un lot unique de PDMS.
   Remarque : L’exemple illustré a été imprimé en mode haute résolution avec un 0.075 mm faisceau de diamètre et 0,05 mm épaisseur de la couche, à l’aide de photopolymère résine ⁵.
   1. Propres moules à l’aide d’une brosse fine, alcool dénaturé dans un flacon pulvérisateur et l’air comprimé pour frotter en douceur et enlever la résine non polymérisée. Prélever sur toute les régions de microcanaux.
   2. Post-guérir les moules dans un appareil de traitement UV post pendant 60 min de chaque côté comme non durci résine est toxique pour les larves de poisson zèbre ¹⁰.
3. Sable du côté de la cavité du moule avec le papier de verre grain 200 sur une surface plane jusqu'à ce que toutes les surfaces d’étanchéité sont en contact avec le papier de verre (chargement des géométries de canal et périmètre de moule). Poncez légèrement avec du papier de grain de sable de 400 et 600, progressivement, pour produire des surfaces lisses de chasse partout tous les bardages de géométrie ( Figure 2, étape 1.3). Mesurer la profondeur de la cavité après ponçage avec un comparateur pour vérifier qu’il est proche de la profondeur conçus.
   1. Nettoyer les moules et couvrir les disques (1 ¾ po de diamètre x ¼ de pouce épais verre borosilicate ou acrylique ; un verre couvrent par moule) en plaçant dans un ultrasons nettoyeur rempli d’eau pendant 30 min ou en rinçant sous l’eau courante.
   2. Sécher à l’air comprimé et nettoyer les deux moules et couvre avec l’alcool isopropylique et air comprimé filtré. Utiliser un banc propre comme un lieu pour fabriquer les dispositifs pour réduire la contamination des débris aéroportés. Laissez les moules nettoyées et verre couvre dans le banc propre ou une boîte de Pétri couvert jusqu'à ce que nécessaire.

2. Fabrication de PDMS de zWEDGI appareil

1. font le PDMS par 184 verseur silicone élastomère polydiméthylsiloxane (PDMS) à un ratio de 5:1 (base d’activateur) dans une tasse en plastique. Mélangez bien pendant 2 min avec un bâton de métier en bois, remuer le gel plus sur lui-même, comme pétrir le pain. Pour 5 moules, utiliser 10 g de base et 2 g d’activateur.
   1. Dé-gaz mélange dans un dessiccateur à vide pour les 25-45 min jusqu'à ce que toutes les bulles ont disparu.
   2. Remplir la cavité de chacun des moules imprimés 3D avec environ 0,75 mL de PDMS à l’aide d’une seringue de 10mL jusqu'à ce que le moule légèrement déborde d’un ménisque ( Figure 2, point 2.1).
   3. Dé-gaz les moules remplis pendant 45 min enlever les bulles supplémentaires qui se sont formées lors du remplissage.
2. Appliquer un disque de verre couvercle sur le dessus du moule rempli de PDMS, appuyant le disque vers le bas à un angle pour empêcher les bulles d’être pris au piège ( Figure 2, point 2.2). Permettre des excès PDMS à être expulsé que la couverture de disque de verre est appliquée.
3. Utilisation petit cliquet pince pour tenir le disque de couverture étroitement au moule.
   Remarque : Cela crée une surface plane, une fois que le PDMS est soignée et produit par le biais de trous où les géométries 3D imprimées soient à égalité avec la lamelle de verre. Sinon, pour augmenter le nombre d’appareils qui peuvent être soignées en même temps, construire un dispositif de serrage multiples (par exemple. la figure 2, étape 2.3).
4. Guérir l’appareil PDMS dans les moules fixées à 100 ^o C dans une étuve pendant 90 min ( Figure 2, étape 2,4). Retirer les moules du four et laisser refroidir jusqu'à ce qu’ils peuvent être facilement manipulés. Si le dispositif de serrage est en métal, retirez le moule et couvercle disque par la pince pour empêcher le métal de continuer à guérir le PDMS en raison de la chaleur résiduelle de.
   Remarque : L’appareil est plus facile retirer du moule, alors qu’encore tièdes et non complètement durcie. Cependant, une fois que le moule est retiré du four et le disque de couverture est retiré, l’appareil peut s’asseoir pendant quelques jours avant de procéder au démoulage. Si l’appareil est démoulée peu après le retrait du four de polymérisation, placez-le dans une boîte de Pétri couverte afin de minimiser les contaminants tout en lui permettant de guérir complètement.

3. ZWEDGI plasma-collage à plat en verre

1. le moule contenant le dispositif PDMS dans un étau de serrage pour que le moule ' géométries s sont face vers le haut, parallèlement à la magistrature de station de travail.
   1. Commencer à enlever le dispositif PDMS en libérant la PDMS la tirette du moule à l’aide de pinces à épiler à embout plat. Travail autour du périmètre du moule avec la pince à épiler (comme enlever un gâteau dans une casserole ( Figure 2, étape 3.1)).
   2. Utilisation filtré l’air comprimé et pince à épiler pour tirer doucement sur l’appareil hors du moule en tenant sur la languette et en soufflant de l’air sous l’appareil. Travailler lentement, permettant à l’air pour aider séparé le PDMS du moule, en prenant des précautions particulières avec les conseils de la pince à épiler dans les sections minces tunnel.
2. Placer le dispositif PDMS à l’envers sur l’intérieur de la couverture d’un plat à fond de verre, afin que les cales de tunnel retenue entrent en contact avec le plastique ( Figure 2, étape 3.2).
3. Placer le couvercle plat avec zWEDGI à l’envers et le plat à fond de verre correspondant dans un plasma nettoyant avec la vitre intérieure vers le haut ( Figure 2, étape 3.3).
   1. Évacuer le plasma Nettoyage chambre jusqu'à ce que la pression atteint 500 mTorr.
   2. Set radio fréquence (RF) puissance élevée. Exposer l’appareil et le plat à fréquence RF pendant environ 2 min. lentement dépressuriser la chambre et retourner l’appareil et le plat d’un capot de salle blanche.
4. Enlever le PDMS de plat couvercle. Retourner sur le zWEDGI PDMS à la bonne orientation sur le verre en le positionnant soigneusement sur le centre bien du verre fond plat ( Figure 2, étape 3.4)
   1. à l’aide de l’extrémité arrière de la pince à épiler, appuyez légèrement sur le PDMS dispositif pour s’assurer de bulles d’air ne sont pas pris au piège sous. Appliquez une pression autour des minutes géométries des canaux micro et lisser le PDMS sur les bords ( Figure 5).
      Remarque : Contact complet entre le verre et le PDMS assure la meilleure adhérence de collage de plasma. Le dispositif de zWEDGI peut être plasma collé sur autres formats de verre à fond plat, comme un plat de 6 puits à fond de verree ( Figure 2).
   2. Placer l’enveloppe sur le plat de l’appareil avant de retirer le capot de la salle blanche.
      Remarque : Une fois que les appareils ont été fixées pour le verre, le protocole peut être suspendu jusqu'à ce qu’ils sont prêts à l’emploi.

4. Préparation et chargement des larves de canal

Remarque : élevage de poissons zèbres générale a été réalisée par le livre du poisson-zèbre, disponible en ligne à http://zfin.org/zf_info/zfbook/zfbk.html. Embryons et le poisson-zèbre adulte ont été maintenues comme décrit plus haut ¹. La souche de type sauvage AB a été utilisée. Suivez l’institution ’ s Animal Care protocole pour plus de détails concernant les exigences pour l’imagerie des larves vivantes.

1. Rincer les canaux avec un minimum d’éthanol 70 % 100 µL par canal, à l’aide d’une micropipette de rincer grâce à la contention du tunnel. Retirez l’éthanol et rinçage 2 ou 3 fois avec l’eau bidistillée. Laisser sécher à l’air.
2. Remplir les canaux avec du lait écrémé (à une concentration de 1 % diluée dans l’eau) pendant 10 min à température ambiante pour réduire l’adhérence des larves à la lamelle de verre du plat. Puis, doucement immerger l’appareil plusieurs fois dans l’eau bidistillée à rincer. Laisser sécher à l’air à l’envers.
   NOTE : Protocole peut être suspendue ici. Cette préparation du dispositif de zWEDGI peut se faire plusieurs jours avant d’utiliser. Magasin couvert à température ambiante.
3. Préparer 1 % bas point de fusion (LMP) agarose en combinant 100 µL 2 % fondu LMP agarose avec 100µl 2 x Tricaine (0,4 mg/mL tricaïne - 3-aminobenzoate d’éthyle) E3 tampon ¹¹ préchauffée à 38 ^o C. maintenir le 1 % solution d’agarose/tricaïne à 38 ^o C dans un bloc chaud pour empêcher la gélification.
   Remarque : Pour la microscopie multiphoton ¹¹, utiliser deux variantes zebrafish non pigmentées (tels que casper ¹²) ou de maintenir des larves en E3 contenant 0,2 mM N-phénylthiourée pour empêcher la formation de pigment ¹¹ afin de minimiser l’absorption de longueurs d’onde infrarouges proches par le pigment.
   ATTENTION : N-phénylthiourée est toxique. Suivez l’institution ' règles de s pour élimination.
4. Anesthésier les larves en E3 tampon contenant 0,2 mg/mL de tricaïne (tricaïne/E3) ¹¹. Attendez que les larves sont immobiles et ne répond pas à un stimulus tactile.
5. Pré mouillage les canaux avec quelques microlitres de tricaïne/E3.
   1. Pick up une seule larve à l’aide d’un embout large orifice de la pipette. Déposer les larves dans le canal de chargement ( Figure 3 a). À l’aide d’une pointe de pipette ou un outil similaire, orienter la larve dans la chambre de chargement tels que la face dorsale trouve le bord rectiligne de la chambre de chargement et les visages de la queue vers le tunnel de retenue ( Figure 3 b).
   2. Retirer soigneusement le liquide de la chambre blessant, ce qui permet à la larve s’écouler dans le tunnel de retenue ( Figure 3). Enlever la plupart du liquide tout en conservant l’humidité autour de la larve ( Figure 3D). Ce processus peut être facilitée en inclinant le plat légèrement vers la chambre blessant.
6. Placer 1 % LMP d’agarose dans tricaïne/E3 (~ 38 ^o C) au cours de la larve ' s la tête, remplissage de la chambre de chargement ( Figure 3E). Permettre d’agarose solidifier la larve dans la bonne position. Ajouter tricaïne/E3 à la chambre blessant au besoin pour maintenir l’hydratation. Répétez ce processus pour les 2 autres canaux de chargement.
7. à l’aide d’une aiguille de seringue, retirer soigneusement toute agarose qui s’est infiltrée à travers le tunnel de retenue dans la chambre de blessure ( Figure 3F). Ajouter tricaïne/E3 supplémentaires soit un peu plus l’agarose (pour les blesser, imagerie à court terme ou plaie traitement isolation) ou à remplir la boîte de Petri (pour l’imagerie à long terme). Replacez le couvercle plat de culture pour empêcher l’évaporation. Les larves peuvent être photographiés à ce stade (chemin) ou blessés.

5. Les larves de blessures et d’imagerie

1. à l’aide d’une lame de bistouri stérile, transect de la nageoire caudale postérieure de la notochorde ¹¹ dans la chambre de blessure ( Figure 3 G, H). Si nécessaire, ajouter supplémentaires tricaïne/E3 et remettez le couvercle de plat de la culture.
   NOTE : Vous pouvez également en fonction de la fenêtre de temps de développement d’intérêt, larves peuvent être blessés, l’autorise à recouvrer en E3 et maintenus dans un incubateur (28,5 ^o C) jusqu’au moment d’imagerie désiré, à quel point ils peuvent être chargés dans des canaux comme décrits ci-dessus.
Insert
2. installer le dispositif zWEDGI larves anesthésié sur un microscope inversé dans un stade qui accueillera le plat de fond de verre de 60 mm. Localisez la queue de la larve dans le canal supérieurs, en faisant tourner le plat tel qu’il est nécessaire pour faire la queue dans la position désirée. L’image selon les besoins pour l’expérience spécifique.
   Remarque : Le zWEDGI est largement applicable pour la microscopie à haute résolution, y compris widefield fluorescence et microscopie à balayage laser. Il y a un certain nombre de considérations de paramètre lors de l’imagerie des larves de poisson zèbre, mais spécifiques de paramètres d’imagerie sont instrument, échantillon et expérience dépendant. Ici, la queue larvaire a été photographiée sur une génération personnalisée microscope multiphoton ^{5 , 11} utilisant les paramètres suivants : 40 X long travail distance eau objectif à immersion, excitation de laser 890 nm, 445/20 nm-filtre d’émission et la résolution de 512 x 512.

6. Fin de l’expérience

1. retirer le plat de zWEDGI du microscope. Euthanasier les larves en plaçant le zWEDGI sur un bain d’eau glacée ou à 4 ^o C pendant au moins 20 min et évaluer pour absence de rythme cardiaque et la circulation.
   Remarque : Étant donné que les larves sont maintenues dans des compartiments séparés, les larves peuvent être individuellement récupérés en tirant doucement sur la gélose avec une pince ou pipette. La gélose peut être retirée de la région céphalique et la larve utilisé pour des procédures additionnelles, telles que la fixation des anticorps ou transformés pour l’extraction de l’ARN ou protéine.
2. Après le retrait des larves et agar, nettoyer le zWEDGI avec de l’éthanol et l’eau distillée, comme indiqué au point 4.1 et mis sens dessus dessous à le pour air sec. Magasin couvert dans un endroit frais et sec. Ré-enduire de lait écrémé (étape 4.2) selon le besoin avant la prochaine utilisation.
   Remarque : zWEDGIs peut être réutilisée plusieurs fois, jusqu'à ce que le PDMS commence à s’éloigner le verre.

Résultats

Le dispositif microfluidique de zWEDGI PDMS est un dispositif fonctionnellement compartimenté conçu pour accueillir quatre fonctions principales (listées ci-dessous) associées à l’imagerie live de nageoire caudale, blessant la guérison et la régénération chez les larves de poisson zèbre. PDMS a été choisi pour la fabrication de zWEDGI, parce qu’il n’est pas seulement facilement disponible et qu’un standard industriel pour la biocompatibilité, mais aussi fonctionne bie...

Discussion

L’objectif de l’appareil zWEDGI est de capturer le laps de temps 3D imaging en stabilisant et en orientant le poisson au sein de la petite distance de travail d’un objectif de microscope de haute résolution. Tout en répondant à ces spécifications de conception, c’est aussi une amélioration au cours de la préparation traditionnelle axée sur la gélose, imagerie live. Il y a trois étapes critiques (ci-dessous) dans la fabrication de la zWEDGI, qui, si ne pas fait correctement, peut entraîner des dispositif...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabricate molds
Solidworks Professional Accedemic Research 3D modeling software	Dassault Systemes	SPX0117-01	Fisher Unitech
Viper Si2 SLA 3D printer	3D Systems Inc.	23200-902	3D Systems Inc.
Accura 60 photopolymer resin	3D Systems Inc.	24075-902	3D Systems Inc.
denatured alcohol	Sunnyside	5613735	Menards
UV post cure apparatus	3D Systems Inc.	23363-101-00	3D Systems Inc.
TouchNTuff nitrile gloves	Ansell	92-600	McMaster Carr
220B, 400B, 600 grit T414 blue-bak sandpaper	Norton	66261139359, 54, 52	MSC
borosilicate glass disc, 2" diameter	McMaster-Carr	MIL-G-47033	McMaster-Carr
ultrasonicator cleaner	Branson	1510R-MTH
isopropyl rubbing alcohol 70%	Hydrox	54845T43	McMaster-Carr
10oz clear plastic cup	WNA Masterpiece	557405	Amazon
6"craft stick	Perfect Stix	Craft WTD-500	Amazon
Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabricate zWEDGI PDMS device
Sylgard 184 silicon elastomeric kit	Dow-Corning	4019862	Ellworth Adhesives
10mL syringe	Becton Dickinson	305219	Vitality Medical Inc
desiccator	Bel-Art Scienceware	F42027-0000	Amazon
4 in ratcheting bar clamp	Pittsburgh	68974	Harbor Freight
lab oven	Quincy Lab Inc.	20GC	Global Industrial
tweezer set	Aven	549825	McMaster-Carr
compressed air filtered nozzle	Innotech	TA-N2-2000FT	Cleanroom Supply
vacuum bench vise	Wilton Tool Group	63500	MSC Industrial
55mm glass bottom dish; 30mm micro-well #1.5 cover glass	Cellvis	D60-30-1.5-N	Cellvis
plasma cleaner	Harrick Plasma	PDC-001	Harrick Plasma
Name	Company	Catalog Number	Comments
Loading Larvae
Pipetteman, P200	Gilson	F123601
100% ethanol (diluted to 70% with water prior to use)	Pharmco-aaper	111000200
Transfer pipette	Fisherbrand	13-711-5A	Fisher Scientific
powdered skim milk		2902887	MP Biomedicals
double distilled water
N-phenylthiorurea	Sigma-Aldrich	P7629	Sigma-Aldrich
tricaine (ethyl 3-aminobenzoate)		C-FINQ-UE	Western Chemical
low melting point agarose	Sigma-Aldrich	A0701	Sigma-Aldrich
heat block (dry bath incubator)	Fisher Scientific	11-718-2	Fisher Scientific
E3 buffer
large orifice pipette tip, 200 uL	Fisherbrand	02-707-134	Fisher Scientific
General purpose pipette tip, 200 uL	Fisherbrand	21-197-8E	Fisher Scientific
#15 scalpel blade	Feather	2976	Amazon
25G syringe needle	BD	BD305122	Fisher Scientific
Name	Company	Catalog Number	Comments
Imaging
inverted microscope
Imaris imaging software	Bitplane