וזמינותו כתב המבוסס על ידי קרינה פלואורסצנטית פשוט לזהות את מרכיבי התא הדרושות רעלן ריצין שרשרת (RTA) סחר בבני אדם שמרים

Summary

בכתב היד, נתאר את השימוש assay כתב המבוסס על שמרים זריחה כדי לזהות רכיבים התאית מעורבת הסחר ולהרוג את התהליכים של ציטוטוקסיות של יחידת משנה של ריצין הרעלן הצמח (RTA).

Abstract

בקטריאלי, צמח A / B רעלים ניצול של מסלולים סחר טבעי בתאים האיקריוטים להגיע שלהם target(s) תאיים ב ציטוזול ו להרוג בסופו של דבר. כזה A / B רעלים מורכבת בדרך כלל פעיל enzymatically Asubunit (למשל, ריצין רעלן (RTA)), תא אחד או יותר מחייב Bsubunit(s), אשר אחראים על רעלן קשירה ספציפי ל התא קולטנים משטח. הידע הנוכחי שלנו על איך A / B רעלים מסוגלים ביעילות משכר תאי עזר מדענים להבין את המנגנונים התאיים הבסיסיים, כמו אנדוציטוזה וחלבון תאיים מיון גבוהה התאים האיקריוטים. מנקודת מבט רפואית, חשוב גם לזהות את המסלולים סחר הרעלן הגדולות כדי למצוא פתרונות טיפול הולם עבור חולים או ובסופו של דבר לפתח יישומים מבוססי-הרעלן טיפולית לטיפול בסרטן.

מאז ניתוח ברמת הגנום של A / הרעלן B תאים בתרבית של סחר בבני אדם היא מורכבת, גוזלת זמן יקר, מספר מחקרים על A / B הרעלן תחבורה בוצעו באורגניזם מודל שמרים האפייה. למרות היותו פחות מורכב, יסוד תהליכים תאיים שמרים ואת התאים האיקריוטים גבוה יותר דומים הינם לעיתים קרובות התוצאות המתקבלות שמרים ניתן להעביר למצב יונקים.

כאן, אנו מתארים assay כתב מהיר, קל לשימוש כדי לנתח את וגדילת של RTA ב שמרים. היתרון חיוני וזמינותו חדשה הוא הזדמנות לחקור לא רק RTA רטרו-טרנסלוקציה של תוך-פלזמית (ER) ציטוזול, אבל מעדיף אנדוציטוזה, הרעלן רטרוגרדית תחבורה של קרום פלזמה לחדר המיון. הבדיקה עושה שימוש פלסמיד כתב המאפשר מדידה עקיפות של RTA רעילות דרך פליטת קרינה פלואורסצנטית חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לאחר תרגום ויוו . מאז RTA מונע ביעילות אתחול של חלבון ביוסינטזה מאת 28S rRNA depurination, וזמינותו זו מאפשרת זיהוי חלבונים בתא המארח מעורב התחבורה RTA תאיים באמצעות זיהוי שינויים פליטת קרינה פלואורסצנטית.

Introduction

חולים הסובלים זיהומים על ידי הרעלן לייצר חיידקים מייצגים מעמסה רפואית וכלכלית חמורה עבור כל מערכת הבריאות חברתית, במיוחד מאז טיפולי יעיל חסרים עדיין במידה רבה. לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות, מנגנונים מורכבים שיכרון א גם לא רלוונטי רפואית / B רעלנים כגון כולרה טוקסין, רעלן שיגה או ריצין צריך להיות מובן במלואו ברמה המולקולרית המבוססת על הרומן מבחני רב עוצמה שיש ליישם.

בשנים האחרונות, מספר מחקרים ניסו לנתח A / B הרעלן תחבורה בין שמרים בתרבית של תאים באמצעות שיטות ועתירת עלות עתירי כמו רעלן רדיואקטיבי תיוג^1,2 , כמו גם סינון שמבוסס siRNA ניגש³. במקרים מסוימים, הרעלן סחר כבר מטמיעים ויוו על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ לאחר צימוד כימי ו/או גנטי של הרעלן בודדים subunits עם fluorophores, נקודות קוונטיות או חלבונים פלורסנט^4,5. למרבה הצער, ושינויים אלו לעיתים קרובות להוביל מאפיינים טבעיים לא פעילים ו/או שינו הרעלנים. דרך אלגנטית נוספת בעקיפין לענות על מגוון רחב של שאלות מדעיות היא השימוש במערכות כתב המבוסס על אנזימים כגון לוציפראז lacZ, או חלבונים פלורסנט (למשל GFP או Discosoma sp. (חלבון פלואורסצנטי אדום dsRed)).

כתב יד זה, מתואר פרוטוקול פשוט אשר מזהה הסלולר הרכיבים הדרושים עבור הובלה תאיים של RTA extracellularly יישומית ב cerevisiae ס. ובכך, זריחה-כתב פלסמיד המכיל אות N-מסוף ER-ייבוא ואחריו GFP משמש חיישן ביוסינטזה חלבון, אשר מודד בעקיפין בתיווך RTA חלבון תרגום עיכוב על ידי GFP פלורסצנטיות פליטה לאחר ויוו תרגום⁶. במקרה זה RTA אנדוציטוזה ו/או וגדילת לרעה (או באופן חיובי) מושפע ב מוטציה מחיקה שמרים מסוים לעומת פראי-סוג, זה ניתן לאתר באמצעות עלייה (או ירידה) פליטת קרינה פלואורסצנטית GFP⁶.

עד כה, כל שיטות ניתוח תחבורה RTA תאי שמרים היו מוגבלים לתהליך רטרו-רוברטסונית אר-אל-ציטוזול RTA. במערכת כזו מלאכותי, מתבטאת RTA המכיל אות ייבוא אר מ יזם inducible וכתוצאה מכך פנוטיפ אובדניות^1,7. למרות התא מחייב B-יחידת משנה של ריצין הוא חסר הגדרת הניסוי המתואר בכתב היד, וכך, לא לגמרי מייצגים את המצב הטבעי של שיכרון ריצין holotoxin⁸, הרעלן תחבורה של פלזמה ממברנה דרך מנגנון גולג'י לחדר המיון יכול להיות חיקה בשיתוף פעולה הדוק עם assay הרומן הזה. מעניין, תוצאות ראשוניות שהושגו במחקר פיילוט מציינים כי המסלולים סחר בשימוש על ידי RTA לחשוף את הדמיון הבולט עם תוואי שיכרון ריצין holotoxin.

לסיכום, שיטת שתואר יכול לשמש כדי לקבוע את התפקיד הספציפי של החלבונים שנבחרו ב- RTA אנדוציטוזה, סחר בבני אדם שמרים. יתר על כן, הגדרת הניסוי הזה יכול בקלות להתאים אחרים ריבוזום inactivating רעלנים המופרשים שמרים שונים ומינים חיידקיים כגון zymocin או טוקסין שיגה והופק.

Protocol

הערה: סקירה כללית של תהליך העבודה הכללי ניסיוני מתואר באיור1.

זהירות: RTA היא רעילה ביותר עבור בני אדם. בטיחות מעבדה הרשאה S2 (אבטחה ברמה מקבילה 2) נדרש. בבקשה ללבוש כפפות במהלך הניסוי כולו.

1. heterologous ביטוי של RTA שלו מתויגת ב- Escherichia coli

1. להפוך e. coli תאים המכילים את הביטוי פלסמיד pET24-RTA_{6 (שלו)} או את pET24a וקטור ריק⁽⁺⁾ באמצעות תקן אלקטרופורציה פרוטוקולים^9,10. תאים המכילים את פלסמיד ריק לשמש פקד שלילי.
2. לאחר בחירת שיבוטים חיובית על צלחות ליברות (100 µg/mL) המכילות kanamycin, לחסן את התאים המכילים את פלסמיד ביטוי RTA או הווקטור ריק מ ל LB_קאן בינוני (LB בינוני עם µg/mL 100 של kanamycin), דגירה-37 ° C ו- 220 סל"ד במשך 24 שעות ביממה.
3. תוספת 1 L LB_קאן בינוני עם תרבות קדם 5 מ"ל, דגירה תאים על 37 ° C ו- 220 סל"ד עד תאים מיצית את יתר של₆₀₀ של 0.8-1.0 (כ 3-4 שעות). לאחר מכן, לצמצם את תרבות הטמפרטורה 28 ° C ולהכין של 1 מ' של איזופרופיל-β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) מניות פתרון H₂O.
4. זירוז RTA לביטוי e. coli על-ידי הוספת IPTG ריכוז סופי של 1 מ מ.
5. לאחר h 3.5 ב 28 ° C ו- 220 סל"ד, קציר תאים על ידי צנטריפוגה-g 10,000 x ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, לשטוף את גלולה פעמיים עם 5 מ של איגוד מאגר (500 מ מ NaCl imidazole 10 מ מ, 20 מ מ ח'₂PO₄ pH = 7.4) 10,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, resuspend צנפה במאגר איגוד מ ל.
   הערה: פרוטוקול ניתן להשהות בשלב זה, תאים שניתן לאחסן ב 80 מעלות צלזיוס במשך מספר ימים.

2. טיהור של RTA שלו מתויג באמצעות כרומטוגרפיית זיקה

1. Sonicate תאים על קרח באמצעות פרוטוקול הבאים: s 15 דופק (20 מיקרון), השהה s 30. חזור על שלב זה חמש פעמים.
2. תגובת שיקוע באמצעות מערכת סינון סטרילי מזרק (0.2 µm גודל הנקבוביות) צנטריפוגה תא lysate-21,000-g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות ולסנן.
   הערה: תא כדורי דוגמאות בהצלחה sonicated של הצג גבולות שקוף.
3. השתמש מערכת טיהור אוטומטיות מצויד של מ ל^{2 +}ני-מבוססת עמודת זיקה לטהר את השבר שלו מתויג RTA מ סטרילי-מסוננים e. coli supernatant. באופן כללי, השתמש על מהירות • תנאי של 1 mL/min. ומגניב מערכת טיהור כל כדי למנוע מחייב רעלן שאינו יעיל ואובדן של פעילות הרעלן
   הערה: פרמטרים עבור טיהור RTA יעיל מפורטים בטבלה 1. ראה גם בקר ואח. עוד מידע⁹.
   1. בקצרה, equilibrate עמודת זיקה עם 20 מ של איגוד המאגר כדי להסיר את מאגר אחסון. החל סטרילי-מסוננים תגובת שיקוע על גבי עמודת זיקה באמצעות מזרק.
   2. לשטוף את העמודה עם 25-35 מ ל איגוד המאגר כדי להסיר את החלבונים לא מאוגד מן העמודה. בצע את שלב כביסה עד ספיגת UV-280 ננומטר נמצא בקרבת הערך ההתחלתי UV.
   3. Elute שבר RTA המאוגדים ב- 20-35 מ ל • תנאי מאגר (500 מ מ imidazole, 500 מ מ NaCl, 20 מ מ ח'₂PO₄, pH = 7.2) ולשמור את הדגימה על קרח (איור 2A ו- 2B איור).
      הערה: • תנאי של השבר RTA מסומן על ידי עלייה קליטה UV. אנא שימו לב לאסוף באופן בלעדי זה שבר למניעת זיהום עם חלבונים מאוגד לא ספציפית.
   4. להשתמש µL 20 eluted דגימות לביצוע כחול Coomassie מכתים¹¹ או^12,ניתוח תספיג¹³ (אופציונלי). השתמש הראשי שלו נגד נוגדנים (1:1, 000) משני אנטי-mouse-אג-HRP (1:10, 000) כדי לזהות RTA ולוודא מדגם טוהר (איור 3).
   5. Desalt שבר RTA eluted על עמודה desalting מ ל, equilibrate מדגם בסורביטול 0.8 מ'.
      1. להחליף את עמודת זיקה של המערכת לטיהור באמצעות עמודת desalting, equilibrate תחילה את העמודה עם 20 מ של 0.8 מ' בסורביטול.
      2. השבר RTA eluted חלות על העמודה באמצעות מזרק. רוחצים את העמודה עם 100 מ של 0.8 מ' בסורביטול את elute השבר RTA desalted בשפופרת 15 מ"ל ברגע קליטתם UV מתחיל לגדול (איור 2C).
      3. לאחסן את השבר RTA eluted ב 4 º C.
         הערה: עוצרים ישירות RTA שבר דגימה כאשר מוליכות מגביר כדי למנוע זיהום מלח. פרמטרים עבור ההליך desalting מפורטים בטבלה 1.
4. להתרכז שבר RTA eluted ב 10,000 x g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 30-180 דקות באמצעות עמודת ספין 10 kDa ניתוק נפח סופי של 1-2 מ ל ולאחסן מדגם ב 4 מעלות צלזיוס למשך 3-4 שבועות.
   התראה: אין להקפיא את הדגימה מאז קפוא מוביל אובדן מוחלט של RTA פעילות.
5. לקבוע ריכוז חלבון באמצעות ערכת קביעת חלבון קונבנציונלי. ריכוז חלבון צריך להיות בטווח של 1-1.5 מ"ג/מ"ל.
   הערה: RTA נוטה לזרז אם ריכוז חלבון גבוהה מדי (> 5 מ"ג/מ"ל).

3. שמרים טרנספורמציה והסרה דופן התא

1. בעקבות מוטציות שמרים פראי-סוג או שנבחרו למחיקה GFP כתב פלסמיד pRS315-K28_SP- GFP⁶ באמצעות שיטות טרנספורמציה של ליתיום סטנדרטית אצטט¹⁴. דגירה לתאים לאוצין הנשירה (d/o) צלחות גלוקוז (2% גלוקוז, 1.5% אגר, 0.5% אמוניום סולפאט, 0.17% בסיס חנקן שמרים (YNB) ו- 0.087% d/o לערבב בלי לאוצין) ב 30 מעלות צלזיוס במשך 2-3 ימים לבחירה שיבוט חיובי.
2. לאסוף 3 שמרים שונים שיבוטים של כל צלחת ואת לחסן השיבוטים ב- 100 מ של לאוצין בינוני של raffinose d/o (2% raffinose, 0.5% אמוניום סולפאט, 0.17% YNB ו- 0.087% d/o לערבב בלי לאוצין)-220 סל ד ו- 30 ° C עד OD₆₀₀ = 1.0-2.0 (2-4 x 10⁷ תאים/mL).
   הערה: צמיחת תאים של זנים מחיקה שמרים שונים היא שונה. לפקח על יתר₆₀₀ ויה ספקטרופוטומטרים.
3. כדי לחשב ערכי₆₀₀ OD, לדלל דגימות OD₆₀₀ = 0.1-0.3 (1:5 עד 1:10 דילולים) ולמדוד את יתר₆₀₀ בספקטרופוטומטר. אזכור, השתמש H₂O בתוספת הכמות המתאימה של לאוצין d/o raffionose בינונית.

לבסוף, resuspend OD₆₀₀ = 125 ב 5 מ ל מים סטריליים (5 x 10⁸ תאים/mL).

צנטריפוגה תאים ב 25 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות ב 10,000 x g תאים פעמיים עם 5 מ ל מים סטריליים, וקונטה resuspend תאים במאגר spheroplasting 50 מ ל (0.8 מ' בסורביטול, 10 מ מ טריס-HCl (pH 7.5), 10 מ מ CaCl₂, 2 מ מ dithiothreitol (DTT), האנזים lytic 200 של µg/mL).

דגירה התרבות 50 מ ל- 100 סל"ד ו- 30 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות אופציונלי: לפקח על היווצרות spheroplast כל 15 דקות על ידי מיקרוסקופ לעומת זאת שלב. תחת המיקרוסקופ, תאים צריך צבע כהה אפור שקוף. ברייט (refractile) תאים מתעכלים דיו, בעוד רוחות (אפור חיוור תאים עם קצת, אם בכלל, המבנה הפנימי) מתעכלים יתר על המידה.

בדוק spheroplast יעילות הכנה עבור כל דגימה.

1. לאחר שלב הגמר 3.5, לערבב 4 µL של התרבות spheroplasted 50 מ עם מאגר spheroplasting µL (spheroplasts⁶ × 10 כ- 2) 496, צנטריפוגה 10 דקות ב 400 x g.
2. Resuspend צנפה 10 מ ל H₂O מזוקקים, דוגמת מערבולת עבור s 30, ואת הצלחת לצאת µL 10 המדגם על צלחות d/o לאוצין של גלוקוז (2% גלוקוז, 1.5% אגר, 0.5% אמוניום סולפאט, 0.17% YNB ו- 0.087% d/o לערבב בלי לאוצין).
3. תקופת דגירה תאים של 3 ימים ב- 30 ° C. לספור את המספר הכולל של מושבות תאים בוגרים על הצלחת. להערכת נתונים, להשתמש רק דוגמאות עם יעילות גבוהה יותר 98% (מספר מושבת תאים כולל < מושבות 40/צלחת).

צנטריפוגה תאים מהשלב 3.5 400 x g ו- 4 ° C עבור תאים 10 דקות, לשטוף פעמיים עם 5 מ"ל התייצב לאוצין d/o raffinose בינוני (בסורביטול 0.8 מ', 2% raffinose, 0.5% אמוניום סולפאט, 0.17% YNB ו- 0.087% הנשירה לערבב בלי לאוצין). Resuspend תאים מ ל לאוצין מיוצב d/o raffinose בינוני (1 x 10⁸ תאים/mL) ולהשתמש ישירות התאים למדידות וזמינותו GFP כתב (סעיף 4).

4. GFP כתב Assay מדידה ב 96-ובכן צלחות

1. זרע spheroplasts תא שמרים שהושג בשלב 3.7 96-ובכן לוחות (200 µL טוב).
2. להוסיף 70 µL לאוצין מיוצב d/o בינוני raffinose המכיל בקרה שלילית (eluate של ני^{2 +}-זיקה מטוהרים תא lysate מתאי IPTG-induced e. coli לבטא את הווקטור ריק) או מטוהרים RTA ב ריכוז RTA הסופי של 5 מיקרומטר ( המתאים 160 g/L RTA) כל היטב.
3. מיד להוסיף 30 µL התייצב גלקטוז פתרון (30% גלקטוז, בסורביטול 0.8 מ') זירוז ביטוי GFP, ולאחר מכן להתחיל את המדידה.
   הערה: בצע משכפל טכנית לפחות 3 לכל ניסוי ומשוכפלת 3 ביולוגי לכל זן שמרים.
4. לאחר סיום הכנת הדוגמא (שלבים 4.1-4.3), מכניסים את הצלחת 96-ובכן קורא פלורסצנטיות ולהתחיל את המדידה. השתמש במסנן nm 475/509 להגדיר נדרש לגילוי קרינה פלואורסצנטית GFP. לבצע מדידות ב 30 מעלות צלזיוס, 120 סל ד, ועם חזק בקוטר של 1 מ מ מעל חלון זמן של 20 h (מדידה במרווחים של 10 דקות).
   הערה: ערכת מסנן GFP זמין בדרך כלל בכל מערכות הקורא. טמפרטורה, חלון זמן, מדידה, במרווחי זמן וריכוז RTA יכול להיות מותאם לצרכים שלך. נציג התוצאות מוצגות באיור4.
5. אופציונלי: השתמש בקרות פנימיות נוספות במדידה לבקרת איכות. להכין פקד שלילי על-ידי הוספת 30 µL לאוצין מיוצב d/o raffinose בינוני במקום 30% גלקטוז (אין אינדוקציה GFP). בנוסף, להוסיף µL 70 של 0.8 מ' בסורביטול התייצב G418 פתרון (300 µg/mL). החומר המדכא תרגום החלבון G418 משמש בקרה חיובית עבור עיכוב חלבונים כמו זה מונע GFP ביטוי שמרים.
6. לחשב פלורסצנטיות GFP היחסי באחוזים עבור נקודת הזמן 20 h לפי המשוואה הבאה (ראה איור 4A): איפה NC הוא הפקד שלילי
   1. לחלופין, לקבוע את פלורסצנטיות GFP היחסי עבור כל נקודה מדידה (תוך עשר דקות במקרה זה, ראה גם שלב 4.4) באמצעות המשוואה הנ ל. כפי שמוצג באיור 4B, ליצור גרף על ידי סופג עוצמות קרינה פלואורסצנטית GFP (ציר y) במשך הזמן (ציר x).

תוצאות

תהליך העבודה הכללי של הפרוטוקול המתואר בכתב יד זה מודגם באיור 1, בערך מסכם את השלבים יחיד עבור הניסוי assay עוקבות של הכתב GFP וטיהור RTA מוצלחת. תיאור מפורט יותר של כל שלב בודדים ניתן למצוא בפרוטוקול. איור 2 ממחישה את התוצאות הצפויות טיהור RTA מוצ?...

Discussion

בעת ביצוע בפרוטוקול לעיל, אנו ממליצים על ההצעות הבאות על מנת להשיג תוצאות מוצלחות של הניסוי.

ביטוי חלבון heterologous, חשוב לא תעלה על ריכוז IPTG של 1 מ מ. ריכוז IPTG > 1 מ"מ לעכב יזם-induced RTA ביטוי ולהוביל להורדת התשואות הרעלן. יתר על כן, התאים לא צריך להיות מעובד בטמפרטורה גבוהה יותר 28 ° C ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacterial and yeast strains
E. coli BL21 DE3(Gold)	Aligent Technologies	230130
S. cerevisiae BY4742	Euroscarf	Y10000
S. cerevisiae BY4742 deletion mutants	Dharmacon	YSC1054	whole collection
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids used in this protocol
pET24a(+) (Novagen)	Millipore	69772-3
pET-RTA(His6)	Becker et al. (2016)3
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Zymolyase 20T	USBio	Z1000.250	lytic enzyme for cell wall removal
LB broth medium	Thermo Scientific	10855021	15 g agar was added for plate production
YNB	Thermo Scientific	DF0335-15-9
Ammonium sulfate	Sigma-Aldrich	A4418-100G
Yeast drop-out mix supplemts without leucine	Sigma-Aldrich	Y1376-20G
Agar	Sigma-Aldrich	05040-100G
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
DTT	Sigma-Aldrich	10197777001
D-raffinose	Sigma-Aldrich	83400-25G
D-sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-1KG
D-galactose	Sigma-Aldrich	G0750-10MG
G418	Thermo Scientific	11811031
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
Imidazole	Roth	3899.1
PAGE ruler prestained	Fermentas	26616	protein ladder used for Western analysis
Name	Company	Catalog Number	Comments
Material for RTA purification, desalting and reader measurements
Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro	Amersham
Soniprep 150	MSE		old model, other models available
Fluoroskan Ascent	Thermo Scientific	5210470	old model, not available anymore
ÄKTAPurifier	Thermo Scientific	28406266	Product is discontinued and replaced
HisTRAP HP column	GE Healthcare	17-5248-02
HiTRAP desalting column	GE Healthcare	11-0003-29
Midisart sterile filter	Sartorius	16534K	0.2 µm pore size
BCA protein assay kit	Pierce	23225
660 nm assay kit	Thermo Scientific	22660
96 well plates	Thermo Scientific	260860
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies (optional)
Anti-Tetra-His	Qiagen	34670	primary antibody; 1:1,000 dilution
Anti-mouse-HRP	Sigma-Aldrich	A9044-2ML	secondary antibody, 1:10,000 dilution