Un'analisi del Reporter di fluorescenza-basata semplice per identificare i componenti cellulari necessari per tossina ricina una catena (RTA) tratta di lievito

Riepilogo

Nel manoscritto, descriviamo l'uso di un'analisi del reporter di fluorescenza basati su lievito per identificare componenti cellulari coinvolti nel traffico e uccidere i processi dei citotossici una subunità della ricina di tossina della pianta (RTA).

Abstract

Batterica e centrale un / tossine B sfruttano le naturali vie di traffico nelle cellule eucariotiche per raggiungere i loro target intracellulare nel citosol e infine uccidere. Un / tossine B consistono generalmente di un enzimaticamente attivo Asubunit (ad es., tossina ricina un (RTA)) e uno o più celle, associazione Bsubunit(s), che sono responsabili di tossina vincolante a specifici recettori di superficie di cella. La nostra attuale conoscenza di come A / B tossine sono in grado di efficientemente inebrianti cellule ha aiutate gli scienziati per comprendere i meccanismi cellulari fondamentali, come endocitosi e proteina intracellulare in cellule eucariotiche superiori. Da un punto di vista medico, allo stesso modo è importante identificare le rotte del narcotraffico tossina principali per trovare soluzioni adeguate di trattamento per i pazienti o per eventualmente sviluppare applicazioni basate su tossina terapeutiche per la terapia del cancro.

Dall'analisi del genoma della A / tossina B traffico in cellule di mammifero è complesso, lungo e costoso, parecchi studi sulla A / trasporto di tossina B sono stati effettuati nell'organismo modello lievito Saccharomyces cerevisiae. Pur essendo meno complessi, fondamentali processi cellulari in lievito e cellule eucariotiche superiori sono simile e molto spesso i risultati ottenuti in lievito possono essere trasferiti alla situazione dei mammiferi.

Qui, descriviamo un'analisi del reporter di veloce e facile da usare per analizzare il traffico intracellulare di RTA in lievito. Un vantaggio essenziale del nuovo test è la possibilità di indagare non solo RTA retrò-traslocazione dal reticolo endoplasmatico (ER) nel citosol, ma piuttosto di endocitosi e retrograda tossina trasporto dalla membrana plasmatica in ER. Il test si avvale di un plasmide del reporter che permette la misura indiretta della tossicità di RTA attraverso l'emissione di fluorescenza della proteina fluorescente verde (GFP) dopo la traduzione in vivo . Poiché RTA previene efficacemente l'inizio della biosintesi della proteina da depurinazione rRNA 28S, questo test consente l'identificazione delle proteine della cellula ospite coinvolti nel trasporto intracellulare di RTA attraverso la rilevazione dei cambiamenti nell'emissione di fluorescenza.

Introduzione

Pazienti affetti da infezioni da batteri che producono la tossina rappresentano un grave onere medico e finanziario per ogni sistema di assistenza sanitaria sociale, in particolare quanto efficaci trattamenti terapeutici sono ancora in gran parte mancante. Per sviluppare nuove strategie terapeutiche, i meccanismi complessi intossicazione della medicamente relativi A / tossine B come la tossina del colera, produttore della tossina Shiga o ricina ha bisogno di essere compresa a livello molecolare, basato sul romanzo saggi potente che devono essere implementati.

Negli ultimi anni, diversi studi ha tentato di analizzare A / trasporto di tossina B in lievito e cellule di mammifero usando metodi che richiede tempo e costosa come tossina radioattivo etichettatura^1,2 , nonché a screening basato su siRNA si avvicina a³. In alcuni casi, traffico di tossina è stata visualizzata in vivo mediante microscopia a fluorescenza dopo accoppiamento chimico e/o genetico delle subunità di tossina individuali con fluorofori, punti quantici o proteine fluorescenti^4,5. Purtroppo, tali modifiche spesso portano a inattivo e/o alterata proprietà naturali delle tossine. Un altro modo elegante per rispondere indirettamente a una vasta gamma di domande scientifiche è l'uso di sistemi reporter basato sugli enzimi come lacZ, luciferasi, o proteine fluorescenti (ad es. GFP o Discosoma sp. (proteina fluorescente rosso dsRed)).

In questo manoscritto, un semplice protocollo è descritto che identifica i componenti cellulari necessari per il trasporto intracellulare di RTA extracellularly applicata in S. cerevisiae. In tal modo, un plasmide di fluorescenza-reporter contenente un segnale N-terminale ER-importazione seguito da GFP agisce come un sensore di biosintesi della proteina, che misura indirettamente l'inibizione di traduzione di RTA-mediato della proteina GFP emissione di fluorescenza dopo in vivo traduzione⁶. Nel caso che endocitosi RTA e/o traffico intracellulare è influenzata negativamente (o positivamente) in un mutante di delezione di lievito particolare rispetto al wild type, questo può essere rilevato attraverso un aumento (o diminuzione) GFP fluorescenza emissione⁶.

Finora, tutti i metodi di analisi trasporto RTA in cellule di lievito sono stati limitati al processo retrò-traslocazione ER-a-citosol di RTA. In un sistema così artificiale, RTA contenente un segnale di importazione di ER è espresso da un promotore inducibile, risultante in un fenotipo suicida^1,7. Anche se la cella associazione subunità B della ricina similarmente è manca nel setup sperimentale descritto in questo manoscritto e, quindi, non rappresenti perfettamente la situazione naturale di ricina holotoxin intossicazione⁸, tossina trasporti dal plasma membrana attraverso l'apparato del Golgi al pronto soccorso può essere imitata molto attentamente con questa analisi Novella. Interessante, i risultati preliminari ottenuti nello studio pilota indicano che le vie di traffico utilizzate da RTA rivelano sorprendenti analogie con l'itinerario di intossicazione di ricina holotoxin.

In sintesi, il metodo descritto può essere utilizzato per determinare il ruolo specifico di proteine cellulari selezionati nell'endocitosi RTA e traffico in lievito. Inoltre, questa messa a punto sperimentale potrebbe essere facilmente adattato a altri ribosoma inattivanti tossine prodotto e secreto da diverse specie batteriche come zymocin o tossina Shiga e lievito.

Protocollo

Nota: Una panoramica del flusso di lavoro sperimentale generale è raffigurata nella Figura 1.

Attenzione: RTA è altamente tossico per gli esseri umani. È necessaria l'autorizzazione del laboratorio di sicurezza S2 (livello di biosicurezza 2 equivalente). Si prega di indossare guanti durante l'intero esperimento.

1. eterologhi di sua etichetta RTA in Escherichia coli

1. Trasformare le cellule di Escherichia coli con l'espressione del plasmide pET24-RTA_{(sua) 6} o il vettore vuoto pET24a⁽⁺⁾ utilizzando protocolli standard elettroporazione^9,10. Celle contenenti il plasmide vuoto servono come controllo negativo.
2. Dopo la selezione dei cloni positivi sulle piastre di LB (100 µ g/mL) contenenti kanamicina, inoculare le cellule contenenti il plasmide di espressione di RTA o il vettore vuoto nel mezzo di 5ml LB_kan (LB medium con 100 µ g/mL di kanamicina) e incubare a 37 ° C e 220 giri/min per 24 h.
3. Supplemento 1 L LB_kan medio con la pre-cultura 5ml e incubare le cellule a 37 ° C e 220 giri/min fino a quando le cellule hanno raggiunto un OD₆₀₀ di 0.8-1.0 (circa 3-4 h). Da allora in poi, ridurre la temperatura di cultura a 28 ° C e preparare un 1m della soluzione di riserva (IPTG) isopropilico-β-D-1-thiogalactopyranoside in H₂O.
4. Inducono l'espressione di RTA di e. coli con l'aggiunta di IPTG ad una concentrazione finale di 1 mM.
5. Dopo 3,5 h a 28 ° C e 220 giri/min, raccolto cellule mediante centrifugazione a 10.000 x g e 4 ° C per 10 minuti, lavare la pallina due volte con 5 mL di tampone di associazione (500 mM NaCl, imidazolo di 10 mM e 20 mM KH₂PO₄ pH = 7,4) a 10.000 x g e a 4 ° C per 10 min e risospendere il pellet in 5 mL di tampone di associazione.
   Nota: Il protocollo può essere sospesa in questa fase e le cellule possono essere memorizzate a 80 ° C per diversi giorni.

2. la purificazione della sua etichetta RTA tramite cromatografia di affinità

1. Sottoporre ad ultrasuoni cellule sul ghiaccio con il seguente protocollo: 15 s pulse (20 micron), 30 s pausa. Ripetere questo passaggio cinque volte.
2. Centrifugare a 21.000 x g e a 4 ° C per 15 min lysate delle cellule e filtrare il surnatante utilizzando un sistema di filtri siringa sterile (dimensione dei pori di 0,2 µm).
   Nota: Il pellet cellulare dei campioni lisati con successo mediante mostrano bordi trasparenti.
3. Utilizzare un sistema di purificazione automatizzata con 5ml Ni^{2 +}-base colonna di affinità per purificare la frazione di His-Tag RTA dalla sterile filtrata e. coli surnatante. In generale, utilizzare una velocità di eluizione di 1 mL/min e raffreddare il sistema di purificazione di tutto per prevenire la perdita di attività di tossina e associazione tossina non efficiente.
   Nota: I parametri per purificazione efficiente RTA sono elencati nella tabella 1. Vedi anche Becker et al. Per ulteriori informazioni⁹.
   1. Brevemente, equilibrare la colonna di affinità con 20 mL di buffer obbligatorio rimuovere il buffer di memoria. Applicare il surnatante filtrato sterile sulla colonna di affinità usando una siringa.
   2. Lavare la colonna con 25-35 mL di buffer di associazione per rimuovere le proteine non associate dalla colonna. Eseguire la fase di lavaggio fino a capacità di assorbimento UV a 280 nm è vicino al valore iniziale di UV.
   3. Eluire la frazione legata RTA in 20-35 mL di tampone di eluizione (imidazolo di 500 mM, 500 mM NaCl, 20 mM KH₂PO₄, pH = 7.2) e tenere il campione sul ghiaccio (Figura 2A e 2B di figura).
      Nota: Eluizione della frazione RTA è contrassegnata da un aumento nell'assorbimento di UV. Si prega di notare per raccogliere esclusivamente questa frazione per evitare la contaminazione con proteine rilegate non specifici.
   4. Utilizzare 20 µ l di campioni eluiti per eseguire Blue di Coomassie macchiatura¹¹ o Western blot analisi^12,13 (facoltativo). Utilizzare primario anti-sua anticorpi (1:1, 000) e secondario anti-mouse-IgG-HRP (01:10, 000) per rilevare RTA e verificare la purezza del campione (Figura 3).
   5. Desalificare eluiti frazione RTA su una colonna di dissalazione 5ml ed equilibrare il campione in sorbitolo di 0,8 M.
      1. Sostituire la colonna di affinità del sistema di purificazione dalla colonna dissalazione ed equilibrare in primo luogo la colonna con 20 mL di sorbitolo di 0,8 M.
      2. Applicare la frazione di RTA eluita alla colonna tramite una siringa. Lavare la colonna con 100 mL di sorbitolo 0,8 M ed eluire la frazione di RTA dissalata in una provetta da 15 mL, non appena l'assorbimento di UV inizia ad aumentare (Figura 2).
      3. Memorizzare la frazione eluita RTA a 4 ° C.
         Nota: Interrompere direttamente campionamento frazione RTA quando aumenta la conduttanza per evitare contaminazione salina. Parametri per la procedura di dissalazione sono elencati nella tabella 1.
4. Eluite frazione RTA a 10.000 x g e a 4 ° C per 30-180 min utilizzando una colonna di spin 10 kDa cut-off ad un volume finale di 1-2 mL di concentrato e conservare il campione a 4 ° C per 3-4 settimane.
   Attenzione: Non congelare il campione dal congelamento conduce ad una perdita completa di attività di RTA.
5. Calcolare la concentrazione di proteina mediante un kit di determinazione della proteina convenzionali. Concentrazione nella proteina dovrebbe essere nel range di 1-1.5 mg/mL.
   Nota: RTA tende a precipitare se la concentrazione nella proteina è troppo alta (> 5 mg/mL).

3. trasformazione e rimozione della parete cellulare del lievito

1. Trasformare mutanti di delezione di lievito wild-type o selezionato con la GFP reporter plasmide pRS315-K28_SP- GFP⁶ utilizzando standard litio acetato trasformazione metodi¹⁴. Incubare le cellule su leucina abbandono (d/o) piastre di glucosio (glucosio 2%, 1,5% agar, 0,5% di solfato di ammonio, 0,17% lievito azoto Base (YNB) e 0,087% d/o mix senza leucina) a 30 ° C per 2-3 giorni per selezione clonale positivo.
2. Scegli 3 cloni di lievito diverso da ogni piatto e inoculare i cloni in 100 mL di leucina d/o raffinosio medio (2% raffinosio, 0,5% di solfato di ammonio, 0,17% YNB e mescolare senza leucina 0,087% dallavalle) a 220 giri/min e 30 ° C a OD₆₀₀ = 1.0-2.0 (2-4 x 10⁷ cellule/mL).
   Nota: La crescita delle cellule i diverso l'eliminazione di ceppi di lievito è diverso. Monitor OD₆₀₀ tramite uno spettrofotometro.
3. Per calcolare i valori di OD₆₀₀ , diluire i campioni a OD₆₀₀ = 0.1-0.3 (1:5 a 01:10 diluizioni) e misurare OD₆₀₀ con uno spettrofotometro. Come riferimento, utilizzare H₂O completato con la corrispondente quantità di leucina d/o raffionose mezzo di.

Infine, risospendere OD₆₀₀ = 125 in 5 mL di acqua sterile (5 x 10⁸ cellule/mL).

Centrifugare le cellule a 25 ° C per 5 min a 10.000 x g, lavare le cellule due volte con 5 mL di acqua sterile e risospendere le cellule in 50 mL di tampone spheroplasting (sorbitolo 0,8 M, 10 mM Tris-HCl (pH 7.5), 10 mM CaCl₂, 2mm ditiotreitolo (DTT) e degli enzimi litici di 200 µ g/mL).

Incubare la coltura di 50 mL a 100 giri/min e 30 ° C per 90 min. facoltativo: monitorare la formazione dello spheroplast ogni 15 min da microscopia di contrasto di fase. Al microscopio, le cellule dovrebbero avere un colore grigio scuro traslucido. Cellule di Bright (refractile) sono insufficientemente digerite, mentre fantasmi (cellule grigio pallido con poco, se del caso, struttura interna) sono sovra-digerito.

Verificare l'efficacia di preparazione dello spheroplast per ciascun campione.

1. Dopo finitura passo 3.5, mescolare 4 µ l della cultura spheroplasted 50ml con 496 µ l di tampone di spheroplasting (circa 2 × 10⁶ Sferoplasti) e centrifugare per 10 min a 400 x g.
2. Risospendere il pellet in 10 mL di H₂O distillata, campione di vortice per 30 s e piastra fuori 10 µ l del campione su piastre di glucosio di d/o di leucina (2% di glucosio, agar 1,5%, 0,5% di solfato di ammonio, 0,17% YNB e 0,087% d/o mix senza leucina).
3. Incubare le cellule per 3 giorni a 30 ° C. Contare il numero totale delle colonie delle cellule coltivate sulla piastra. Per la valutazione dei dati, utilizzare solo i campioni con efficienza supera al 98% (totale numero di Colonia di cellule < 40 colonie/piastra).

Centrifugare le cellule da passo 3.5 a 400 x g e a 4 ° C per 10 min e lavare le cellule due volte con 5 mL stabilizzato leucina d/o raffinosio medio (0,8 M sorbitolo, raffinosio 2%, 0,5% di solfato di ammonio, 0,17% YNB e 0,087% drop-out mix senza leucina). Risospendere le cellule in 5ml stabilizzato leucina d/o raffinosio medium (1 x 10⁸ cellule/mL) e utilizzare direttamente le cellule per le misurazioni di dosaggio di reporter GFP (sezione 4).

4. GFP Reporter Assay misura in piastre da 96 pozzetti

1. Seme fuori gli sferoplasti di cellule di lievito ottenute al passaggio 3,7 in piastre da 96 pozzetti (200 µ l/pozzetto).
2. Aggiungere 70 µ l leucina stabilizzato d/o raffinosio terreno contenente il controllo negativo (eluato di una Ni^{2 +}-affinità purificato lysate delle cellule dalle cellule di IPTG-indotta e. coli che esprimono il vettore vuoto) o purificata RTA a una concentrazione finale di RTA di 5 µM ( corrispondenti a 160 g/L RTA) in ciascun pozzetto.
3. Immediatamente aggiungere 30 µ l stabilizzato galattosio soluzione (30% galattosio, sorbitolo 0,8 M) per indurre l'espressione di GFP e successivamente avviare la misurazione.
   Nota: Eseguire la tecniche almeno 3 ripetizioni per esperimento e 3 biologici replica al ceppo di lievito.
4. Dopo aver completato la preparazione del campione (punti 4.1-4.3), mettere la piastra a 96 pozzetti in un lettore di fluorescenza e avvia la misurazione. Utilizzare il 475/509 nm set di filtri necessari per la rilevazione della fluorescenza di GFP. Eseguire misurazioni a 30 ° C, 120 giri/min e con un diametro d'agitazione di 1 mm sopra una finestra di tempo di 20 h (gli intervalli di 10 min di misurazione).
   Nota: Il set di filtri GFP è normalmente disponibile in tutti i sistemi di lettore. Temperatura, intervallo di tempo, misurare intervalli e RTA concentrazione può essere regolata per le proprie esigenze. Risultati rappresentativi sono mostrati in Figura 4.
5. Facoltativo: Utilizzare ulteriori controlli interni nella misura per il controllo qualità. Preparare un controllo negativo aggiungendo 30 µ l leucina stabilizzato d/o raffinosio medium invece 30% galattosio (nessuna induzione di GFP). Inoltre, aggiungere 70 µ l di soluzione di 0,8 M sorbitolo stabilizzato G418 (300 µ g/mL). L'inibitore di traduzione proteica G418 serve come controllo positivo per l'inibizione della proteina impedisce espressione di GFP in lievito.
6. Calcolare in per cento per il punto di tempo di 20 h secondo la seguente equazione relativa fluorescenza GFP (Vedi Figura 4A): dove NC è il controllo negativo
   1. In alternativa, determinare la fluorescenza di GFP relativa per ciascun punto di misura (in questo caso 10 min, vedi anche punto 4.4) utilizzando l'equazione di cui sopra. Come mostrato in Figura 4B, è possibile creare un grafico di macchiare le intensità di fluorescenza di GFP (asse y) nel corso del tempo (asse x).

Risultati

Il flusso di lavoro generale del protocollo descritto in questo manoscritto è illustrata nella Figura 1, approssimativamente che riassume i singoli passaggi per successo RTA purificazione e il successivo esperimento di analisi del reporter GFP. Una descrizione più dettagliata di ogni singolo passaggio può essere trovata nel protocollo. La figura 2 illustra il risultato previsto di una purificazione di RTA successo da cromatogr...

Discussione

Quando si esegue il protocollo di cui sopra, si consiglia i seguenti suggerimenti per ottenere un risultato di successo dell'esperimento.

Per l'espressione della proteina eterologa, è importante non superare la concentrazione di IPTG di 1 mM. Concentrazioni di IPTG > 1 mM inibire indotta da promotore espressione di RTA e piombo per abbassare i rendimenti di tossina. Inoltre, le cellule non vanno coltivate a temperature superiori a 28 ° C per impedire la formazione del corpo di inclusione...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bacterial and yeast strains
E. coli BL21 DE3(Gold)	Aligent Technologies	230130
S. cerevisiae BY4742	Euroscarf	Y10000
S. cerevisiae BY4742 deletion mutants	Dharmacon	YSC1054	whole collection
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids used in this protocol
pET24a(+) (Novagen)	Millipore	69772-3
pET-RTA(His6)	Becker et al. (2016)3
Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents
Zymolyase 20T	USBio	Z1000.250	lytic enzyme for cell wall removal
LB broth medium	Thermo Scientific	10855021	15 g agar was added for plate production
YNB	Thermo Scientific	DF0335-15-9
Ammonium sulfate	Sigma-Aldrich	A4418-100G
Yeast drop-out mix supplemts without leucine	Sigma-Aldrich	Y1376-20G
Agar	Sigma-Aldrich	05040-100G
D-glucose	Sigma-Aldrich	G8270-100G
DTT	Sigma-Aldrich	10197777001
D-raffinose	Sigma-Aldrich	83400-25G
D-sorbitol	Sigma-Aldrich	S1876-1KG
D-galactose	Sigma-Aldrich	G0750-10MG
G418	Thermo Scientific	11811031
IPTG	Sigma-Aldrich	I6758-1G
Imidazole	Roth	3899.1
PAGE ruler prestained	Fermentas	26616	protein ladder used for Western analysis
Name	Company	Catalog Number	Comments
Material for RTA purification, desalting and reader measurements
Spectrophotometer Ultrospec 2100 pro	Amersham
Soniprep 150	MSE		old model, other models available
Fluoroskan Ascent	Thermo Scientific	5210470	old model, not available anymore
ÄKTAPurifier	Thermo Scientific	28406266	Product is discontinued and replaced
HisTRAP HP column	GE Healthcare	17-5248-02
HiTRAP desalting column	GE Healthcare	11-0003-29
Midisart sterile filter	Sartorius	16534K	0.2 µm pore size
BCA protein assay kit	Pierce	23225
660 nm assay kit	Thermo Scientific	22660
96 well plates	Thermo Scientific	260860
Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibodies (optional)
Anti-Tetra-His	Qiagen	34670	primary antibody; 1:1,000 dilution
Anti-mouse-HRP	Sigma-Aldrich	A9044-2ML	secondary antibody, 1:10,000 dilution